一种吡唑[5，6-d]并嘧啶类EGFR抑制剂及其抗肿瘤活性的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及一种有良好抗肿瘤活性的吡唑 [5,6-d]并嘧啶类化合物。另外，本发明还涉及含有该种化合物的药物组合物及其在制备抗 肿瘤药物中的用途等。
【背景技术】
[0002] 肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，在世界范围内每年因肺癌导致的死 亡超过100万人；在我国，肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中长期居于首位，其中以非小 细胞肺癌（NSCLC)最为普遍，占发病总数的85%以上。目前，经典的手术切除或放化疗往往 存在术后复发率高、毒副作用大、转移和耐药等多种缺陷。鉴于EGFR信号途径在诱发NSCLC 肿瘤生长和血管增生中的重要作用，EGFR已经成为NSCLC靶向治疗的重要靶点，其相应的 小分子抑制剂成为各大医药公司争相研发的重要领域。
[0003] 目前，已有近20种EGFR抑制剂药物进入临床试验阶段或陆续上市。其中，被认为 是第一代EGFR抑制剂的易瑞沙（Gefinitib)、特罗凯（Erlotinib)和我国自主研发上市的 凯美纳（Icotinib，2012年上市）等已在临床NSCLC病人治疗中获得巨大成功。但经6~12 个月的治疗后往往会发生明显的继发性耐药，极大的限制了患者生存时间的延长，目前研 究认为这种耐药通常是由于EGFR 20号外显子T790M错位突变所引起。2013年，Boehringer Ingelheim公司成功开发了首个第二代EGFR抑制剂Afatinib (BIBW2992)，其主要特点是可 以显著抑制EGFR??，有效逆转T790M所引起的耐药。但是，Afatinib同时也强烈抑制野生 型EGFR(EGFR WT)，阻止体内正常组织EGFRWT激酶的磷酸化和相关信号通路的激活，从而带 来较大的药物毒副作用，临床上表现为皮疹、呕吐等药物毒副反应。因此，开发具有高特异 性EGFR??突变体抑制剂已成为研发新一代抑制剂的首要目标。
[0004] 目前，EGFR抑制剂的构效关系并不明朗，有的结构差别很小的化合物，其针对 EGFR抑制的效果却相差很大。本发明人经过艰苦努力，令人意外地设计并合成出一种新的 吡唑[5,6-d]并嘧啶类化合物，其具有优良的EGFR??抑制效果和选择性，属于第三代EGFR 抑制剂，能用于治疗各种EGFR??高表达的肿瘤。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供新的EGFR抑制剂类抗肿瘤化合物及其药物。
[0006] 具体而言，本发明提供了式（WZ00411)所示的化合物或者其药学上可接受的盐：
[0007]
[0008] 化合物（WZ00411)为：
[0009] N6-(1H-吲哚-5)-N2-(4-(4-氮甲基哌嗪苯基）-1Η-吡唑[5,6-d]并嘧啶-4,6-二 胺
[0010] N4-(lH-indol-5-yl)-N6-[4-(4-methylpiperazin-1-yl) phenyl]-ΙΗ-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine
[0011] 本发明要解决的技术问题在于提供新的含吲哚的嘧啶[5,6-d]并咪唑类化合物 和/或提供其在治疗或预防肿瘤（尤其是EGFR依赖性或EGFR??突变高表达类肿瘤）方 面的新用途。
[0012] 本发明的目的之一是提供一种新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶类EGFR抑制剂。
[0013] 本发明的目的之二是提供一种新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶类EGFR抑制剂的制备 方法及抗肿瘤活性。
[0014] 在本发明中，我们首先利用化学方法合成了一种新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶类化 合物WZ00411。利用体外激酶层次上的活性筛选实验证实了化合物WZ00411具有强烈的 EGFR??抑制活性，同时对EGFR "具有一定选择性并对其他激酶抑制活性较弱，具备良好的 激酶选择性和第三代EGFR抑制剂特点（详情见实施例1)。细胞层面上实验也证实该化合 物可以有效抑制EGFR及其下游信号p-Akt和p-Erk的磷酸化水平（详情见实施例2)。
【附图说明】：
[0015] 这里所列举的化合物只是为了更好地说明本发明的化合物类别和结构形式，并非 限制本发明。
[0016] 图1说明合成的化合物WZ00411化学结构；
[0017] 图2说明激酶选择性抑制测试；
[0018] 图3说明化合物细胞水平上化合物的抗肿瘤活性验证。
[0019] 图4说明化合物在H1975细胞水平上对下游信号通路蛋白磷酸化抑制作用。
[0020] 实施例1化合物体外抑制EGFR的活性和选择性
[0021] EGFR激酶体外活性筛选：实验采用方法为Caliper Mobility Shift Assay，该方 法是以微流体芯片技术的迀移率检测技术为核心的检测平台。实验步骤：配置1. 25x激酶 反应缓冲液（62. 5mmol/L HEPES，pH 7. 5 ;0· 001875% Brij-35 ;12· 5mmol/LMgC12 ;2· 5mM DTT)和激酶反应终止液（100mmol/L HEPES，pH 7· 5 ;0· 015 % Brij-35 ;0· 2 % Coating Reagent#3);在5 μ 1的5x浓度的化合物溶液中（用DMS0溶解，用水稀释10倍）加入10 μ 1 的2. 5χ的FGFR1激酶溶液（在1. 25χ激酶反应缓冲液中加激酶），室温孵育10min后再加 入10 μ 1的2. 5x底物肽溶液（在1. 25x激酶反应缓冲液中加 FAM标记肽和ATP)，在28°C下 反应特定的时间后加入25 μ 1激酶反应终止液。在Caliper上测试收集数据，对激酶活性 的抑制率=(max-conversion) / (max-min) *100。"max" 为未加化合物的 DMSO 对照，"min" 为低对照。测定IC5。时每种样品设10个稀释度各2个复孔，3次重复。
[0022] 激酶选择性抑制测试：将WZ00411依照上述激酶抑制活性测定方法，测定对 VEGFR1、EGFR、TOGFR、FGFR1~2和C-Met等6种常见激酶的抑制活性，同时比较EGFRWT/ EGFR??激酶1C 5。活性比值，以表征这些化合物对EGFR WT和其他激酶的选择性。以表征该 化合物对激酶的选择性。
[0023] 激酶实验表明：化合物WZ00411对EGFRWT/EGFR??抑制1C 5。分别为21. 33和 1156. 62nMol。对其它常见5种激酶的抑制活性均大于5000nMol (实验数据见图2)，因此具 有良好的EGFR??抑制活性和EGFR WT/EGFR?°M及其他激酶选择性。（见图2)
[0024] 实施例2细胞水平上化合物的抗肿瘤活性验证
[0025] 采用MTT法化合物WZ00411在细胞层面上的抗肿瘤活性，选用含EGFR??高表达 的人NSCLC细胞株〇11975)46?1^高表达的人大细胞肺癌细胞株（A549)以及EGFR原发性 错位突变的人肺癌细胞株（HCC827)等7种细胞进行增殖抑制活性测试。测定时以PBS为 空白对照，EGF为阴性对照，（EGF+WZ4002)为阳性对照，（EGF+待测样品）为实验组，每种样 品设6个浓度梯度，计算IC 5。值。
[0026] 活性化合物对胞内EGFR促增殖信号通路的影响：选取化合物WZ00411，用EGF联 合不同浓度的WZ00411分别处理含EGFR??高表达的非小细胞肺癌H1975细胞；提取细胞 总蛋白后，经Western blotting检测细胞内EGF/EGFR信号通路中促增殖信号分子EGFR、 ERK和AKT磷酸化水平的变化。
[0027] 细胞实验表明：化合物WZ00411体现了良好的EGFRWT/EGFR?° M选择性。对EGFR ?°M 激酶抑制活性均达到20nMol，具有潜在的优化前景，并且拥有比WZ4002更优秀的激酶选 择性，化合物WZ00411对EGFR WT/EGFR?°M选择性为55倍（见图3)。此外，WZ00411具有较 好的抗肿瘤增殖活性，并在1、10、100和ΙΟΟΟηΜοΙ四种浓度下均可强烈抑制H1975细胞中 p-EGFR，ρ-ΑΚΤ 和 p-ERK 水平（见图 4)。
【主权项】
1. 具有下列化学结构的化合物及其可药用盐：化合物（WZ00411)为： N6- (1H-日引噪-5) -N2- (4- (4-氮甲基赃嗦苯基）-1H-化挫[5,6-d]并喀晚-4,6-二胺护- (lH-indol-5-yl) -妒- [4- (4-methylpiperazin-1-yl) phenyl] -IH-pyrazolo [3,4-d] pyrimi dine-4,6-diamine 谱图表征为： iHNMR 化OOMHz，DMS0-d6) δ (ppm) :12. 758(s，IH，-NH-)，11. 079(s，IH，-NH-)，9. 484(s， IH，-NH-)，8. 786(s，IH，-NH-)，8. 031 (s，IH，-NH-)，7. 629(d，J = 7. 2Hz，2H，Ar-H)， 7. 391 (d，J = 8. 4Hz，3H，Ar-H)，7.352(s，lH，Ar-H)，6. 83 (d，J = 8. 4Hz，2H，Ar-H)，6. 415 (s， IH，Ar-H)，3. 135 (s，4H，N-CH2-) ,2.730 (s，4H，N-CH2-) ,2.412 (s，3H，N-Og.ESI-MS m/z : (M+Hr，calcd for〔2化5成:440. 33。2. 权利要求上述化合物，其用于治疗肿瘤（如，肺癌、乳腺癌等）相关的疾病。3. 用于治疗肿瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或与肿瘤相关的疾病的药物组合物，其包括权 利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。4. 权利要求3所述的药物组合物，其被制成片剂、胶囊、口服液、注射剂、粉剂、膏剂或 外用药液。5. 权利要求1中所述的化合物在制备用于治疗肿瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或与肿瘤相 关的疾病的药物中的应用。6. 用于治疗肿瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或与肿瘤相关的疾病的方法，其包括向患者施 用有效量的权利要求1中之任一所述的化合物。7. 权利要求3、4所述的化合物、药物组合物、权利要求5所述的应用或权利要求6所 述的方法，其中肿瘤或与肿瘤相关的疾病是由表皮生长因子受体巧GFR)或T790M突变体 巧GFR??)超出正常量表达和释放而导致的疾病。8. 权利要求1所述的化合物、权利要求3所述的药物组合物、权利要求6所述的应用或 权利要求7所述的方法，其中肿瘤或与肿瘤相关的疾病选自肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、 骨肉瘤、皮肤癌、阴茎癌、膀脫癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫肌瘤、胆管癌、膜腺癌、肝癌、胃癌、 大肠癌、肾癌、鼻咽癌、食管癌、白血病、脑膜瘤、淋己瘤及其并发症。
【专利摘要】本发明提供了一种EGFR抑制剂类具有抗肿瘤作用的吡唑[5，6-d]并嘧啶类化合物。另外，本发明还提供了该化合物的药物组合物以及抗肿瘤用途等。
【IPC分类】A61P35/00, A61P35/02, C07D487/04, A61K31/519
【公开号】CN105566329
【申请号】CN201410635578
【发明人】张颖, 张乔乔, 叶清清, 何帆, 潘恺凌, 刘志国, 梁广, 李校堃
【申请人】温州医科大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年11月7日