一种美丽库蠓特异基因及其分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及物种鉴定领域，具体设及一种库朦的C0I基因序列及其分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 库朦是我国Ξ大吸血朦之一，可传播蓝舌病、住球虫病等多种人兽共患病，是一种 重要的病媒生物。因此，对吸血朦的鉴定和识别，是监测与控制朦传疾病发生的基础，也是 疾病预防控制领域的核屯、步骤。目前，对吸血朦的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识 别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手;而且，对 吸血朦的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟 需寻求一种新的方法，W弥补传统分类方法的缺陷。
[0003] DNA条形码(DNA barcode)是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异 的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片段对物种 进行快速准确鉴定的新兴技术。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物 鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破W往对 经验的过度依赖，有利于帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系 等。
[0004] 作为DNA条形码的标准目的基因，一方面必须足够保守，便于利用通用引物进行 大范围的扩增;另一方面要有足够的变异来区分不同物种。因此，鉴定不同的物种类群需要 选择有效的目的基因。目前，在系统发育研究中广泛应用的标志基因是核糖体12S和16S基 因，但因其存在大量的插入和缺失现象，不宜用做条形编码基因。线粒体基因组中存在的13 个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基1(切tochrome Oxidase Subunit I, C0 I)、线 粒体细胞色素 KCy忧）、ND4、ND5运4个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900 bp左右运两个条件，但ND4和ND5进化太快，不可能设计出通用引物，限制了它们作 为全面DNA鉴定系统的目标基因。故人们最终选定C0 I基因中的一个片段作为DNA条形编 码基因。迄今为止，已有诸多研究证明C0 I基因在鸟类、鱼类、鱗翅目昆虫、蚊类、蚁类和弹 尾目等类群的分类鉴定中行之有效。因此，可采用基于C0 I基因的DNA条形码技术对吸血 朦进行分子鉴定。该方法与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等 问题，而且可实现吸血朦的快速鉴定。目前，通过该方法已获得多种吸血朦的C0I基因序列 并上传 Genbank中，但至今尚无美丽库朦的相关基因序列。本发明提供的美丽库朦基因序列 有利于实现美丽库朦的快速鉴定，缩短鉴定时间。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于提供一种库朦的C0I基因序列。通过分子生物学方法获取美丽 库朦(Culicoides bellulus)的C0I基因序列，通过基因序列相似性的比对，可准确、快速地 鉴定美丽库朦。
[0006]为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现： 采用小型昆虫微量DM模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增 该库朦的COI基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、序列拼 接，并在NCBI中进行Blast相似性捜索，确保所得序列为目标序列。本发明所述的美丽库 朦特异基因，为COI基因，所述库朦的C0 I基因序列如SEQ ID No.l所示(不含引物）：
[0007] 本发明所述的美丽库朦C0I基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0008] 本发明所述的美丽库朦的分子鉴定方法，包括： 1)从待测的昆虫组织中分离提取DNA; 2似该DNA为模板，采用的引物为:正向引物5 ' AATCATAAAGATATTGGAAC 3 '，反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'，通过聚合酶链式反应扩增出该昆虫的C0I基因； 3) 然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的C0I基因用琼脂糖电泳分离，经漠乙 锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果。若能相应地特异性扩增出大小 约为658 bp的条带，送生物公司测序； 4) 根据测序结果，若目标基因序列与SEQ ID No.l的相似性在98%W上，即可判断所述 的待测组织为美丽库朦。
[0009] 美丽库朦的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结 果的可靠性。
[0010] 所述引物根据文献合成，正向引物5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3'，反向引物5' CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0011] 本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。
[001引本发明的优点为： 1)本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类方法相结合，对所述库朦进行鉴定，可确 保物种鉴定的准确性和可靠性。
[0013] 2)与传统的形态学鉴定方法相比，本发明建立的美丽库朦分子鉴定方法可有效缩 短美丽库朦的鉴定时间。
【附图说明】
[0014]图1为美丽库朦C0I基因 PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为阴性对 照，2-5均为美丽库朦雌虫的C0I基因，检出大小约为658 bp的条带。Μ为化2000的DNA m曰rker〇
[001引图2为未知库朦雌虫C0I基因 PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为阴 性对照，2为未知库朦雌虫的C0I基因，检出大小约为658 bp的条带。Μ为化2000的DNA m曰rker0
【具体实施方式】
[0016] 实施例1美丽库朦(化licoides bellulus)C0I基因序列的获取 1、美丽库朦标本的获取 美丽库朦为野外采集获得的标本，经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。标本制成玻片 后经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。标本制作前，挑取美丽库朦胸部末端和腹部前 几节置于95%酒精中，供DNA提取。
[0017] 2、DNA模板制备 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取美丽库朦DNA(文礼章主编.昆虫学研究方法 与技术导论[M].北京:科学出版社，2010.278-286)，提取的DNA样品于-20°C保存备用。
[001引3、引物合成 本实施例所用引物如下： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0019] 4、PCR 扩增 本实施例的PCR反应体系如表1所示。
[0020] 表1美丽库朦C0I基因 PCR反应体系巧OuL体系）
本实施例的反应程序如表2所示。
[0021 ] 表2美丽库朦C0I基因 PCR反应程序
PCR产物于4°C保存备用。
[0022] 5、PCR扩增产物检测 取扣L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min)。漠乙锭染色，凝胶 成像系统检测，电泳图谱参见附图1。
[0023] 6、基因序列测定 选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序(测序所用引物与PCR所 用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为美丽库朦的C0 r基因序列一SEQ ID No.1。
[0024] 实施例2未知库朦的鉴定 1、标本的采集与保存 采用挥网法或灯诱法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。
[00巧]2、DNA模板制备 在解剖镜或体视显微镜下，从采集到的朦类标本中随机挑选出一只雌性库朦，采用小 型昆虫微量DNA模板制备方法提取库朦DNA(文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京:科学出版社，2010.278-286)，提取的DNA样品于-20°C保存备用，每份标本一个编号。
[0026] 3、目的基因序列的获取 3.1引物合成 W获得的未知库朦DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。
[0027] 3.2 PCR扩增 本实施例的PCR反应体系如表3所示。
[002引 表3未知库朦C0I基因 PCR反应体系巧OuL体系)_
本实施例的反应程序如表4所示。
[0029] 表4未知库朦C0I基因 PCR反应程序
PCR产物于4°C保存备用。
[0030] 3.3 PCR扩增产物检测与基因序列测定 取扣L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min)。漠化乙锭染色。凝 胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。由附图2看出实施例2的未知库朦也能特异性扩增出 大小约为658 bp的产物，将大小约为658 bp的产物送生物公司测序，结果显示与基因序 列SEQ ID NO. 1的相似性为99.9%，因而可判定该未知库朦为美丽库朦。
【主权项】
1. 一种美丽库朦特异基因，其特征在于，所述特异基因序列为COI基因，为如下所述的 基因序列沈Q ID No. 1:ο2. 权利要求1所述的库朦的COI基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列分别为： 正向引物 5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3' 反向引物 5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'。3. -种美丽库朦的分子鉴定方法，包括： 1) 从待测的昆虫组织中分离提取DNA; 2. W该DNA为模板，对C0I基因采用的引物为:正向引物5'AATCATAAAGATATTGGAAC 3'， 反向引物5'CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG 3'，通过聚合酶链式反应扩增出美丽库朦COI基 因； 3) 然后取步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的C0I基因用琼脂糖电泳分离，经漠乙锭染 色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出大小约为658 bp的条带，送生物公司测序； 4) 根据测序结果，如果相应C0I基因序列与SEQ ID No.l的相似性在98%W上，即可判断 所述的待测组织为美丽库朦。
【专利摘要】本发明公开<b>一种美丽库蠓特异基因及其分子鉴定方法，</b>其特征在于采用分子生物学方法获取该库蠓的COⅠ基因序列，通过基因序列相似性的比对，对该库蠓进行种类鉴定。本发明提供的美丽库蠓分子鉴定方法，有利于实现美丽库蠓准确、快速的鉴定。
【IPC分类】C12N15/53, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105543249
【申请号】CN201610011293
【发明人】陈敏, 黄恩炯, 蔡怡珊, 高博, 张建庆, 王飞鹏
【申请人】福建国际旅行卫生保健中心
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月8日