一种树枝大分子—共聚物细胞捕获材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物大分子分离分析技术领域，具体涉及为一种树枝大分子一共聚物细胞捕获材料及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]近年来对于肿瘤细胞分离的研究受到了极大地关注。研究表明，不同种类的肿瘤细胞可以被用作预测标志物，而对它们的检测可以反映出实体肿瘤的转移、复发和进展，有利于肿瘤的及时发现、及早诊断和有效治疗，因此发展出高效率、高灵敏度的方法分离肿瘤细胞就成为关键步骤，为其后续检测提供了无限可能。
[0003]随着人们对肿瘤细胞分离研究的不断深入，涌现出了种类繁多的新技术用于捕获和检测肿瘤细胞。根据分离机理的不同，这些新技术新方法可以分为物理分离和生物亲和分离:物理分离法富集肿瘤细胞主要利用的是肿瘤细胞的尺寸、密度和变形性不同于正常血细胞，这种方法简单便捷，但是特异性和灵敏度均较差，限制了其实际应用；生物亲和分离法富集肿瘤细胞则是通过引入抗体、适配体等可与细胞膜表面特异性作用的生物分子来实现，此方法效率高、特异性强、对细胞损伤小，更具有实际应用价值。一般生物亲和法以微流控芯片或者功能化材料为基底，微流控芯片分离效率高但耗时长、细胞损伤大;功能化材料有免疫磁珠、纳米阵列材料、仿生材料等，可高效快速捕获肿瘤细胞，是近年来研究的热点。
[0004]为达到高效分离肿瘤细胞和保持细胞活性的目的，本发明设计并制备了一种氨基苯硼酸修饰的树枝状大分子一共聚物细胞捕获材料，降低了材料的非特异性吸附和毒性，提高了材料的亲水性和修饰性，同时胶体材料和液体易于分离，无需离心操作，可高效捕获细胞，捕获后的细胞活性无明显损伤。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种材料的非特异性吸附和毒性低，亲水性和修饰性好的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料及其制备方法和应用。
[0006]本发明提供的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料，所述共聚物为丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯共聚物，树枝状大分子通过碳二亚胺交联法修饰于共聚物表面，再通过戊二醛交联法将3-氨基苯硼酸和树枝状大分子偶联得到。其中，作为基底的丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯共聚物具有网状结构。本发明材料通过共聚物的三维网状结构增加了材料和细胞的接触几率，有利于提高捕获效率;树枝状分子含128个伯氨基，可大大增强苯硼酸得修饰量，为高效捕获奠定基础，同时树枝大分子也是亲水分子，保持了材料的超亲水性;苯硼酸用于和肿瘤细胞膜表面过表达的唾液酸结合，将目标细胞成功分离;材料的超亲水性和共聚物的低毒性使得捕获后的细胞活性高度保持。
[0007]本发明提出的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料的制备方法，具体步骤如下:
(I)共聚物基底的合成:将丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，PEG-6000按照质量比为1: 1: 1.5至I: 1:2的比例溶于PBS溶液中；向96孔板每孔加入述溶液50 yL，以及甲基丙烯酸甲酯0.5-5.0 yL，四甲基乙二胺0.4-1.0 yL，10%过硫酸铵溶液2.0-5.0 yL,30-60 °C温度下震荡反应0.5-2.0 h，得到乳白色胶状固体，用PBS溶液洗净；
(2)树枝状大分子的修饰:将由步骤(I)制备的共聚物基底材料用紫外线照射10-20min，再用PBS清洗，向材料中加入质量比为1:1至1:2的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的PBS溶液，活化0.5-1.0 h;然后加入0.5-10.0μL的PAMAM树枝状大分子(乙二胺核)，30-37°C反应2-6 h，用PBS洗净；
(3)3-氨基苯硼酸的修饰:采用戊二醛交联法将氨基苯硼酸修饰在树枝状分子上，先用5%戊二醛的I3BS溶液，活化修饰了树枝大分子的共聚物基底2-3 h，用I3BS清洗后，加入浓度为2.0 mg/mL-20.0 mg/mL的氨基苯硼酸溶液，30_37°C偶联3-6 h，然后用含1%氰基硼氢化钠的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用I3BS洗净，即得到苯硼酸修饰的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料。
[0008]本发明制备的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料可用于可高效捕获细胞(人神经胶质瘤细胞U251)，捕获后的细胞活性无明显损伤。
[0009]细胞捕获的操作步骤为:向含氨基苯硼酸修饰的树枝大分子一共聚物材料的96孔板中加入100 yL人神经胶质瘤细胞U251悬浮液，细胞密度为105-106，在培养箱(37°C，5%CO2)孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，计算细胞的捕获效率。向捕获后的细胞加入10 yg/mL的DAPI染料，室温染色15 min后洗净，用荧光显微镜观察。为验证材料的高效性，设计实验分别用未经修饰的共聚物材料、未经树枝大分子偶联直接修饰氨基苯硼酸的共聚物材料和经树枝大分子偶联的氨基苯硼酸修饰的共聚物材料进行细胞捕获实验，结果表明树枝大分子偶联的氨基苯硼酸共聚物材料具有最优的捕获效率，可高达87±5%。
[0010]细胞活性实验:向捕获细胞后的材料按I: I投料比加入吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染料，室温染色15 min后洗净，显微镜观察，活细胞呈现黄绿色，死细胞为红色，结果表明捕获后的细胞活性接近100%。
[0011]通过上述步骤成功实现了树枝大分子一共聚物细胞捕获材料的制备及应用，材料的进一步表征通过扫描电子显微镜(SEM)、元素分析(EDS)、紫外吸收光谱(UV)和荧光图像说明。
【附图说明】
[0012]图1树枝大分子一共聚物细胞捕获材料的制备及应用流程图。
[0013]图2材料捕获细胞前后的SEM图像。
[0014]图3氨基苯硼酸修饰的树枝大分子一共聚物材料的元素分析。
[0015]图4树枝大分子偶联前后吸光度对比图。
[0016]图5经树枝大分子偶联的氨基苯硼酸修饰的共聚物材料、未经树枝大分子偶联直接修饰氨基苯硼酸的共聚物材料和未经修饰的共聚物材料捕获效率荧光对比图。
[0017]图6细胞活性荧光图像。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:氨基苯硼酸为“诱馆”的三维网状结构的超亲水树枝分子一共聚物细胞捕获材料的合成
将丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，PEG-6000按照质量比为I:1:1.5溶于PBS溶液中，向96孔板每孔加入述溶液50 yL，甲基丙烯酸甲酯0.5-5.0 yL，四甲基乙二胺0.6 yL，10%过硫酸铵溶液2.5 yL，50 °C，震荡反应I h，得到乳白色胶状固体，用PBS溶液洗净。共聚物基底材料经紫外线照射10 min，再用PBS清洗，向材料中加入质量比为1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的I3BS溶液，活化0.5 h后，加入0.5-10.0yL的PAMAM树枝状大分子(乙二胺核)，37°C反应2-6 h，用I3BS洗净。采用戊二醛交联法将氨基苯硼酸修饰在树枝状分子上，先用5%戊二醛的PBS溶液，活化修饰了树枝大分子的共聚物基底2-3 h，用PBS清洗后，加入浓度为2.0 mg/mL-20.0 mg/mL的氨基苯硼酸溶液，37°C偶联4 h后，用含1%氰基硼氢化钠的PBS溶液封端I h，最后用PBS洗净，得到氨基苯硼酸为“诱馆”的三维网状结构的超亲水树枝分子一共聚物细胞捕获材料。
[0019]实施例2:三维网状结构的超亲水树枝分子一共聚物材料在捕获人神经胶质瘤细胞U251中的应用
向含氨基苯硼酸修饰的树枝大分子一共聚物材料的96孔板中加入100 yL人神经胶质瘤细胞U251悬浮液，细胞密度为105-106，在培养箱(37°C，5% CO2)孵育5_90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，计算细胞的捕获效率。向捕获后的细胞加入10 yg/mL的DAPI染料，室温染色15 min后洗净，用荧光显微镜观察。
【主权项】
1.一种树枝大分子一共聚物细胞捕获材料，其特征在于:所述共聚物为丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯共聚物，树枝状大分子通过碳二亚胺交联法修饰于共聚物表面，再通过戊二醛交联法将3-氨基苯硼酸和树枝状大分子偶联得到。2.如权利要求1所述的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料的制备方法，其特征在于，具体步骤为: (1)共聚物基底的合成:将丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、PEG-6000按照质量比为1:1:(1.5-2)的比例溶于PBS溶液中；向96孔板每孔加入述溶液50 yL，以及甲基丙烯酸甲酯0.5-5.0 μL，四甲基乙二胺0.4-1.0 yL，10%过硫酸铵溶液2.0-5.0 yL，在30-60 °(3温度下震荡反应0.5-2.0 h，得到乳白色胶状固体，用PBS溶液洗净； (2)树枝状大分子的修饰:将由步骤(I)制备的共聚物基底材料用紫外线照射10-20min，再用PBS清洗，向材料中加入质量比为1:(1-2)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的PBS溶液，活化0.5-1.0 h;然后加入0.5-10.0yL的PAMAM树枝状大分子，30-37°C反应2-6 h，用PBS洗净； (3)3-氨基苯硼酸的修饰:采用戊二醛交联法将氨基苯硼酸修饰在树枝状分子上，先用5%戊二醛的I3BS溶液，活化修饰了树枝大分子的共聚物基底2-3 h，用I3BS清洗后，加入浓度为2.0 mg/mL-20.0 mg/mL的氨基苯硼酸溶液，30_37°C偶联3-6 h，然后用含1%氰基硼氢化钠的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用I3BS洗净，即得到苯硼酸修饰的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料。3.如权利要求1所述的树枝大分子一共聚物细胞捕获材料在捕获人神经胶质瘤细胞U251中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于细胞捕获的操作步骤为:向含氨基苯硼酸修饰的树枝大分子一共聚物材料的96孔板中加入100 yL人神经胶质瘤细胞U251悬浮液，细胞密度为105-106，在培养箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，计算细胞的捕获效率；向捕获后的细胞加入10 yg/mL的DAPI染料，室温染色15 min后洗净，用荧光显微镜观察。
【专利摘要】本发明属于生物大分子分离分析技术领域，具体为一种树枝大分子—共聚物细胞捕获材料及其制备方法和应用。本发明首先合成丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯的共聚物基底，再为基底修饰上聚酰胺-胺型树枝状高分子，最后利用树枝状分子偶联苯硼酸，从而得到可用于细胞捕获的功能化材料。实验表明，由于共聚物基底的三维网状结构和树枝状分子可增加苯硼酸修饰量，这种功能化材料可以在45分钟内捕获87±5%的细胞；并且由于共聚物基底和树枝状分子均为超亲水化合物，捕获的细胞保持高度活性。本发明利用无模板，低成本，低毒性材料，将其应用于细胞捕获，新颖便捷，实用高效，稳定性高，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N5/09, C08G81/02
【公开号】CN105504301
【申请号】CN201510882965
【发明人】高明霞, 张祥民, 张珮明
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月7日