一种体外培养成骨细胞的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域的一种动物细胞体外培养的培养基，具体涉及的是一种体外培养成骨细胞的培养基。
【背景技术】
[0002]由于许多因素的影响，骨组织结构、功能及骨代谢等方面的研究直接通过人体来进行受到限制，因此体外培养成骨细胞，作为常用的体外实验模型，成为研究骨生理、病理及修复组织工程的基础。
[0003]1964年，Peck等就开始从事动物胚胎骨成骨细胞培养的研究工作，1979年Mills等首先报道用组织块培养法在体外成功培养了人成骨细胞，此后陆续有成功培养成骨细胞的报道。主要的方法分为酶消化法和组织块法，及改良的酶消法-组织块法联合培养方法。
[0004]这些方法采用的培养基多为基础培养基加一定比例的胎牛血清制成的培养液。一般情况下，从骨组织中游离的成骨细胞接种于培养瓶后需要20-30天之后才能达到汇合传代，而且胎牛血清的体积含量比较高，一般会达到20%以上，胎牛血清的消耗比较大。因此，希望能够提供一种成骨细胞的培养基，能够加快成骨细胞的生长，且能减少血清的使用量。
[0005]银耳多糖(TremeI lam)是从银耳(Treme I la fuciformisBerk)的子实体中得到的多糖，其主链结构是由α_( 1—3)糖苷键连接的甘露聚糖，支链由葡萄糖醛酸和木糖组成。银耳多糖的在体内的功能主要集中在两个方面，一是针对非免疫系统，促进胃肠遭有益微生物生长，调节肠道理想微生物菌群的形成，增强动物对外源性病原菌的抵抗能力;二是针对免疫防御系统，提高体液免疫能力，增强吞噬细胞吞噬能力；提高淋巴细胞活性和功能，促进细胞因子生长，保护红细胞膜不易受到氧化损伤。其作用尤其表现在可预防和治疗由放射与抗肿瘤药物(如CTX)引起的骨髓抑制。试验结果显示，用Co60射线进行放疗者，骨髓中有核细胞数，比不授予银耳多糖的对照组多186%。可见，银耳多糖可用于抑制骨髓抑制作用，可促进成骨细胞生长。但目前没用将银耳多糖用于体外培养成骨细胞。
【发明内容】
[0006]发明目的
[0007]本发明提供一种体外培养成骨细胞的培养基，能够加快成骨细胞的生长，且能减少血清的使用量。
[0008]技术方案
[0009]—种体外培养成骨细胞的培养基:包括基础培养基10.0-15.0g/L，银耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，适量碳酸氢钠调pH值为7.2-7.6，加水定容至11^所述的基础培养基为01^]?，€[-]\^]\1，1^]\0-1640，？12，01^]\0712;所述的银耳多糖的纯度大于75%;所述的血清为胎牛血清、小牛血清、人血清、马血清和羊血清;本发明的培养基用于体外培养成骨细胞。
[0010]有益效果
[0011]本发明特异性用于成骨细胞的体外培养。试验结果表明，本发明能用于酶消化法、和组织块法，及改良的酶消法-组织块法联合培养方法制备的成骨细胞，能够加快成骨细胞的生长，且能减少血清的使用量。
【具体实施方式】
[0012]实施例1
[0013]低糖DMEM15.0g(HyClone)，银耳多糖100mg/L，小牛血清10mL，适量碳酸氢钠调pH值为7.2，加水定容至1L。
[0014]实施例2
[0015]a-MEM 15.0g(HyClone)，银耳多糖200mg/L，胎牛血清8mL，适量碳酸氢钠调pH值为7.4，加水定容至1L。
[0016]实施例3
[0017]酶消化法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取头盖骨;将头盖骨置于磷酸缓冲液内，清除骨膜、血管等结缔组织，将洗净的头盖骨剪成小片。将骨片用0.25%胰蛋白酶消化;终止反应后，再用0.1% Π型胶原酶将骨片消化分离细胞;将含细胞的消化液离心lOmin，沉淀的细胞团块用实施例1制得的培养基制成细胞悬液，按需密度接种于细胞培养瓶中，置于5%C02培养箱中培养。24h后，换液I次，以后每二三天换液I次，培养约12d后达到汇合后传代。
[0018]实施例4
[0019]组织块法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取头盖骨；用磷酸缓冲液冲洗后剪成小块，用上清液反复冲洗至发白；用0.25 %胰蛋白酶溶液消化，弃消化液，剩余小块移入培养瓶；加入实施例2制得的培养基，使小块均匀分布于瓶底;将培养瓶轻放入5%C02培养箱中培养。净置2-3天，待细胞从骨块边长出后换培养基并弃骨块。每2-3天换液I次，培养约1d后达到汇合后传代。
[0020]实施例5
[0021]改良酶消化法:取新生大鼠，75%乙醇浸泡，取头盖骨；用磷酸缓冲液冲洗后剪成小块;加入磷酸缓冲液，反复振荡、冲洗3次，直到骨块呈白色蜂窝状;弃磷酸缓冲液，加入
0.25%胰蛋白酶消化。弃消化液(0.25%胰蛋白酶)，用实施例2制得的培养基洗涤2次，再用磷酸缓冲液洗I遍。弃磷酸缓冲液，用lg/L的Π型胶原酶消化。加入实施例2制得的培养基终止消化，离心后用实施例2制得的培养基洗涤3次。弃洗涤液，加入实施例2制得的培养基吹打骨块，使更多成骨细胞游离出来，吹散细胞沉淀后，加入到细胞培养瓶中；所有培养瓶置入37°C，5%C02培养箱中培养;24h后，换液I次，以后每3天换液I次，培养约7d后达到汇合后传代。
[0022]实施例6
[0023]成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定:实施例3、实施例4和实施例5得到的细胞按2X 1Vcm2的密度接种于25ml细胞培养瓶，分别培养7、10、14、20天后，用95%酒精固定15min，干燥后，用孵育液(2%巴比妥钠5πι1+3%β-甘油磷酸钠5ml+2%硝酸钙10ml+2%硫酸镁5ml+蒸馏水25ml，其中2%硝酸钙、2%硝酸钴和I %硫化铵，临用前新鲜配制)37°C孵育2h，蒸馏水冲洗，加2 %硝酸钙作用2min，再加2 %硝酸钴作用2min，蒸馏水冲洗，I %硫化铵作用lmin，自来水洗。结果显示:实施例3、实施例4和实施例5得到的细胞碱性磷酸酶呈强阳性，鉴定为成骨细胞。
[0024]实施例7
[0025]实施例5得到的鼠成骨细胞的增值率:采用MTT比色法。将对数生长的鼠成骨细胞，以1.0 X 15加入96孔培养板中，培养24h，实验孔加入实施例2培养基；空白组加入相同体积的DMEM培养基(HyClone，含胎牛血清20 % )。每孔设五个复孔，培养48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成骨细胞增殖率=(I一实验组吸光值/对照组吸光值)X 100%。实施例2培养基培养的鼠成骨细胞的增值率为214.9±23.6%，与普通培养基培养的鼠成骨细胞相比有显著性差异(p<0.05)。
【主权项】
1.一种体外培养成骨细胞的培养基:其特征在于:包括基础培养基10.0-15.0g/L，银耳多糖100-30011^/1，血清8-101^，碳酸氢钠调?!1值为7.2-7.6，加水定容至1 L。2.根据权利要求1所述的体外培养基，其特征在于:所述的基础培养基为DMEM，α-ΜΕΜ，RPM1-1640，Fl2，DMEM/F12。3.根据权利要求1所述的体外培养基，其特征在于:所述的银耳多糖的纯度大于75%。4.根据权利要求1所述的体外培养基，其特征在于:所述的血清为胎牛血清、小牛血清、人血清、马血清和羊血清。5.根据权利要求1-4任一所述的体外培养基，其特征在于:用于体外培养成骨细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种体外培养成骨细胞的培养基。其特征在于：包括基础培养基10.0-15.0g/L，银耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，适量碳酸氢钠调pH值为7.2-7.6，加水定容至1L；所述的基础培养基为DMEM,α-MEM，RPMI-1640，F12，DMEM/F12；所述的银耳多糖的纯度大于75%；所述的血清为胎牛血清、小牛血清、人血清、马血清和羊血清；本发明的培养基用于体外培养成骨细胞。本发明的有益效果在于能够加快成骨细胞的生长，且能减少血清的使用量。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105567629
【申请号】CN201610065980
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月30日