一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于培养基技术领域，具体设及一种维持潇黑粉菌菌丝体外生长的培养 基。
【背景技术】
[0002] 潇黑粉菌属于担子菌亚口黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌 近源。目前为止，巧白是其所知的唯一寄主，而巧白孕巧是巧白植株与该专一性地寄生在体 内的潇黑粉菌共同作用的结果。田间，巧白受到多种病虫害威胁，主要的病害为胡麻斑病和 诱病，主要的虫害是惧虫，包括二化惧、稻纵卷叶惧等。现今农药防治还是田间病虫害的主 要防控措施，而田间应用发现在病害控制过程中，杀菌剂的使用对巧白的产量具有显著影 响，例如田间常用的Ξ挫酬，若施用剂量或者时间不当，就会导致当季巧白植株无法孕巧， 使农民遭受重大损失。运与杀菌剂对潇黑粉菌的毒力作用密切相关。因此进行杀菌剂对潇 黑粉菌的毒力测定试验对田间农药的种类及用量选择具有重要的指导意义。而杀菌剂对潇 黑粉菌的室内毒力测定需要保证潇黑粉菌菌丝在体外可W正常生长。虽已有报道显示潇黑 粉菌可W在体外进行培养并产生菌丝，但在YEPS培养基(2%蛋白腺，2%薦糖，1%酵母粉)上培 养的潇黑粉菌菌丝与丝状真菌菌丝在形态上具有较大差异，并且不能进行长期的菌丝生 长。因此我们通过对培养条件的摸索研究，获得了一种能够维持潇黑粉菌菌丝体外生长的 培养基。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种维持潇黑粉菌菌丝体 外生长的培养基的技术方案。
[0004] 所述的一种维持潇黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括W下组分： K2册04 0.85-1.15 g/L，MgS04·7也0 0.45-0.55g/L，FeS04·7也0 0.008-0.012g/L，KCl 0.45-0.55g/L，酵母粉2-3g/L，蛋白栋4-6g/L，薦糖3-4g/L，组氨酸4.5-5.9g/L，琼脂 10- 15g/L〇
[0005] 所述的一种维持潇黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括W下组分： K2册〇4 0.95-1.05g/L，MgS〇4 · 7也0 0.48-0.52g/L，FeS〇4 · 7出0 0.009-0.011g/L，KCl 0.48-0.52g/L，酵母粉2.2-2.8g/L，蛋白栋4.4-5.6g/L，薦糖 3.2-3.8g/L，组氨酸4.8-5.5g/ 1，琼脂12-14邑/1。
[0006] 所述的一种维持潇黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括W下组分： 1(2册04 1邑/1，]\%504.7也0 0.5邑/1^6504*7也0 0.01邑/1，1((：10.5邑/1，酵母粉2.5邑/1，蛋白 栋 5g/L，薦糖 3.42g/L，组氨酸 5.2g/L，琼脂 lOg/L。
[0007] 上述的一种维持潇黑粉菌菌丝体外生长的培养基，配伍合理，在基础培养基中加 入最佳碳氮源，使得该培养基能够维持潇黑粉菌菌丝体的体外生长。
【附图说明】
[000引图1为潇黑粉菌单菌落形态(A)及其显微图（B); 图2为潇黑粉菌在菌丝生长培养基化M)及YEPS培养基上培养2、4、6、15天后菌落形态显 微观察图； 图3为不同碳氮源培养基上潇黑粉菌菌丝生长观测图； 图4为潇黑粉菌在不同筛选培养基上培养2天后菌丝生长情况图，其中A-I分别代表组 合 1-9; 图5为潇黑粉菌在不同筛选培养基上培养3天后菌丝生长情况，其中A-I分别代表组合 1-9。
【具体实施方式】
[0009] W下结合实施例来进一步说明本发明。
[0010] 实施例1:潇黑粉菌菌丝体外生长的培养基与YEPS培养基进行潇黑粉菌菌丝培养 的对比试验 潇黑粉菌菌丝生长培养基（GM)配方（1 L):K2册化1 g，MgS化.7此0 0.5 g，FeS化· 7出0 0.01g，KCl 0.5 g，酵母粉2.5 g，蛋白栋5 g，薦糖3.42 g，组氨酸5.2 g，琼脂10 g; YEPS培养基配方（1 L):蛋白腺20g，薦糖20g，酵母粉lOg。
[0011] 1)采用研磨法分离巧白中的潇黑粉菌，在PDA固体培养基上28°C培养6天后得到纯 培养的菌落(图1A)，菌落呈现不规则边缘，但未见明显白色菌丝。对图1A中的菌落进行显微 观察，发现不规则边缘是菌丝（图1B为图1A中箭头所指菌落的显微观察图），但是菌丝体外 生长不能长期维持从而无法产生白色气生菌丝(PDA培养基培养无法实现白色气生菌丝生 长)。
[0012] 2)挑取菌落，加入少量灭菌水稀释后取1微升于菌丝生长培养基或YEPS培养基上 28°C培养，2天后都可观察到白色气生菌丝，如图2所示，随着培养时间的延长，菌落逐渐增 大，YEPS培养基上的气生菌丝逐渐减少，相反，在菌丝生长培养基上的气生菌丝一直保持正 常生长。
[0013] 从该实施例可知，潇黑粉菌菌丝生长培养基能够维持潇黑粉菌菌丝体外生长，而 YEPS培养基则不能。
[0014] 实施例2:培养基主要成分筛选(筛选最佳碳氮源）:薦糖、组氨酸 为了筛选最佳的菌丝生长碳氮源，我们在基础培养基(K2HP化1 g，MgS化-7出0 0.5 g，FeS化《7出0 0.01g，KCl 0.5 g，琼脂10 g，l L)中添加不同的碳氮源，检测其对菌丝生长 的影响，筛选其中对菌丝生长具有促进作用的成分。在碳氮源筛选过程中，分别选用半乳 糖，葡萄糖，果糖，山梨醇，甘露醇，薦糖，乳糖，麦芽糖作为碳源;硝酸钟，硝酸锭，硫酸锭，谷 氨酸钢，甲硫氨酸，精氨酸，尿素，组氨酸作为氮源;其中碳源WC6为单位，浓度为20 mm/L， 氮源WN1为单位，浓度为100 mm/L。^硝酸钟为氮源，首先将潇黑粉菌在不同碳源培养基上 培养。发现在薦糖、麦芽糖、果糖及甘露醇培养基上潇黑粉菌菌丝生长状况较好（图3A)。另 夕hW薦糖为碳源，在不同的氮源培养基上进行融合实验，结果如图3B所示，组氨酸、谷氨酸 钢、精氨酸及尿素培养基能促进菌丝生长。
[0015] 由上图对比YEPS培养基和薦糖培养基中菌丝生长状态，我们发现YEPS基础营养蛋 白腺和酵母粉对菌丝生长具有促进作用，因此在基础培养基中添加营养丰富的蛋白腺和酵 母粉成分，作为菌丝生长的基础培养基，再分别添加筛选得到的有利于菌丝生长的不同碳 氮源培养基，其中碳源WC6为单位，浓度为20 mm/L，氮源WN1为单位，浓度为100 mm/L，组 合如表1。
[0016] 表1菌丝生长培养基筛选组合
通过光学显微镜和体式显微镜观察不同培养基中菌丝长期生长状态，在培养2天时通 过光学显微镜观察菌丝生长，我们发现所有组合中的菌丝均开始生长，但是某些培养基明 显不利于菌丝维持，伸长的菌丝端已开始进行芽殖，例如组合4,而在组合1、组合2和组合9 的培养基上菌丝生长及维持都较好(图4)。
[0017] 继续培养观察，3天后可W明显看到组合1、2和9中的菌丝生长良好，而组合4、5中 菌丝无法维持，其余组合中菌丝生长较慢（图5)。继续培养10天后肉眼观察发现只有组合9 中的菌落布满白色气生菌丝，组合1中有部分白色菌丝，其余组合中菌丝生长区已呈乳黄色 光滑，在体式显微镜下观察发现组合1、2、3、6、8还可见明显菌丝，但是菌丝周围已密布酵母 型菌株形态，而组合4、5、7已基本看不到菌丝形态，只有组合1中菌丝形态明显且未见明显 酵母型菌株形态出现(图5)，可见组氨酸和薦糖对菌丝生长和维持具有良好的作用，两者连 用可W达到稳定的维持菌丝生长的效果。因此，确定薦糖和组氨酸为最佳碳氮源。
[001 引 实施例3 取K2HPO4O.85 g，MgS04.7也0 0.45g，FeS04*7H20 0.008g，KCl 0.45g，酵母粉2g，蛋 白栋4g，薦糖3g，组氨酸4.5g，琼脂lOg加入IL水配制得到维持潇黑粉菌菌丝体外生长的培 养基。
[0019] 将潇黑粉菌培养至上述培养基中，在培养2天时通过光学显微镜观察菌丝生长，培 养基上菌丝生长及维持都较好，继续培养观察，3天后可W明显看到菌丝生长良好，继续培 养10天后肉眼观察菌落布满白色气生菌丝。
[0020] 由此可见该培养基能够维持潇黑粉菌菌丝体外生长。
[0021] 实施例4 取拉册041.15邑，]\%504.7出0 0.55邑^6504.7出0 0.012邑，1((：10.55邑，酵母粉3邑，蛋白 栋6g，薦糖4g，组氨酸5.9g，琼脂15g加入IL水配制得到维持潇黑粉菌菌丝体外生长的培养 基。
[0022] 将潇黑粉菌培养至上述培养基中，在培养2天时通过光学显微镜观察菌丝生长，培 养基上菌丝生长及维持都较好，继续培养观察，3天后可W明显看到菌丝生长良好，继续培 养10天后肉眼观察菌落布满白色气生菌丝。
[0023] 由此可见该培养基能够维持潇黑粉菌菌丝体外生长。
[0024] 实施例5 取1(2册04 0.95邑，]\%504.7出0 0.48邑^6504.7此0 0.009邑，1((：10.48邑，酵母粉2.2邑，蛋 白栋4.4g，薦糖3.2g，组氨酸4.8g，琼脂1?加入1L水配制得到维持潇黑粉菌菌丝体外生长 的培养基。
[0025] 将潇黑粉菌培养至上述培养基中，在培养2天时通过光学显微镜观察菌丝生长，培 养基上菌丝生长及维持都较好，继续培养观察，3天后可W明显看到菌丝生长良好，继续培 养10天后肉眼观察菌落布满白色气生菌丝。
[0026] 由此可见该培养基能够维持潇黑粉菌菌丝体外生长。
【主权项】
1. 一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括以下组分:1(2冊〇4〇.85-1.15 g/L，MgS〇4.7H20 0.45-〇.55g/L，FeS〇4.7H2〇 0.008-0.012g/L，KCl 0.45-0.55g/L， 酵母粉2-3g/L，蛋白栋4-6g/L，蔗糖 3-4g/L，组氨酸4.5-5.9g/L，琼脂 10-15g/L。2. 如权利要求1所述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括以 下组分:K2HP〇4 0.95-1.05g/L，MgS〇4 · 7H20 0.48-〇.52g/L，FeS〇4 · 7H20 0.009-0.011g/L， KC1 0.48-0.52g/L，酵母粉2.2-2.8g/L，蛋白栋4.4-5.6g/L，蔗糖3.2-3.8g/L，组氨酸4.8-5.5g/L，琼脂 12-14g/L。3. 如权利要求1所述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，其特征在于包括以 下组分：1(2耶04 18/1，]\^504.7!120 0.58/1，卩6504.7!120 0.018/1，1((：10.58/1，酵母粉 2 · 5g/L，蛋白栋5g/L，鹿糖3 · 42g/L，组氨酸5 · 2g/L，琼脂 10g/L。
【专利摘要】一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，属于培养基技术领域。该培养基包括以下组分：K2HPO4？0.85-1.15g/L，MgSO4·7H2O？0.45-0.55g/L，FeSO4·7H2O？0.008-0.012g/L，KCl？0.45-0.55g/L，酵母粉2-3g/L，蛋白栋4-6g/L，蔗糖3-4g/L，组氨酸4.5-5.9g/L，琼脂10-15g/L。上述的一种维持菰黑粉菌菌丝体外生长的培养基，配伍合理，在基础培养基中加入最佳碳氮源，使得该培养基能够维持菰黑粉菌菌丝体的体外生长。
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/14
【公开号】CN105543109
【申请号】CN201610058038
【发明人】叶子弘, 张雅芬, 崔海峰, 俞晓平
【申请人】中国计量学院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月28日