一种制备阿魏酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及阿魏酸的制备方法，涉及一种利用黑曲霉固态发酵产酶酶法制备阿魏酸的方法，尤其涉及使用一株黑曲霉Aspergillus niger TRIIM 3.00954发酵提取酶液在酶解去淀粉玉米麸皮过程中破坏细胞壁结构制备阿魏酸的方法。
【背景技术】
[0002]阿魏酸(Ferulic acid, FA)，化学名称为4_轻基_3_甲氧基肉桂酸(4 - hydroxy-3 - methoxy cinnamic acid)，其分子式为CiqHiq04，恪点169_173°C，溶于热水、乙醇乙酸乙酯，微溶于苯和石油醚。具有顺式、反式两种异构体，顺式异构体为黄色油状物质，反式异构体为斜方针状结构。阿魏酸是普遍存在于植物界的一种酚酸，为当归、大三叶升麻、川芎等中药材的重要有效成分。阿魏酸有抗氧化、降血脂、抗突变和防癌等功能，已广泛应用于医药、食品、化妆品等行业，因此具有广泛的应用价值和发展前景。
[0003]自然界中，阿魏酸以酯键和醚键分别与细胞壁多糖及木质素相连接，在植物细胞壁间形成了致密网状结构，从空间上阻碍了纤维素酶和半纤维素的降解作用。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase,EC.3.1.1.73，FAE)，属于羧基酸酯酶(E.C.3.1.1.1)的一个亚纲，其对于打断酯键交联，破坏细胞壁骨架结构，释放反式阿魏酸具有重要作用。目前，工业上以化学合成法或植物提取法制备阿魏酸，但因其耗时长、成本高、产量低，使得当前国际市场价格居高不下，售价约每千克170美元。因此，积极利用阿魏酸酯酶从农林废弃物中制备阿魏酸具有十分重要的意义。随着生活水平的提高，人们对天然绿色产品的需要也越来越高。与化学合成等方法相比，生物酶法制备阿魏酸具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点，正日益受到人们的重视。
【发明内容】
[0004]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种制备阿魏酸的方法，具有条件温和，环境污染小，产物得率高，副产物少，生产步骤简单等优点。
[0005]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
一种制备阿魏酸的方法，以农林废弃物麦麸、甘蔗渣为固态发酵培养基，以黑曲霉TRIIM 3.00954为发酵产酶菌株，以去淀粉麦麸为酶解底物，进行生物酶解制得阿魏酸。
[0006]所述的制备阿魏酸的方法，步骤如下:
1)将黑曲霉TRIIM3.00954接种到PDA固体培养基上，在28°C条件下，静置培养5_7d，得到成熟的斜面培养物；
2)用得到的斜面培养物，接种到PDA液体培养基中，在28°C条件下，180rpm振荡培养2d，制得种子培养液；
3)使用种子培养液，按每瓶接种ImL孢子悬浮液接种到固态发酵培养基中，摇匀后置30°(3条件下静置培养；
4)使用固态发酵培养物，加入培养基干重12倍的0.05M梓檬酸-梓檬酸钠缓冲液，在37°C条件下，150 rpm振荡浸提50 min，过滤收集浸提液，离心分离后获得的上清液即为粗酶液；
5)使用粗酶液，加入木聚糖酶、pH6.5的缓冲液以及去淀粉麦麸，在50°C的条件下，180rpm振荡酶解，一定时间后酶解液取样得到阿魏酸酶解液。
[0007]步骤(3)中，固态发酵培养时间为7d。
[0008]步骤(5)中，加酶量分别为阿魏酸酯酶0.6 U/g、木聚糖酶90 U/g，酶解体系固液比为1:30，酶解时间为6h。
[0009]步骤(4)中，粗酶液阿魏酸酯酶(FAE)酶活定义为在40 °C、pH 6.0条件下，水解底物阿魏酸甲酯每分钟产生I μπιο?阿魏酸所需酶量为I个酶活力单位(U)。酶解底物为一级色谱纯甲醇溶解的50 mM阿魏酸甲酯。取800 uL 0.1 M pH 6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加Λ100 HL阿魏酸甲酯甲醇溶液，置于40 °C预热5 min，加入上述制备的100 yL酶液。将混合物于40 °C下反应30 min后，沸水灭活10 min终止反应，室温冷却。根据Andersen[15]改进的高效液相色谱法在320 nm下测定阿魏酸生成量。色谱柱型号为ZORBAX Eclipse Plus C18。色谱条件为:流动相为甲醇:0.1%乙酸(35:65)，流速为0.8 mL/min，柱温30 °C，进样量5 μL，检测波长为320 nm。同时，以灭活酶液作对照。
[0010]本发明所使用的黑曲霉TRHM3.00954(Aspergillus niger TRIIM 3.00954)，该该菌株购自天津工业微生物研究所，其编号为TRIIM 3.00954，地址中国天津市解放南路怒江道7号。
[0011]在上述的利用黑曲霉Aspergillus niger TRIIM 3.00954固态发酵产酶酶法制备阿魏酸的方法中，制备种子培养液的PDA液体培养基配方为:葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L;斜面培养使用的PDA固体培养基是在此培养基基础上添加质量体积比为1.8%的琼脂。
[0012]在上述的利用黑曲霉Aspergillus niger TRIIM 3.00954固态发酵产酶酶法制备阿魏酸的方法中，固态发酵培养基的配方是:质量比为2:1的麦麸和甘蔗渣作为混合发酵培养基，按固液比 1:4加入无机盐溶液(g/L, (NH4)2SO4 1.5 g, KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.25 g，CaCb 0.05g，FeCl3 0.01 g，Na2HP〇4 1.5 g)，最佳补充碳源为葡萄糖，添加浓度为0.6%，最佳补充氮源为尿素，添加浓度为1%。
[0013]有益效果:与现有技术相比，本发明的制备阿魏酸的方法，使用黑曲霉Aspergillus niger TRIIM 3.00954固态发酵产酶酶法制备阿魏酸，条件温和，环境污染小，产物得率高，副产物少，生产步骤简单，生产周期短，是一种经济可行、极有产业化前景的阿魏酸生产工艺。
【附图说明】
[0014]图1是菌株TRUM 3.00954固态发酵产酶曲线图；
图2是酶解去淀粉麦麸释放阿魏酸曲线图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0016]实施例1
利用黑曲霉Aspergillus niger TRIIM 3.00954固态发酵产酶酶法制备阿魏酸，步骤如下:
1)斜面培养:将黑曲霉TRIIM3.00954接种到PDA固体培养基上，在28°C条件下，静置培养5-7d，得到成熟的斜面培养物；
2)制备种子培养液:用步骤I)所得到的斜面培养物，接种到PDA液体培养基中，在28°C条件下，180rpm振荡培养2d，制得种子培养液；
3)固态发酵:使用步骤2)所得的种子培养液，按每瓶接种ImL(约3 X 18个孢子/mL)孢子悬浮液接种到固态发酵培养基中，摇匀后置30°C条件下静置培养7d;
4)粗酶液制备:使用步骤3)得到的固态发酵培养物，加入培养基干重12倍的0.05 M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(含0.2% Tween 80，pH=5.0)，在37°C条件下，150 rpm振荡浸提50min，过滤收集浸提液，离心分离后获得的上清液即为粗酶液；
5)酶解:使用步骤4)所得的粗酶液，加入木聚糖酶、pH6.5的缓冲液以及去淀粉麦麸，在50°C的条件下，180rpm振荡酶解6h后，酶解液取样得到阿魏酸酶解液。
[0017]6)阿魏酸浓度检测:阿魏酸酶解液经高效液相色谱检测，最终阿魏酸浓度为0.44mM，酶解提取率为50.09%。
[0018]在上述利用黑曲霉Aspergillus niger TRIIM 3.00954固态发酵产酶酶法制备阿魏酸的方法中，种子培养液的培养基配方为:葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L;斜面培养使用的PDA固体培养基是在此培养基基础上添加质量体积比为1.8%的琼脂；固态发酵培养基的配方是:质量比为2:1的麦麸和甘蔗渣作为混合发酵培养基，按固液比1:4加入无机盐溶液(g/L, (NH4)2SO4 1.5 g,KH2PO4 0.5 g,MgSO4 0.25 g,CaCl2 0.05g，FeCl3 0.01 g,Na2HPO41.5 g)，最佳补充碳源为葡萄糖，添加浓度为0.6%，最佳补充氮源为尿素，添加浓度为1%。Aspergillus niger TRIIM 3.00954固态发酵产酶曲线如图1所示，固态发酵7 d后提取粗酶液FAE最高，可达8.2 U/gds，与未补充碳源、氮源的培养基产酶相比酶活提高了62.9%。
[0019]利用固态发酵产生FAE粗酶液与商品化木聚糖酶酶解去淀粉麦麸提取阿魏酸。分别加入0.6 U/g阿魏酸酯酶酶液、90 U/g木聚糖酶，在50°C条件下，180rpm振荡酶解，6h后酶解液取样测定阿魏酸浓度，阿魏酸得率随时间变化曲线如图2所示。反应6 h后阿魏酸得率最高可达60.6%。欧仕益采用黑曲霉固态发酵麦麸产生阿魏酸得率为20.9%，张璟利用液态发酵制备FAE酶解DSWB，经三次处理得率为55.46%。
[0020]本专利利用固态发酵产阿魏酸酯酶酶解去淀粉麦麸提取阿魏酸，提取率高于目前一般文献报道的水平。小麦麸皮细胞壁是由纤维素、半纤维素和蛋白质等多种高聚物组成，其中，半纤维素(主要为阿拉伯木聚糖)和木质素通过阿拉伯糖和阿魏酸等桥链作用形成网状结构，因此小麦麸皮结构致密，不易降解。FAE与木聚糖酶共同作用于细胞壁，同时打断阿魏酸酯键和糖苷键，使阿魏酸得以更好释放。故利用农林废弃物作为发酵基质，固态发酵产生阿魏酸酯酶，用以酶法制备植物中阿魏酸的方法具有条件温和、工艺简单、环保可行等潜在优势。
【主权项】
1.一种制备阿魏酸的方法，其特征在于，以农林废弃物麦麸、甘蔗渣为固态发酵培养基，以黑曲霉TRIIM 3.00954为发酵产酶菌株，以去淀粉麦麸为酶解底物，进行生物酶解制得阿魏酸。2.根据权利要求1所述的制备阿魏酸的方法，其特征在于，步骤如下: 1)将黑曲霉TRIIM3.00954接种到PDA固体培养基上，在28°C条件下，静置培养5_7d，得到成熟的斜面培养物； 2)用得到的斜面培养物，接种到PDA液体培养基中，在28°C条件下，180rpm振荡培养2d，制得种子培养液； 3)使用种子培养液，按每瓶接种ImL孢子悬浮液接种到固态发酵培养基中，摇匀后置30°(3条件下静置培养； 4)使用固态发酵培养物，加入培养基干重12倍的0.05M梓檬酸-梓檬酸钠缓冲液，在37°C条件下，150 rpm振荡浸提50 min，过滤收集浸提液，离心分离后获得的上清液即为粗酶液； 5 )使用粗酶液，加入木聚糖酶、P H 6.5的缓冲液以及去淀粉麦麸，在5 O °C的条件下，180rpm振荡酶解，一定时间后酶解液取样得到阿魏酸酶解液。3.根据权利要求2所述的制备阿魏酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，固态发酵培养时间为7d。4.根据权利要求2所述的制备阿魏酸的方法，其特征在于，步骤(5)中，加酶量分别为阿魏酸酯酶0.6 U/g、木聚糖酶90 1]/^，酶解体系固液比为1:30，酶解时间为611。
【专利摘要】本发明公开了一种制备阿魏酸的方法，包括斜面培养、制备种子培养液、固态发酵、粗酶液制备、酶解和阿魏酸浓度检测步骤。本发明使用黑曲霉<i>Aspergillus</i><i>？niger</i>？TRIIM？3.00954固态发酵产酶酶法制备阿魏酸，条件温和，环境污染小，产物得率高，副产物少，生产步骤简单，生产周期短，是一种经济可行、极有产业化前景的阿魏酸生产工艺。
【IPC分类】C12R1/685, C12P7/42
【公开号】CN105543293
【申请号】CN201610135259
【发明人】丁少军, 赵浩源, 张迎亚
【申请人】南京林业大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月10日