一种动物肌卫星细胞的分离培养技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离技术，具体涉及一种动物肌卫星细胞的分离培养技术，属于细胞生物学、组织工程学交叉学科技术领域。
【背景技术】
[0002]动物肌卫星细胞(skeleton satellite cell，SCC)是目前公认的动物肌干细胞，是位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。1961年，Mauro描述了一个与青蛙肌纤维细胞边缘紧密相连的细胞，并根据其位置命名为卫星细胞，它们在一般情况下是处于静息状态的，当被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。负责动物肌生长和损伤修复。2008年，Nature杂志刊登由美国斯坦福大学医学院的Sacco等人的研究结果:研究小组通过利用克隆分析证实卫星细胞的确是干细胞、能够自我更新，从而澄清了相关问题。他们将一个表达荧光素酶的卫星细胞移植进了小鼠的肌肉中，发现它能够大量增殖，有助于肌肉纤维的形成，而且可以被再次移植。若该干细胞治疗应用技术得以突破，必定会为人类动物肌损伤修复在临床康复治疗带来了新的希望。
[0003]目前，动物肌细胞移植技术还处于基础研究阶段，使得体外分离培养人动物肌卫星细胞在动物肌损伤后的治疗和康复领域具有很重要的临床和现实意义。因此，人体动物肌卫星细胞体外分离培养方法能够为动物肌细胞移植技术提供丰富的研究材料，能够为动物肌伤病的动物带来治疗康复的新希望。
【发明内容】
[0004]本发明目的提供一种动物肌卫星细胞的分离培养技术的。
[0005]步骤一:细胞培养方法
[0006]大鼠1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)成功后，无菌条件下取出前肢三头肌，随即用D-Hank’s液冲洗3遍，采用酶消化法分离培养(在Johnson报道的方法基础上作了进一步改进)。
[0007](I)解破镜下尽可能地剔除脂肪、血管等结缔组织，冲洗2次后，将肌组织块剪碎(以不大于1_3为宜)，然后移入离心管中，用D-Hank’s液反复吹打3次，每次静置Imin后，均将上层液及其中的漂浮组织出去；加入0.1%胶原酶37°C消化30min后，1500转/分离心Imin，去上清;再用0.25%胰蛋白酶37°C消化Ih之后(其间吹打数次)，加入含10%胎牛血清的培养基中止，反复吹打，1500转/分离心Imin后上清液一次滤过100目、200目、400目不锈钢滤网，重复中止吹打过程4次，滤液收集后1000转/分离心1min，去上清，细胞团块用10 %胎牛血清培养基重悬。
[0008](2)细胞的纯化、培养
[0009]为减少成纤维细胞的污染，将含细胞的培养液行双30分钟差速贴壁法纯化，8卩:将盛有含细胞培养液的培养瓶置于C02孵箱中，30分钟后翻转培养瓶，继续孵育30分钟，而后吸取瓶内液体行台盼兰染色计数，以不低于105/ml细胞密度种植于已涂0.01%多聚赖氨酸的培养瓶中，入37°CC02二氧化碳孵箱中培养，以含10 %胎牛血清DMEM/F12培养，每日换液一次。
[0010]步骤二:形态学观察
[0011]每天换液后，在倒置显微镜下观察细胞生长形态变化，分化融合、肌管形成时间及形态特征，记录、照相O
【具体实施方式】
[0012]步骤一:细胞培养方法
[0013]大鼠1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)成功后，无菌条件下取出前肢三头肌，随即用D-Hank’s液冲洗3遍，采用酶消化法分离培养(在Johnson报道的方法基础上作了进一步改进)。
[0014](I)解破镜下尽可能地剔除脂肪、血管等结缔组织，冲洗2次后，将肌组织块剪碎(以不大于1_3为宜)，然后移入离心管中，用D-Hank’s液反复吹打3次，每次静置Imin后，均将上层液及其中的漂浮组织出去；加入0.1%胶原酶37°C消化30min后，1500转/分离心Imin，去上清;再用0.25%胰蛋白酶37°C消化Ih之后(其间吹打数次)，加入含10%胎牛血清的培养基中止，反复吹打，1500转/分离心Imin后上清液一次滤过100目、200目、400目不锈钢滤网，重复中止吹打过程4次，滤液收集后1000转/分离心1min，去上清，细胞团块用10 %胎牛血清培养基重悬。
[0015](2)细胞的纯化、培养
[0016]为减少成纤维细胞的污染，将含细胞的培养液行双30分钟差速贴壁法纯化，8卩:将盛有含细胞培养液的培养瓶置于C02孵箱中，30分钟后翻转培养瓶，继续孵育30分钟，而后吸取瓶内液体行台盼兰染色计数，以不低于105/ml细胞密度种植于已涂0.01%多聚赖氨酸的培养瓶中，入37°CC02二氧化碳孵箱中培养，以含10 %胎牛血清DMEM/F12培养，每日换液一次。
[0017]步骤二:形态学观察
[0018]每天换液后，在倒置显微镜下观察细胞生长形态变化，分化融合、肌管形成时间及形态特征，记录、照相O
[0019]需要说明的是，本发明为一种循环式水处理回收再利用设备，具有双酶消化，分步离心，多目过滤，双面贴壁，等好处，操作简便，培养纯度高。
[0020]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种动物肌卫星细胞的分离培养技术，具体步骤如下: 步骤一:细胞培养方法 大鼠1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)成功后，无菌条件下取出前肢三头肌，随即用D-Hank’ s液冲洗3遍，采用酶消化法分离培养(在Johnson报道的方法基础上作了进一步改进)。 (1)解破镜下尽可能地剔除脂肪、血管等结缔组织，冲洗2次后，将肌组织块剪碎(以不大于lmm3为宜)，然后移入离心管中，用D-Hank’ s液反复吹打3次，每次静置Imin后，均将上层液及其中的漂浮组织出去；加入0.1%胶原酶37°C消化30min后，1500转/分离心lmin，去上清;再用0.25 %胰蛋白酶37°C消化Ih之后(其间吹打数次)，加入含10%胎牛血清的培养基中止，反复吹打，1500转/分离心Imin后上清液一次滤过100目、200目、400目不锈钢滤网，重复中止吹打过程4次，滤液收集后1000转/分离心lOmin，去上清，细胞团块用10%胎牛血清培养基重悬。 (2)细胞的纯化、培养 为减少成纤维细胞的污染，将含细胞的培养液行双30分钟差速贴壁法纯化，S卩:将盛有含细胞培养液的培养瓶置于C02孵箱中，30分钟后翻转培养瓶，继续孵育30分钟，而后吸取瓶内液体行台盼兰染色计数，以不低于105/ml细胞密度种植于已涂0.01%多聚赖氨酸的培养瓶中，入37°CC02二氧化碳孵箱中培养，以含10%胎牛血清DMEM/F12培养，每日换液一次。 步骤二:形态学观察 每天换液后，在倒置显微镜下观察细胞生长形态变化，分化融合、肌管形成时间及形态特征，记录、照相。
【专利摘要】本发明属于细胞生物学、组织工程学交叉学科技术领域且公开了一种动物肌卫星细胞的分离培养技术，大鼠1％戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)成功后，无菌条件下取出前肢三头肌，随即用D-Hank’s液冲洗3遍，采用酶消化法分离培养。该发明具有双酶消化，分步离心，多目过滤，双面贴壁，等好处，操作简便，培养纯度高。
【IPC分类】C12N5/077
【公开号】CN105505861
【申请号】CN201510997218
【发明人】邬江, 陈旭升, 孙晓静
【申请人】邬江, 陈旭升, 孙晓娟
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月29日