一种免增菌的李斯特菌培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及检验微生物培养领域，具体设及一种免增菌的单增李斯特菌培养基。
【背景技术】
[0002] 李斯特菌(也称李氏杆菌)为革兰氏阳性短杆菌，目前国际上公认的李斯特菌共有 屯个菌株，其中单增李斯特菌化.mono^tohenes，LM)是唯一能引起人类疾病的。LM是一种 人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和 单核细胞增多。LM为兼性厌氧、无芽胞，一般不形成芙膜，但在营养丰富的环境中可形成芙 膜。LM培养最适培养溫度为35--37°C，在抑弱碱性(PH9.6)、氧分压低、二氧化碳张力高的条 件下该菌生长良好。
[0003] 虽然LM的营养要求不高，但由于LM的兼性厌氧和苛养性质，如样本中混有杂菌，且 抑中性、常规空气条件下培养时，则会发生因需氧杂菌生长过快而很快覆盖了培养基，单增 李斯特菌无法生长，结果延误诊疗时间。除此之外，LM在pH中性、常规空气状态下培养时，其 生长速度较慢，一般要48~7化才会有阳性菌落生长，脈液或者粪便样品则往往还要样品先 转种于增菌培养液(EB)中培养2地，然后取增菌液划线接种培养4她，方能有阳性菌落生长。 由于上述苛养性质，导致临床对于疑似LM要求保留样本7d，W防止漏诊。但上述时间（7化） 限制了 LM培养结果在临床诊断上的应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的技术任务是针对W上现有技术的不足，提供一种配制简单、检出率高、免 增菌的单增李斯特菌培养基。
[0005] 本发明解决其技术问题的技术方案是:一种免增菌的李斯特菌培养基，其特征为， 每1L培养基原料中含有蛋白腺6~lOg;牛肉膏3~6g;酵母浸膏2~5g;玉米淀粉2~3g，琼脂 10~12g;氯化钢5~5.5g;憐酸二氨钢1~3g;多粘菌素0.001~0.005g;杆菌肤0.001~ 0.003g;葡萄糖酸锋0.01~0.02g; 丫 -径基精氨酸0.05~0.1 g;无菌抗凝羊血20~30g;余量为 灭菌去离子水。
[0006] 上述培养基的制备方法为:称取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化 钢、憐酸二氨钢，混匀后去离子水溶解，210°C灭菌15min，冷却到45°C，加入灭菌多粘菌素； 灭菌杆菌肤;灭菌葡萄糖酸锋;灭菌γ -径基精氨酸;无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容 到1L后分装。
[0007] 本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、单增李斯特菌分离率高的特点。配方特 点如下： 1、基础培养基:所述的牛肉膏、蛋白腺、玉米淀粉提供碳源、氮源，酵母浸膏富含蛋白 质、氨基酸、多肤、核巧酸、维生素、生长因子、微量元素等营养成分，为单增李斯特菌的繁殖 和生长提供均衡的营养元素;氯化钢维持均衡的渗透压;琼脂为培养基的凝固剂;憐酸二氨 钢为缓冲剂;无菌抗凝羊血提供能量环境； 2、 抑菌剂:多粘菌素抑制革兰氏阴性菌的生长;杆菌肤(Bacitracin),实验室研究表明 杆菌肤可W抑制革兰阳性和阴性球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌等杂 菌的生长，但该浓度下由于对李斯特菌属无抗菌抑菌作用，因此提高了 LM的分离率； 3、 生长因子:通过实验将同一 LM菌株接种到2个MMA培养基上，其中一个MMA培养基添加 0.01%灭菌光谷甘肤，于37°C、PH7.0、空气气氛下培养，48小时后观察菌株，发现添加光谷甘 肤的MMA培养基有小的疑似菌落，鉴定后为LM，没有添加光谷甘肤的MMA培养基未发现LM疑 似菌落，其原因可能在于光谷甘肤可W降低氧化还原电势，有利于细胞生长、分化； 4、 特殊营养剂：葡萄糖酸锋为营养剂，发明人发现，在培养基中加入一定浓度的锋离 子，目标菌LM的生长状态好于对照组，因此推论锋离子有助于该菌的生长;而丫 -径基精氨 酸为激活剂，可W促进单增李斯特菌对矿物质的摄取。
【具体实施方式】
[0008] W下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0009] 实施例1，每1L培养基原料中含有:蛋白腺6g;牛肉膏6g;酵母浸膏2g;玉米淀粉3g， 琼脂lOg;氯化钢5g;憐酸二氨钢3g;多粘菌素0.00 Ig;杆菌肤0.003g;光谷甘肤0.5g;无菌抗 凝羊血20g;余量为灭菌去离子水。上述培养基的制备方法为:称取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸 膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钢、憐酸二氨钢，混匀后去离子水溶解，210°C灭菌15min，冷却到45 °C，加入灭菌多粘菌素;灭菌杆菌肤;灭菌光谷甘肤;无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容 到1L后分装。
[0010] 实施例2,每1L培养基原料中含有:蛋白腺8g;牛肉膏4g;酵母浸膏3g;玉米淀粉2g， 琼脂1 Ig;氯化钢5.5g;憐酸二氨钢Ig;多粘菌素0.003g;杆菌肤0.002g;葡萄糖酸锋0.02g; 丫 -?基精氨酸0.1 g;无菌抗凝羊血25g;余量为灭菌去离子水。上述培养基的制备方法为： 称取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钢、憐酸二氨钢，混匀后去离子水溶 解，210°C灭菌15min，冷却到45°C，加入灭菌多粘菌素;灭菌杆菌肤;灭菌葡萄糖酸锋;灭菌 丫-径基精氨酸;无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容到1L后分装。
[0011] 实施例3,每1L培养基原料中含有：蛋白腺lOg;牛肉膏3g;酵母浸膏5g;玉米淀粉 2g，琼脂12g;氯化钢5g;憐酸二氨钢2g;多粘菌素0.005g;杆菌肤0.0 Olg;光谷甘肤0.1 g;葡 萄糖酸锋O.Olg; 丫 -径基精氨酸〇.〇5g;无菌抗凝羊血30g;余量为灭菌去离子水。上述培养 基的制备方法为:称取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钢、憐酸二氨钢，混 匀后去离子水溶解，210°C灭菌15min，冷却到45°C，加入灭菌多粘菌素;灭菌杆菌肤;灭菌光 谷甘肤;灭菌葡萄糖酸锋;灭菌丫 -径基精氨酸;无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容到1L 后分装。
[0012] 本发明所得单增李斯特菌培养基具有检出可靠、单增李斯特菌分离率高的特点， 为临床资料充分证明，有关资料如下。
[001引 1对象与方法。
[0014] 1.1培养基制备:实验组共设I、II、IIΙΞ个实验组，分别使用实施例1、实施例2、 实施例3所得培养基，对照组为李氏菌选择性培养基(MMA)，其成分(g/L):膜蛋白腺5.0;多 价腺5.0;牛肉浸粉3.0;葡萄糖1.0;氯化钢5.0;憐酸氨二钢1.0;甘氨酸10.0;氯化裡0.5;苯 乙醇2.5;琼脂15.0;蒸馈水定容为1L，分装倾入无菌平皿备用。
[0015] 1.2菌株来源及菌悬液的制备:LM标准菌株由市疾控中屯、菌种保藏室提供，常规 复苏增菌分纯后制成100 CFU/ml的LM菌悬液。
[0016] 1.3粪便样本处理:取20份粪便样本悬浮液2ml，分别加入LM菌悬液2ml，混匀。
[0017] 1.4接种及培养:分别取LM菌悬液和处理后的粪便样本，各自用接种环分区划线 接种于实验I组、实验II组、实验III组和对照组培养基。35°C下，大气环境保溫培养，观察菌 落生长特征，分别于4她和96h，挑取细小菌落进行涂片，革兰氏染色，显微镜镜检及氧化氨 酶实验，行菌属鉴定及巧光定量PCR检测。其中菌属鉴定阳性判断标准依从《临床微生物学 诊断与图解》。
[001引2结果： 2.1 LM菌悬液培养结果比较:培养4她及96h阳性检出情况见下表，
上述结果可W看出，培养4她后，各实验组与对照组阳性检出率比较均具有明显差异(P <0.05)，而96h时，各组间阳性检出率差异无统计学意义(P〉0.05)。
[0019] 2.2 LM菌悬液处理后的粪便样本培养结果比较:培养4她及9加阳性检出情况见下 表，
' 上述结果可W看出，混有杂菌的?Μ样本，培养4她后，各实验组与对照组阳性检出率比I 较均具有极其显著的差异(Ρ<〇.01)，9化时，各实验组阳性检出率高于对照组，但差异无统 计学意义(Ρ〉〇.〇5)。
[0020] 3.结论:本发明的培养基无需额外增菌，也能够在4她的时间点得到高效的阳性检 出率，提高大气培养环境下早期阳性分离率，从而缩短确诊时间。尤其是对于粪便等含有杂 菌的样本，可W缓解杂菌对于单增李斯特菌阳性生长的不良影响，增加分离率。
【主权项】
1. 一种免增菌的李斯特菌培养基，其特征在于，每1L培养基原料中含有蛋白胨6~log; 牛肉膏3~6g;酵母浸膏2~5g;玉米淀粉2~3g，琼脂10~12g;氯化钠5~5.5g;磷酸二氢钠1 ~3g;多粘菌素0.001~0.005g;杆菌肽0.001~0.003g;;葡萄糖酸锌0.01~0.02g; γ -羟基 精氨酸〇. 05~0. lg;无菌抗凝羊血20~30g;余量为灭菌去离子水。
【专利摘要】本发明公开了一种免增菌的李斯特菌培养基，属于检验微生物培养领域，每1L培养基原料中含有蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钠、磷酸二氢钠、多粘菌素、杆菌肽、葡萄糖酸锌、γ-羟基精氨酸、无菌抗凝羊血、灭菌去离子水。本发明与现有技术相比较，具有早期阳性分离率高的特点。
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20
【公开号】CN105505838
【申请号】CN201610080035
【发明人】李志友, 孙丽华
【申请人】李志友
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月5日