一种红铃虫抗性基因aq65检测引物组、试剂盒及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测技术领域，具体而言，本发明设及一种红铃虫抗性基因 AQ65检测 引物组、试剂盒及使用方法。
【背景技术】
[0002] 中国是世界上最大的棉花生产国，自1997年种植转化基因棉花W来，现全国年种 植面积已达550万hm2,在全世界居第二位，仅次于印度。根据中棉所、全国优质棉科技服 务项目组2007年对全国16个产棉省(市区）的调查结果，全国棉花播种品种471个，其中转基 因抗虫棉157个，占全部品种的33.3%，其播种面积占总播种面积的66.1%。但值得注意的 是，在运些转基因棉花品种中，除少数品种外为转化ylA+CpTI双价抗虫棉外，绝大多数品种 都为转单价Bt基因棉。而且在157个转基因抗虫棉品种中，除了其中4个为美国引进品种，其 他几乎所有品种的基因来源高度集中，基本都是CrylA基因。按照科学规律，单价抗虫棉在 大田生产上一般只能安全应用8~10年，而转基因抗虫棉在中国种植时间已达10多年，红铃 虫对化基因产生抗性的风险已越来越大。因此鉴定田间祀标昆虫对化棉花产生的抗性基因 类型、监测其抗性基因频率的变化，有助于及时掌握田间种群对化棉化的抗性发展情况，研 究与制定合理的抗性治理措施，W延缓害虫对化棉花抗性的产生。
【发明内容】
[0003] 红铃虫对化蛋白产生抗性目前已知的主要表现为巧粘蛋白基因突变。从基因 BANK 中可W查知，红铃虫的突变类型已达到了23种(见表1)。近年来，我们从长江流域田间种群 中筛选并纯化出一个红铃虫Cry 1 Ac抗性品系，即AQ6 5品系（cDNA : KU2 54193 ; gDNA : KU254195)，该抗性品系由巧粘蛋白基因突变导致红铃虫对化ylAc蛋白不敏感。具体突变情 况如下：与敏感品系红铃虫(AS)(登陆号:AY198374.1)相比，AQ65品系红铃虫巧粘蛋白的基 因组序列插入284个碱基，导致其cDNA序列第3195~3236、3252~3284、3295~3298的79个 碱基缺失，提前引入终止密码，导致蛋白翻译提前终止(见图1)。经基因序列比对表明，该突 变基因与基因 BANK中已注册的红铃虫所有巧粘蛋白基因均不相同，故其为一种新的抗性基 因。
[0004] 表1基因 BANK中已注册的红铃虫巧粘蛋白抗性基因种类
[0005]
[0006] 为检测红铃虫田间种群中存在的该突变体，我们开展了该基因的分子检测技术研 究。根据AQ65品系与敏感品系(AS)巧粘蛋白基因组序列的差异，我们设计出一对特异性引 物用于检测抗性基因（AQ65F: TGGCTTCGGTAAAGACGCTAT，AQ65R: TGGGATTACGGGCGTGAGT)，用 该引物对AQ65抗性个体(含抗性杂合子和抗性纯合子)进行PCR扩增，结果表明，所有AQ65抗 性个体均能扩出833bp的目标片段，而AS敏感品系均不能扩出片段(扩增条件见图2)。
[0007] 同时，我们还设计了另外一对特异性引物(4965。2:5乂44了664446〔4圳64466〔3'， AQ65R2:5'GCTGGAGAAGAAATGGCAAGA 3 '），用于区别在含有AQ65抗性基因个体的条件下，该 个体是杂合子还是纯合子。用上述引物(AQ65F，AQ65R)检测出含有抗性基因的个体后，再用 特异性引物(AQ65F2，AQ65R)进行扩增，杂合子个体均能扩出两条目标片段，分别为774bp与 49化P，而抗性纯合个体则只能扩出一条774bp的目标条带。
[0008] 该结果表明，所设计的两对引物能很好地检测出AQ65品系中抗性基因的存在，并 确认它们的存在状态(纯合还是杂合），故可用于生产实践(具体方法附后）。参见附图3
[0009] 所述AQ65抗性基因的分子检测方法可用于检测红铃虫田间种群中具有上述突变 类型的抗性基因个体。
【附图说明】
[0010] 图1是AQ65品系抗性基因结构及其与敏感品系序列对比图；
[OOW 图2是AQ65基因分子检测电泳图；
[0012]图3是AQ65杂合子分子检测电泳图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，W使本领域的技术人员可W 更好的理解本发明并能予W实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0014] 1、实验试剂与仪器
[001引实验试剂:dm提取试剂盒购于北京天根生物科技公司。LATaq DNA聚合酶与dNTP 均购于宝生物工程(TaKaRa)大连有限公司。
[0016]实验仪器:普通PCR仪购于东胜创新科技有限公司，凝胶成像仪购于美国伯乐Bio- Rad公司 ，电泳仪购于北京六一仪器厂。
[0017] 2、特异引物
[0018] 引物一：用于检测红铃虫田间种群中是否存在已知类型的抗性基因突变(包含抗 性纯合子和抗性杂合子）
[0019] 上游引物 AQ65F: TGGCTTCGGTAAAGACGCTAT，
[0020] 下游引物 AQ65R: TGGGATTACGGGCGTGAGT
[0021] 引物二:用于确认检测到的抗性突变个体是杂合状态还是纯合状态
[0022] 上游引物AQ65F2:5 'CAATGGAAAGCACTGAAGGC 3 '，
[0023] 下游引物AQ65R2:5'GCTGGAGAAGAAATGGCAAGA 3'。
[0024] 3、实验条件
[0025] 1)基因组DNA样品制备
[0026] 样品来源：田间采集到的红铃虫个体。为了检测出单头红铃虫的巧粘蛋白基因是 否含有AQ65抗性基因及其基因型，我们采用单头提取的方法，即单头红铃虫提取的基因组 DNA为一个检测样本。红铃虫基因组DNA的提取使用天根公司（Tiangen Biotech Co.，Ltd) 生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离屯、柱型）。实验操作具体步骤按照试剂盒 说明书进行。
[0027] 2)PCR 检测
[002引引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。W提取的基因组DNA为模板，用设计 的引物进行PCR扩增。用引物(AQ65F，AQ65R)和(AQ65F2，AQ65R)进行PCR反应，其扩增的参数 如下:94°C预变性2min;然后为35个循环，循环条件为:94°C变性30s，接着55°C退火30s，再 72 °C延伸Imin;最后72 °C保溫lOmin. PCR反应体系为25化，如下所示：
[0029] 取出PCR反应所需试剂及保存的DNA样品于冰上解冻，Taq酶应现用现取，且用完后 需马上放回-20°C保存，从而延缓酶活性的损失。反应液中各组分的比例如下：
[0030]
[0031] PCR反应结束后，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，于凝胶成像仪拍摄电泳图， 根据特异引物扩增的目标条带判断是否含有AQ65品系的抗性等位基因。
[0032] 4、结果与判断
[0033] 上述两对引物可用W检测红铃虫田间种群个体是否含有AQ65突变基因及其基因 型。首先用引物一(AQ65F/AQ65R)对红铃虫田间种群个体的基因组DNA进行扩增，如扩增产 物中能检测出833bp的目标片段，表明该个体为含AQ65突变基因的抗性个体，而未检测出该 目标片段，则表明该个体中不含AQ65抗性基因。其次，将上述检测含有AQ65抗性基因的田间 个体基因组DNA用引物二(AQ65F2/AQ65R2)再次扩增，如扩增产物中仅能检测出774bp的目 标片段，表明该个体为含AQ65突变基因的纯合个体;如扩增产物中能检测出774bp与490bp 两个目标片段，则为含AQ65突变基因的杂合个体。
[0034] W上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围W权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种红铃虫抗性基因 AQ65检测引物组，其特征在于，包括下述引物：2. -种红铃虫抗性基因 AQ65检测试剂盒，其特征在于，包括：由DNA提取液，PCR反应液， 标准阳性模板，阴性质控标准品，权利要求1所述引物组。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括LATaq酶、10 X LA Taq缓 冲液(Mg2+Plus)、dNTPs和无菌双蒸水。4. 权利要求2所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下述步骤： 1) 基因组DNA样品制备； 2. PCR检测； 其中所述试剂盒包括DNA提取液，标准阳性模板，阴性质控标准品，PCR反应液，引物组。5. 根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，包括下述步骤： 1) 基因组DNA样品制备 样品来源：田间采集到的红铃虫个体，采用单头提取的方法，即单头红铃虫提取的基因 组DNA为一个检测样本，红铃虫基因组DNA的提取使用天根公司（Tiangen Biotech Co.， Ltd)生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型），实验操作具体步骤按照试 剂盒说明书进行； 2. PCR检测 引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。以提取的基因组DNA为模板，用设计的引 物进行PCR扩增，用引物(AQ65F，AQ65R)和(AQ65F2，AQ65R)进行PCR反应，其扩增的参数如 下:94°C预变性2min;然后为35个循环，循环条件为:94°C变性30s，接着55 °C退火30s，再72 °C延伸lmin;最后72 °C保温lOmin. PCR反应体系为25yL，如下所示： 取出PCR反应所需试剂及保存的DNA样品于冰上解冻，Taq酶应现用现取，且用完后需马 上放回-20°C保存，从而延缓酶活性的损失，反应液中各组分的比例如下：PCR反应结束后，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，于凝胶成像仪拍摄电泳图，根据 特异引物扩增的目标条带判断是否含有AQ65品系的抗性等位基因。
【专利摘要】本发明涉及一种红铃虫抗性基因AQ65检测引物组、试剂盒及使用方法，由DNA提取液，PCR反应液，标准阳性模板、红铃虫基因特异性引物、阴性质控标准品组成。可用于检测红铃虫田间种群中具有上述突变类型的抗性基因个体。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671193
【申请号】CN201610227705
【发明人】王玲, 万鹏, 吴孔明, 王金涛, 丛胜波, 许冬, 黄民松
【申请人】湖北省农业科学院植保土肥研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月13日