一种引物对及其在俄罗斯天牛幼虫鉴定中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天牛科幼虫分类鉴定领域，具体涉及一种引物对及其在俄罗斯天牛幼 虫鉴定中的应用。
【背景技术】
[0002] 天牛幼虫的分类研究主要集中在个体形态学领域，但由于幼虫分离鉴定资料极其 缺乏，许多种类的幼虫形态迄今尚未描述；不同地理分布的同种天牛幼虫，形态有一定差 异；亲缘关系较近的种类，形态非常相似，鉴定时容易混淆。因此，随着分子生物学的发展， 核酸序列分析（DNA sequenceanalysis)被越来越多地用于天牛幼虫的分子鉴定，在出入境 检验检疫工作中具有重要意义。
[0003] 线粒体DNA (mtDNA)分子量较小，遵循母系遗传，进化速率快，是分子分类学重要 的标记之一。其细胞色素氧化酶I、II (C0I、C0 II )在近缘种及种下阶元的分类鉴定以及 不同地理种群的遗传变异中应用较广。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种引物对。本发明所要 解决的第二个技术问题是提供所述的引物对在俄罗斯天牛幼虫鉴定中的应用。
[0005] 技术方案：为实现上述目的，本发明的提供的一种引物对，所述引物对的核苷酸序 列如 SEQ ID N0 :3 和 SEQ ID N0 :4。
[0006] 上游引物 J1718 :5, -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' 下游引物 N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3' ； 所述的引物对在俄罗斯天牛幼虫鉴定中的应用。
[0007] 所述的应用，将所述的引物对用于制备俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒。
[0008] 所述用于俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒，包括： 1) 预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID N0:3的上游引物15yL，核苷酸序列如SEQ ID N0:4 的下游引物 15yL，含有 Mg2 +的 10XPCR Buffer 75yL，2.5 mmol/L 的 dNTPs 60 μ 1，T^DNA 聚合酶 6 μ 1，ddH20 200 μ L 组成； 2) 阴性对照：非俄罗斯天牛幼虫cDNA模板30 μ L ; 3) 阳性对照：俄罗斯天牛幼虫cDNA模板30 μ L。
[0009] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明获得的引物对结合第一 轮引物对进行扩增，能够成功扩增出俄罗斯天牛幼虫C0I基因的核苷酸序列，本发明优化 了克隆条件和克隆体系，制备了俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒。该试剂盒具有较高的特异 性和稳定性，灵敏度达5pg，可以快速准确鉴定俄罗斯天牛幼虫。因此该试剂盒可以作为快 速鉴定俄罗斯天牛幼虫的有效工具。
【附图说明】
[0010] 图1 :PCR方法特异性实验的电泳图。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1 :试剂盒的制备。
[0012] 1、试验材料 所用天牛标本均为江苏出入境检验检疫局各口岸昆虫实验室多年截获的标本。标本来 源和采集时间见表1。此外，选取Genbank登录的28种天牛C0I基因序列进行比对，见表 2〇
[0013] 表1实验标本名称和来源
表2 Genbank下载序列信息
2、试剂 含有 Mg2 +的 10XPCR Buffer，2.5 mmol/L 的 dNTPs，r<^DNA 聚合酶购自大连 Takara 公司；DNA Marker、GoldView购自南京上高生物公司；引物由上海金斯瑞有限公司合成。其 它试剂均为进口或国产分析纯试剂。
[0014] 1、引物的设计与合成 根据GenBank中28种天牛C0I基因的全基因序列，使用引物设计软件Primer5. 0设计 两对特异性引物。本发明所要保护的引物对SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4为第二轮的引物 对为上游引物J1718和下游引物N2191。
[0015] 第一轮 J173 :5, - TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' ； 第二轮：J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3' ； 由上海金斯瑞有限公司合成，预期扩增片段大小约为481bp。
[0016] 阳性对照：俄罗斯天牛幼虫cDNA模板； 阴性对照：非俄罗斯天牛幼虫cDNA模板。
[0017] 实施例2:鉴定方法 按照以下步骤进行： (1)基因组总DNA提取：采用GenMag动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒：将酒精 浸泡过的虫体，选择适当大小的肌肉组织，无菌水清洗2-3次，浙干水分后，将组织进行研 磨，加入适量的裂解液和蛋白酶K，55 °C温浴，使得组织完全裂解。再加入磁珠和缓冲液，使 DNA吸附到磁珠上，使用Wash Buffer进行除杂，除杂完毕后，加入少量的Elution Buffer， 将DNA溶解，得到基因组DNA溶液，-20°C保存。
[0018] (3)PCR扩增：PCR反应体系采用50μ 1标准反应体系，其中含有10XPCR Buffer (Mg2+)5 μL，dNTPs (2.5mmol/L)4 yl，7^DNA 聚合酶 0.4 yl，cDNA 模板 2μ1，上下 游引物各1 μL，后加 ddH20补足5〇μ1。
[0019] PCR反应条件分别为： 第一轮：94 °C预变性3min ;94 °C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，循环35次， 循环结束后再72 °C延伸10 min。
[0020] 第二轮：94 °C预变性 3min ;94 °C变性 30s，47°C退火 30s，72°C延伸 45s，循环 35 次，循环结束后再72 °C延伸10 min。
[0021] 所得PCR产物，部分经1. 5 %琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后紫外线下观察并拍 照，剩余部分送上海金斯瑞有限公司纯化并测序。
[0022] (4)PCR扩增产物分析：结束后取8 μ L PCR扩增产物加于1%琼脂糖凝胶孔中放于 电压为100~130V的电泳槽里电泳45min，于紫外投射仪中观察结果，分别将俄罗斯天牛幼 虫与其他的天牛扩增结果进行电泳。
[0023] 从图1可以看出：俄罗斯天牛幼虫扩增出了一条481bp的片段，参见泳道1和泳道 2，其他天牛均未扩增出片段，参见泳道3。
[0024] 实施例3 :特异性实验 用与实施例2相同的方法提取28种天牛的DNA，并以此为模板，用设计的引物进行PCR 扩增。用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，只有俄罗斯天牛幼虫扩增出一条481bp的片段(见图 1)，将鸽细环阳性病料的PCR产物进行基因测序，与GenBank中已发表的序列进行比较，应 用Mega5. 0软件对天牛COI基因序列进行分析，发现在481个位点中保守位点90个，变异 位点391个，信息位点375个，自裔位点16个，考虑到俄罗斯天牛幼虫不同物种间的高度差 质性，可表明所扩增的片段为俄罗斯天牛幼虫的C0I基因，而其他28种天牛均未扩增出片 段均未扩增出条带来，这表明该方法所扩增的片段为俄罗斯天牛幼虫的C0I基因片段。
[0025] 实施例4 :稳定性实验 将试剂保存于_2〇°C，经过一年的保存和反复冻融后，对俄罗斯天牛幼虫DNA模板重新 进行检测，结果表明，该试剂盒的稳定性较好，可以长期保存。
[0026] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO: 4。2. 权利要求1所述的引物对在俄罗斯天牛幼虫鉴定中的应用。3. 权利要求2所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的引物对用于制备俄罗斯天 牛幼虫的鉴定试剂盒。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用于俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒， 包括： 预混剂A :由核苷酸序列如SEQ ID NO :3的上游引物15 μ L，核苷酸序列如SEQ ID NO: 4 的下游引物 15μ L，含有 Mg2+的 10XPCR Buffer 75μ L，2. 5 mmol/L 的 dNTPs 60 μ 1， T^DNA 聚合酶 6 μ 1，ddH20 200 μ L 组成； 阴性对照：非俄罗斯天牛幼虫cDNA模板30 μ L ; 阳性对照：俄罗斯天牛幼虫cDNA模板30 μ L。
【专利摘要】本发明公开了一种引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：3和SEQ？ID？NO：4。本发明还公开了所述的引物对在俄罗斯天牛幼虫鉴定中的应用。本发明获得的引物对结合第一轮引物对进行扩增，能够成功扩增出俄罗斯天牛幼虫COI基因的核苷酸序列，本发明优化了克隆条件和克隆体系，制备了俄罗斯天牛幼虫的鉴定试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达5pg，可以快速准确鉴定俄罗斯天牛幼虫。因此该试剂盒可以作为快速鉴定俄罗斯天牛幼虫的有效工具。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105524979
【申请号】CN201410506420
【发明人】顾忠盈, 吕飞
【申请人】中华人民共和国太仓出入境检验检疫局综合技术服务中心
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月28日