一种高效快速适配体筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物制药领域，具体设及一种新型的高效快速适配体筛选方法。
【背景技术】
[0002] 目前，恶性肿瘤已成为严重危害人类生命健康的常见疾病，并且发展为Ξ大致死 疾病之一，研究并开发治疗恶性肿瘤疾病的药物也成为当前首要任务。细胞毒类抗肿瘤药 物是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但此类药物在杀灭或抑制肿瘤细胞的同时，也会 对机体的正常细胞(尤其是代谢旺盛的细胞)产生影响，通常在药效剂量下就会导致病人出 现不良反应，从而极大的限制了该类药物的进一步应用和发展。
[0003] 抗体偶联药物作为大分子祀向治疗的代表药物，目前已成功应用于临床治疗不同 类型的肿瘤疾病（例如CD30-MMAE和T-DM1)。但由于抗体偶联药物其价格昂贵且不稳定，其 替代药物核酸适配体(Aptamer)的研发则成为未来的必然趋势。
[0004] 核酸适配体(又称化学抗体），具有精准的祀向性。核酸适配体能够快速而有效地 分辨出祀分子结构上的细微差别，仅识别与其互补的空间结构，并与之结合，但其本身对肿 瘤细胞不具备较强的杀伤力。另外，我国已发现近几百种具有抗肿瘤活性的海洋毒素，但由 于其毒性反应过强而使药物开发中断。核酸适配体与海洋毒素偶联药物，即毒性药物与核 酸适配体相连接组成祀向适配体偶联物，可W将药物"精确"地运送到祀细胞，既有效地提 高了肿瘤局部的药物浓度，又可极大地降低体内其它组织、器官的毒性，从而达到真正祀向 增效减毒的作用。
[0005] 从随机DNA配基文库中，通过指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选Aptamers是目前Aptamers的主 要获得途径。但总结发现，目前已知的Cell-沈LEX、Protein-SELEX、CE-S化EX等筛选方法， 具有筛选周期较长、亲和性较差且失败率较高等缺点，十分不利于Aptamers的发展和应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种用于高效快速筛选适配体的方法，通过W下步骤实现： 将肥K-293T细胞种于六孔板汇总，待六孔板中肥K-293T细胞生长至90%，将第一个孔上层 培养基吸出，用洗涂缓冲液洗涂两次(缓慢加入50化1洗涂培养基，轻轻摇晃并吸出，W防细 胞脱落）；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4°C冰箱内的水平摇床上，4°C、15rpm解育 30min。然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涂两次的第二个孔中，4°C、15rpm解 育30min。方法同上，直至阴性筛选六轮后，吸出待用。将肥K-293T细胞瞬转质粒，4化后作为 阳性细胞，用洗涂缓冲液洗涂细胞两次(缓慢加入50化1洗涂培养基，轻轻摇晃并吸出，防止 细胞脱落）；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4°C、15rpm解育30min。解 育完毕后，用洗涂缓冲液，缓慢洗涂细胞Ξ次，再加入无 DNA酶水50化1，用细胞刮刀将细胞 收集入1.5ml离屯、管中。95°C加热lOmin重悬ssDNA，再13000g离屯、5min收集筛选后的ssDNA 文库。将第一轮筛选得到的ssDNA文库进行PCR扩增、酶切纯化后，干燥用做下一轮筛选文 库，循环至筛选结束，筛选出具有特异性的核酸适配体。
[0007]本发明采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细 胞进行适配体的筛选。
[000引洗涂缓冲液:4.5g Glucose，lnM MgCb 5ml，用DPBS溶解并定容至1L。
[0009] 本发明采用所述适配体筛选方法，W髓系分化抗原CD33位祀标，经过两轮的筛选， 筛选出能够特异性结合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸适配体。并且通过流式细胞术验证了 筛选出的适配体具有特异性W及高亲和性。本发明的特点是在筛选时先进行六轮阴性筛选 去除非特异性结合，再进行阳性筛选，最终快速高效地筛选出具有特异性的核酸适配体。
【附图说明】
[0010] 图1是筛选过程中每一轮文库流式细胞术亲和性评价结果。
[0011] 图2是适配体S30与S28亲和性分析。
【具体实施方式】
[0012] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0013] 实施例1:祀向髓系分化抗原CD33核酸适配体的筛选
[0014] 1、缓冲液的配置
[0015] 洗涂缓冲液(4°C保存，有效期为30天）：
[0016] 4.5g Glucose，lnM MgCb 5ml，用DPBS溶解并定容至 1L。
[0017]结合缓冲液(4°C保存，有效期为30天）：
[001 引 4.5g Glucose，lnM MgCb 5ml，100mg tRNA，lg BSA，用DPBS溶解并定容至 1L。 [0019] 2、细胞株的准备(购自中科院上海细胞库）
[0020] 阴性细胞株:HEK-293T细胞
[0021] 阳性细胞株:HEK-293T细胞瞬转CD33 4她
[0022] 3、ssDNA文库的准备
[0023] 将40D ssDNA文库稀释至50化1结合缓冲液中，满旋并于95°C加热5min后冰上骤冷 并置于冰上待用。
[0024] 4、阴性筛选(反筛）
[0025] 待六孔板中皿K-293T细胞生长至90%，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涂缓冲 液洗涂两次(缓慢加入50化1洗涂培养基，轻轻摇晃并吸出，W防细胞脱落）；再加入预处理 过的ssDNA文库，置于4°C冰箱内的水平摇床上，4°C、1虹pm解育30min。然后，将ssDNA文库从 上一个孔吸出，加入预先洗涂两次的第二个孔中，4°C、1虹pm解育30min。方法同上，直至阴 性筛选六轮后，吸出待用。
[0026] 5、阳性筛选(正筛）
[0027] 皿K-293T细胞瞬转CD33，4化后作为阳性细胞，用洗涂缓冲液洗涂细胞两次(缓慢 加入50化1洗涂培养基，轻轻摇晃并吸出，防止细胞脱落）；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库 缓慢加入阳性细胞中，4°C、1虹pm解育30min。解育完毕后，用洗涂缓冲液，缓慢洗涂细胞Ξ 次，再加入无 DNA酶水50化1，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离屯、管中。95 °C加热lOmin重悬 ssDNA，再13000g离屯、5min收集筛选后的ssDNA文库。
[002引 6、PCR扩增
[00巧]PCR反应体系(μ1):两步扩增法50^^80^^1500μ1
[0030] 扩增步骤:将50化1模板5个循环扩增至80化1。取其中50μ1再次扩增至10化1，每扩 增3个循环取样跑核酸胶，选择最优循环数。将剩余DNA作为模板按照最优循环数扩增至 1500μ1 体系。
[0031] PCR 反应体系(μ1):
[0036] 7、DNA 纯化
[0037] 收集汇总PCR反应液，对DM进行纯化。DM纯化方法同ssDNA的纯化。
[0038] 8、测量ssDNA的浓度
[0039] 9、ssDNA的制备
[0040] 酶切后，纯化ssDNA，干燥用做下一轮筛选文库。
[0041] 循环Ξ轮后，将每一轮的文库利用PCR扩增的方法带上巧光标签，收集化60细胞， 用流式细胞术检测细胞筛选时，每轮筛选后所得的DNA配基的亲和性变化。其中，灰色代表 ssDNA原始文库，蓝色、红色和绿色曲线分别代表第一、二、Ξ轮筛选后的DNA配基。结果显 示，与原始文库相比，第一轮筛选后得到的DNA配基已经有了较好的亲和性，且第二轮筛选 后得到的DNA配基的亲和性进一步提高，而第Ξ轮筛选后所得的DNA配基的亲和性不再提高 (如图1)。因此，选取第二轮作为筛选结束。通过高通量测序的方法，获得第二轮筛选文库中 的适配体序列，并按照稳定性从中挑选出S30与S28,利用流式细胞术对其亲和性进行了分 析，流式细胞术结果表明两条适配体均具有较好的亲和性(如图2)。
[0042]结果表明，经过两轮的筛选后，ssDNA文库的亲和性较第一轮有了较大的提高，并 且将第二轮筛选文库测序所得的序列也具有较好的特异性和亲和性，表明该方法能够快速 有效地获得具有较好特异性和亲和性的核酸适配体。所述核酸适配体的序列如SEQ NO. 1-5 所示：
【主权项】
1. 一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，通过以下步骤实现:将HEK-293T细胞 种于六孔板汇总，待六孔板中HEK-293T细胞生长至90%，将第一个孔上层培养基吸出，用洗 涤缓冲液洗涤两次；再加入预处理过的s s D N A文库，置于4 °C冰箱内的水平摇床上，4 °C、 15rpm孵育30min，然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4 °C、15rpm孵育30min，重复以上方法，直至阴性筛选六轮后，吸出待用;将HEK-293T细胞瞬转 质粒，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次;将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓 慢加入阳性细胞中，4°C、15rpm孵育30min，孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次， 再加入无 DNA酶水500μ1，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中，95°C加热lOmin重悬 ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库，将第一轮筛选得到的ssDNA文库进行 PCR扩增、酶切纯化后，干燥用做下一轮筛选文库，循环至筛选结束，筛选出具有特异性的核 酸适配体。2. 根据权利要求1所述的一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，洗涤缓冲液由 4.5g Glucose，lnM MgCl2 5ml，用DPBS溶解并定容至 1L。3. 根据权利要求1所述的一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，采用293T细胞 作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选。
【专利摘要】本发明提供一种高效快速筛选适配体的方法，以髓系分化抗原CD33位靶标，在筛选时先进行六轮阴性筛选去除非特异性结合，再进行阳性筛选，筛选出能够特异性结合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸适配体。并且通过流式细胞术验证了筛选出的适配体具有特异性以及高亲和性。本发明方法设计合理，采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选，最终快速高效地筛选出具有特异性的核酸适配体。
【IPC分类】C40B30/04, C12N15/115, C12N15/10
【公开号】CN105671050
【申请号】CN201610201681
【发明人】那仁满都拉, 杨畅, 付玉洁, 黄萍, 葛明华
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月31日