一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的lamp检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，具体是一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检 测方法。
【背景技术】
[0002] 柑桔黄龙病也称柑桔青果病，主要分布于亚洲、非洲、美洲的40多个国家和地区， 在我国部分地区发生普遍;是世界柑桔生产上的一种毁灭性病害;柑桔黄龙病病原属原核 生物界、薄壁菌门、韧皮部杆菌属(Liberobacter)，目前，全球共发现亚洲韧皮部杆菌(L. 881&1：；[0118)、非洲韧皮部杆菌(]^.3；^；[0311118)和美洲韧皮部杆菌(]^.311161'；[0311118)3个不同 种，目前在中国分布的柑桔黄龙病菌为亚洲种，亚洲柑桔黄龙病的为害症状不仅表现为使 叶片转黄，还能使柑桔产量降低、品质下降；病情严重时会使根系腐烂，甚至会造成整片柑 桔园被毁，且至目前为止，柑桔黄龙病仅可防不可治，主要采取砍除病树、防治媒介昆虫等 措施进行防控，因此对柑桔黄龙病菌的早期检测鉴定尤其重要；目前柑桔黄龙病的检测鉴 定技术主要有六种，包括田间诊断法、指示植物法、电镜检测法、免疫学检测法、淀粉显色 法、核酸分子检测法;其中田间诊断简便，但易与其他病害混淆，且与诊断者的学识经验有 很大关系；指示植物法耗时长;电镜检测疫学检测均易漏检，淀粉显色虽然快速、经济，但也 需与田间诊断结合凭经验判断；分子核酸分子检测方法是目前检测准确率最高的一种方 法，其中包括常规PCR、实时定量PCR方法、LAMP检测法等，其中前两种分子检测方法对检测 环境、设施设备均有较高要求，不适合大规模快速检测应用;LAMP检测方法由于具有操作简 便、对环境要求低、快速、准确的优点已广泛应用于食品、医药、农业等领域，目前在亚洲柑 桔黄龙病的检测已有部分研究，但采用靶基因不同，其特异性引物、检测准确性等均不同。
【发明内容】
[0003] 本发明为了能更好的防控柑桔黄龙病的发生，对感病的柑桔植株进行早期诊断以 防止其进一步大面积扩散，经过长期的试验研究与对比，提出一种快速检测亚洲柑桔黄龙 病菌的LAMP检测方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0004] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，包括以下步骤： 1)引物设计： 采用柑桔黄龙病菌的16SrDNA作为靶基因，应用Clustal W进行多重比对，分析序列的 保守区，利用在线设计软件Primer Explorer V 4.0,设计LAMP引物，包括2条外引物F3/B3， 2条内引物FIP/BIP，针对6个特定区域设计4条特异性引物，引物序列如下：
2) 核酸提取： 2.1) 按照CTAB法提取柑桔叶片总DNA; 2.2) 提取的DNA冷冻保存备用； 3) LAMP特异性检测： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各lyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶lyL，模板2yL，加 ddH20补足至25yL; 3.2) 将反应?0?管置于恒温孵育器，651反应8〇1^11，之后80°0下灭活51^11结束反应。
[0005]作为本发明进一步的方案:步骤2中提取的DNA于-20°c保存备用。
[0006]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明提供的亚洲柑桔黄龙病LAMP快速 检测技术操作简便、对环境设施设备要求不高、成本低，且快速准确，特别适合对于亚洲柑 桔黄龙病的大规模初筛，为柑桔黄龙病的检测与防控提供了一种新的手段;本发明的检测 方法灵敏度比普通PCR高10000倍。
【附图说明】
[0007]图1为柑桔四种病原菌DNA样品的LAMP反应曲线图。
[0008]图2为不同稀释度DNA样品的LAMP反应曲线图。
[0009] 图3为不同稀释度DNA样品的普通PCR凝胶电泳图。
[0010] 其中，1-柑桔溃疡病菌;2-亚洲柑桔黄龙病菌A;3-亚洲柑桔黄龙病菌B;4-柑果茎 点霉菌;5-柑桔炭疽病菌;6-亚洲柑桔黄龙病菌C; 7-柑桔健康叶片;8-双蒸水；11: HLB-IO*3 稀释度DNA; 22: HLB-10-1 稀释度DNA; 33: HLB-10-2稀释度DNA; 44: HLB-10-3稀释度DNA; 55 : HLB-10-4 稀释度 DNA; 66: HLB-10-5 稀释度 DNA; 77: HLB-10-6 稀释度 DNA; 88: HLB-10-7 稀释度 DNA〇
【具体实施方式】
[0011]下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0012]请参阅图1-3,一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，包括以下步骤： 1) 引物设计： 采用柑桔黄龙病菌的16SrDNA作为靶基因，应用Clustal W进行多重比对，分析序列的 保守区，利用在线设计软件Primer Explorer V 4.0,设计LAMP引物，包括2条外引物F3/B3， 2条内引物FIP/BIP，针对6个特定区域设计4条特异性引物，引物序列如下：
2) 核酸提取： 2.1) 按照CTAB法提取柑桔叶片总DNA; 2.2) 提取的DNA于-20°C保存备用； 3)LAMP特异性检测： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各lyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶lyL，模板2yL，加 ddH20补足至25yL; 3.2) 将反应?0?管置于恒温孵育器，651反应8〇1^11，之后80°0下灭活51^11结束反应。 [00 13] 实施例1 将本发明检测方法应用新型环介导等温扩增设备一一用GENIE Π 便携式基因荧光扩 增仪进行扩增和检测，检测所建立检测方法的特异性与灵敏度，并将其结果与常规PCR检测 方法进行比较，结果表明本发明的方法灵敏度高，特异性好;具体情况如下： (1) 特异性试验： 采用本发明的检测方法，以柑桔黄龙病(3个样）、溃疡病（1个样）、黑星病、炭疽病及健 康样品DNA为模板，对双蒸水作空白对照进行LAMP反应，检测该方法的特异性，只有柑桔黄 龙病的3个样品有扩增，结果表明该方法的特异性好，如附图1所示； (2) 灵敏度试验： 将DNA样品依次稀释为级，应用本发明检测方法与常规PCR方法进行比较，结果 表明，应用本检测方法，l〇Q-l〇-6级出峰时间从9minl9sec至9min49sec不等，10- 7稀释度没有 出现扩增曲线，说明DNA样品的LAMP能检测到10-6稀释度，应用常规PCR检测方法对于相同稀 释度的DNA样品进行灵敏度试验，结果显示，普通PCR能检测到10- 2稀释度。表明本检测方法 灵敏度比普通PCR高10000倍;如附图2-3所示。
[0014]上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方 式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下 做出各种变化。
【主权项】
1. 一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 引物设计； 2) 核酸提取； 3. LAMP特异性检测。2. 根据权利要求1所述的快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包 括以下步骤： 1) 引物设计： 采用柑桔黄龙病菌的16SrDNA作为靶基因，应用Clustal W进行多重比对，分析序列的 保守区，利用在线设计软件Primer Explorer V 4.0,设计LAMP引物，包括2条外引物F3/B3， 2条内引物FIP/BIP，针对6个特定区域设计4条特异性引物，引物序列如下：2) 核酸提取： 2.1) 按照CTAB法提取柑桔叶片总DNA; 2.2) 提取的DNA冷冻保存备用； 3. LAMP特异性检测： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各IyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶IyL，模板2yL，加 CldH2O补足至25yL; 3.2) 将反应PCR管置于恒温孵育器，65°C反应80 min，之后80°C下灭活5 min结束反应。3. 根据权利要求1所述的快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，其特征在于，步 骤2中提取的DNA于-20°C保存备用。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：1)引物设计：采用柑桔黄龙病菌的16SrDNA作为靶基因，设计4条LAMP特异性引物；2)核酸提取：按照CTAB法提取柑桔叶片总DNA；3)LAMP特异性检测：取5×Reaction？Buffer、F3和B3引物、FIP和BIP引物、Mg2+、dNTPs、Bst？DNA聚合酶、模板、加ddH2O定容至25μL；将反应PCR管置于恒温孵育器反应，之后灭活结束反应；本发明操作简便、对环境设施设备要求不高、成本低，快速准确，特别适合对于亚洲柑桔黄龙病的大规模初筛，为柑桔黄龙病的检测与防控提供了一种新的手段。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105524986
【申请号】CN201511003710
【发明人】黄丽莉, 李茵, 祝建新, 罗涛朋, 刘 英
【申请人】江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月29日