一种拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米高分子材料领域，具体是一种拓朴异构酶Π杂化纳米花的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]“纳米花”属控制合成花状纳米材料，独特的形貌和卓越的性能近年来成为纳米材料领域中最新研究热点，主要应用于催化、电学、生物诊断、信息存储、分析科学等领域。三维花状结构的纳米材料由于独特的形貌和复杂的结构使其具有高比表面积、高活性、高稳定性等优于其他低维纳米材料的性质。目前，在无机纳米花的合成上面有了比较成熟的方法，但是有机-无机杂化纳米花的合成仍在探索之中，有机-无机杂化纳米花可以用于细胞成像、生物传感器、医学方法的改进等。将靶蛋白与无机离子杂化制备纳米花具有极大的挑战性，应用前景十分广阔。目前蛋白纳米花主要是通过固定化、接合、交联、自组装、螯合的方式合成，但由于蛋白质对环境的敏感性、实验结果的低重现性、提纯过程的复杂性的这些问题使蛋白杂化纳米花的合成具有很大难度。
[0003 ]拓朴异构酶能够影响DNA的空间构型动态变化来控制基因的复制、重组、表达。调节DNA的空间构型的拓朴异构酶有两种，分别是拓朴异构酶I(TopoI)、拓朴异构酶Π (TopoΠ)。拓朴异构酶是明确的抗肿瘤药物作用的靶点，一些抗癌药物正是通过抑制拓朴异构酶的DNA合成功能，从而诱导细胞的凋亡促使癌细胞凋亡。
[0004]多穗金粟兰金粟兰属植物多穗金粟兰全草。金粟兰植物多具有抗菌、抗肿瘤、增强免疫、抗病毒等活性。多穗金粟兰在传统医学中用于治疗多种癌症，疗效确切。
[0005]中草药成分复杂，低含量的有效成分筛选分离难度大。将靶蛋白制成有机-无机杂化纳米花后能很大程度的提高靶蛋白的稳定性和对有效成分的特异吸附性。使靶蛋白能在一些复杂的干扰条件下仍保持快速筛选与识别目标成分，这将极大地提高中草药中有效成分的筛选效率。由于该纳米材料具有高效、稳定和特异选择性的特点，因而具有较广的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种提高酶稳定性、有效成分筛选高效性的拓朴异构酶Π杂化纳米花的制备方法及应用，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种拓朴异构酶Π杂化纳米花的制备方法，具体制备步骤如下:
(1)用超纯水溶解CuSO4，配成浓度为115?125mmoL/L的CuSO4溶液；
(2)配置PBS缓冲液使其pH值为7.4，将20mL的上述CuS04溶液加到3L的拓朴异构酶Π-PBS缓冲液，在24?26 °C下反应3天，将反应产物用超纯水反复超声5?8次，冲洗4?6次，冷冻干燥得固体粉末，即得拓朴异构酶Π杂化纳米花(铜-拓朴异构酶杂化纳米)。
[0008]一种所述的拓朴异构酶Π杂化纳米花的应用，该拓朴异构酶Π杂化纳米花用于分离多穗金粟兰中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分的提取，其具体提取步骤如下:
(1)多穗金粟兰粗提液的制备
取多穗金粟兰粗粉18?22g，置于500mL圆底烧瓶，加240?260mL体积分数为95%的乙醇，加热回流提取55?65min，重复提取2?3次，滤过，浓缩，回收乙醇得到浸膏，少量水稀释后，用等体积的石油醚、氯仿依次萃取，用旋转蒸发仪减压回收有机溶剂，得到氯仿部位提取液，备用；
(2)固相萃取柱分离多穗金粟兰氯仿提液中的拓朴异构酶抑制有效成分
将上述得到的拓朴异构酶Π杂化纳米花(即铜-拓朴异构酶杂化纳米)采用干法装柱填充到固相萃取柱中，并用色谱纯甲醇平衡柱子;取多穗金粟兰氯仿提取液上样，用体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脱，洗脱液浓缩、干燥，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构；
(3)微型固相吸头萃取小柱分离多穗金粟兰粗提液中的拓朴异构酶抑制有效成分将上述得到的拓朴异构酶Π杂化纳米花填充到Tip吸头柱并固定，配合单道移液器，作为吸头小柱微萃取装置;先用色谱纯甲醇活化萃取材料，再用体积分数为20%甲醇溶液平衡吸头材料;吸入多穗金粟兰粗提液上样，用体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脱，洗脱液氮气吹干，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构。
[0009]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明制备的铜-拓朴异构酶杂化纳米花形貌为花型且单分散，粒径5μπι左右，适合作为萃取的填料，对拓朴异构酶抑制成分具很好的识别性能，可用于中药提取液中拓朴异构酶抑制成分的靶向筛选、分离和纯化。
[0010]与现有技术的C18键合固相萃取柱、硅胶固相萃取柱及Al2O3固相萃取柱相比，铜_拓朴异构酶杂化纳米花固相萃取柱对多穗金粟兰中具有拓朴异构酶抑制作用的有效成分具有更好的选择性。
【附图说明】
[0011 ]图1为为铜-拓朴异构酶杂化纳米花形态透射电镜图。
[0012]图2为微型固相吸头萃取小柱示意图。
[0013]图中:1-移液枪连接处;2-微孔滤膜;3-铜-拓朴异构酶杂化纳米花;4-微孔滤膜。
【具体实施方式】
[0014]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
[0015]拓朴异构酶Π杂化纳米花的制备步骤如下:
(I)用超纯水溶解CUS04，配成浓度为120mmoL/L的CuS04溶液； (2)取1.5mg GOX溶解于3mLPBS缓冲液，配置PBS缓冲液使其pH值为7.4，将20mL的上述CuS04溶液加到3L的拓朴异构酶Π -PBS缓冲液，在25°C下反应3天，将反应产物用超纯水反复超声7次，冲洗5次，冷冻干燥得固体粉末，即得。
[0016]该拓朴异构酶Π杂化纳米花用于分离多穗金粟兰中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分的提取，其具体提取步骤如下:
(1)多穗金粟兰粗提液的制备
取多穗金粟兰粗粉20g，置于500mL圆底烧瓶，加250mL体积分数为95%的乙醇，加热回流提取60min，重复提取2次，滤过，浓缩，回收乙醇得到浸膏，少量水稀释后，用等体积的石油醚、氯仿依次萃取，用旋转蒸发仪减压回收有机溶剂，得到氯仿部位提取液，备用；
(2)固相萃取柱分离多穗金粟兰氯仿提液中的拓朴异构酶抑制有效成分
称取20g上述得到的拓朴异构酶Π杂化纳米花，采用干法装柱填充到固相萃取柱中，并用色谱纯甲醇平衡柱子;取多穗金粟兰氯仿提取液ImL上样，控制流速为0.5mL/min，用2mL体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，再4mL的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩、干燥，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构；
(3)微型固相吸头萃取小柱分离多穗金粟兰粗提液中的拓朴异构酶抑制有效成分称取2mg上述得到的拓朴异构酶Π杂化纳米花，填充到1yL Tip吸头柱并固定，配合10
yL单道移液器，作为吸头小柱微萃取装置;先用色谱纯甲醇活化萃取材料，反复吸入排出色谱纯甲醇3次，再用体积分数为50%甲醇溶液平衡吸头材料;吸入多穗金粟兰粗提液1yL上样，重复3次，确保萃取材料充分吸附目标成分；用1yL体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，以及1yL的甲醇溶液洗脱，重复2次，洗脱液氮气吹干，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构。
[0017]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
【主权项】
1.一种拓朴异构酶Π杂化纳米花的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下: (1)用超纯水溶解CUS04，配成浓度为115?125mmoL/L的CuS04溶液； (2)配置PBS缓冲液使其pH值为7.4，将20mL的上述CuS04溶液加到3L的拓朴异构酶Π -PBS缓冲液，在24?26 °C下反应3天，将反应产物用超纯水反复超声5?8次，冲洗4?6次，冷冻干燥得固体粉末，即得拓朴异构酶Π杂化纳米花。2.一种如权利要求1所述的拓朴异构酶Π杂化纳米花的应用，其特征在于，该拓朴异构酶Π杂化纳米花用于分离多穗金粟兰中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分的提取，其具体提取步骤如下: (1)多穗金粟兰粗提液的制备 取多穗金粟兰粗粉18?22g，置于500mL圆底烧瓶，加240?260mL体积分数为95%的乙醇，加热回流提取55?65min，重复提取2?3次，滤过，浓缩，回收乙醇得到浸膏，少量水稀释后，用等体积的石油醚、氯仿依次萃取，用旋转蒸发仪减压回收有机溶剂，得到氯仿部位提取液，备用； (2)固相萃取柱分离多穗金粟兰氯仿提液中的拓朴异构酶抑制有效成分 将上述得到的拓朴异构酶Π杂化纳米花采用干法装柱填充到固相萃取柱中，并用色谱纯甲醇平衡柱子;取多穗金粟兰氯仿提取液上样，用体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脱，洗脱液浓缩、干燥，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构； (3)微型固相吸头萃取小柱分离多穗金粟兰粗提液中的拓朴异构酶抑制有效成分 将上述得到的拓朴异构酶Π杂化纳米花填充到Tip吸头柱并固定，配合单道移液器，作为吸头小柱微萃取装置;先用色谱纯甲醇活化萃取材料，再用体积分数为20%甲醇溶液平衡吸头材料;吸入多穗金粟兰粗提液上样，用体积分数为20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脱，洗脱液氮气吹干，即得多穗金粟兰氯仿提取液中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构。
【专利摘要】本发明公开了一种拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花的制备方法及应用，用超纯水溶解CuSO4，配成CuSO4溶液，再配制拓朴异构酶Ⅱ-PBS缓冲液，反应后将反应产物用超纯水反复超声冲洗，冷冻干燥得固体粉末。该拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花用于分离多穗金粟兰中拓朴异构酶抑制作用的抗肿瘤有效成分的提取，其具体步骤包括多穗金粟兰粗提液的制备、固相萃取柱分离以及微型固相吸头萃取小柱分离多穗金粟兰粗提液中的拓朴异构酶抑制有效成分，结合LC/MS分析确定有效成分的结构。本发明制备的拓朴异构酶Ⅱ杂化纳米花形貌为花型且单分散，粒径5μm左右，适合作为萃取填料，对拓朴异构酶抑制成分具很好的识别性能，可用于中药提取液中拓朴异构酶抑制成分的靶向筛选、分离和纯化。
【IPC分类】A61P35/00, C12N9/96, C12N9/90, A61K36/185
【公开号】CN105602926
【申请号】CN201610054030
【发明人】尹小英, 乾康, 金晨, 刘庆山, 程林, 张媛媛, 高淑婷
【申请人】尹小英
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月27日