一种芸香苦素类化合物及其在制备抗ebv药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种芸香苦素类化合物，所述化合物结构式如式(I)所示。本发明进一步提供上述化合物在制备抗EBV药物中的应用，本发明所提供的化合物对EB病毒的裂解复制均具有较好的抑制作用，且对宿主细胞毒性较小，具有一定的安全性，可应用于制备抗EBV药物。
【专利说明】
一种芸香苦素类化合物及其在制备抗EBV药物中的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于中药活性成分和药物技术领域，更具体地，涉及一种芸香苦素类化合 物及其在制备抗EBV药物中的应用。
【背景技术】
[0002] EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)是一种4型人类疱疹病毒（HHV-4)，属于y亚 型。1964年，Epstein和Barr最先从非洲儿童恶性淋巴瘤--伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma)体外培养的肿瘤组织中分离出EBV JBV是人类发现的第一个与人类癌症密切相 关病毒。在全球范围内，有95 %以上的成人感染过EBV，EBV通常通过唾液传播，一经感染，会 维持终身持续感染且无法清除。同时，现在研究认为人类癌症中至少有1 %是由EBV的感染 引起的，位于癌症致病因子的第四位，世界卫生组织将其列为人类致癌病毒。目前发现与 EBV相关的人类疾病有慢性活动性EBV感染、传染性单核细胞增多症、口腔粘状白斑、10 %的 胃癌、EBV相关嗜血淋巴组织细胞增生症、Burkitt's淋巴瘤、何杰金病和鼻咽癌等。虽然，经 过近50年的研究，已有一些广谱的抗病毒类药物进入临床，但这类药物对EBV感染及其相关 疾病疗效较差，且毒性较大，迄今并没有针对EBV感染及其相关疾病的特效药。因此，迫切需 要寻找特异性抑制EBV的药物以改善EBV相关恶性疾病的治疗效果。
[0003] 天然产物芸香苦素 (rutamarin)可抑制EBV的裂解复制，但其活性、溶解性及毒性 亦不够理想，且在天然产物中的含量很低，难以大量获得，而全合成步骤较多，费时费力。从 臭草中可分离得到大量的去乙酰芸香苦素，对其进行结构优化，以期获得抗EBV活性好、毒 副作用低和溶解性好的芸香苦素衍生物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种芸香苦素类化合物。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述芸香苦素类化合物在制备抗EBV药物中的应用。
[0006] 本发明通过以下的技术方案实现上述技术目的：
[0007] 本发明提供了一种芸香苦素类化合物，所述化合物结构式如式(I)所示：
[0009] 其中，R为NH-(CH2)nR^0-(CH2)nR1:n为1、2、3、4或5也为胺基、氰基、齒基、羟基、 醋基、苯基、卤代苯基、杂环基。
[0010] 本发明基于芸香苦素骨架，设计并合成了一类新的芸香苦素类化合物，并发现所 合成的化合物对EBV的裂解复制具有抑制作用。
[0011] 优选地，R任选自：
[0013] 优选地，R任选自
[0014]本发明进一步提供上述化合物的制备方法，包括在氮气保护下，将去乙酰化芸香 苦素与三光气反应，再与胺类或醇类化合物反应得到所述化合物。
[0015] 优选地，所述胺类化合物结构通式为NH2-R，所述醇类化合物结构通式为R-OH。 [0016]本发明针对合成的芸香苦素衍生物进行了抗EBV活性研究。其中，化合物4n和4p两 个化合物的IC5Q小于lyM，化合物4m的IC 5Q值为1.50yM，明显好于右旋芸香苦素，且上述3个 化合物的毒性低，SIe值明显优于芸香苦素，且与专利201210578973.4中的化合物相比，其 活性最高增强了 20倍，毒性最低减少了 40倍，显示出高效低毒的活性，具备较好的成药前 景。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0018] 本发明提供的化合物对EBV的裂解复制具有抑制作用，且高效低毒，溶解性好，所 述化合物制备简单，原料易得，可制备成抗EBV药物，具有很高的医学价值。
【附图说明】
[0019] 图1为化合物4m抑制EBV裂解复制活性及细胞毒性曲线图。
[0020] 图2为化合物4n抑制EBV裂解复制活性及细胞毒性曲线图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、 设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0022]实施例1:去乙酰化芸香苦素的制备
[0023]将新鲜的臭草枝叶（20kg)风干，切碎后用95 %乙醇（3 X 40L)室温下浸提四次，每 次48小时。浸提液合并后减压浓缩至浸膏状。将得到的浸膏（1.58kg)用适量水（1L)混悬后， 用二氯甲烷（3 X4L)萃取，然后浓缩得到二氯甲烷部分浸膏（375g)。首先，二氯甲烷部位 (375g)，用少量溶剂溶解样品，加入1.5倍粗硅胶，经硅胶拌样旋干后上大的硅胶柱(60mmX 800mm)，以石油醚 / 乙酸乙酯（1:0，100.:1，20:1，9:1，3 :1，1:1，1:3,0:1)梯度洗脱得到 6 个 部分（A-F)。从B部分展开分离，将B部分（44g)过MCI CHP20P色谱柱，以甲醇/水（30%-100% )梯度洗脱分别得到3个小组分(B1-B3)。3个小组分经过多次正向硅胶柱层析（以石油 醚/氯仿体系冲洗)后得到去乙酰化芸香苦素(3.2g)。
[0024]实施例2芸香苦素类化合物(化合物4a_4p)的制备
[0025] 在氮气保护下，将去乙酰化芸香苦素（20.711^，0.066111111〇1)、三光气（6.511^， 0.022mmo 1)和DMAP(24.2mg，0.198mmo 1)加进2.5mL干燥的二氯甲烷中。混合物在室温下搅 拌约15分钟(溶液变澄清)后，加入相应的胺类化合物或者醇类化合物(0.066mmol)，搅拌过 夜。混合物用10mL二氯甲烷稀释后分别用pH为1的稀盐酸和水各萃取三次。有机层用硫酸钠 干燥，过滤，滤液在减压下旋干。残渣经柱层析分离纯化得到芸香苦素类化合物4a-4p。所述 的芸香苦素类化合物 [0026]的合成路线为：
[0028]通过上述合成路线制备得到了多种芸香苦素类化合物，将其中部分产物分别编号 为化合物4a_4p，其产率及氢谱分析见表1。
[0029]表1芸香苦素类化合物分析
[0034]注:表中结构部分的曲线之前代表相同的结构，曲线后面代表R在结构通式（I)的 取代位置。下表同。
[0035]实施例3化合物4a_4o抗EBV活性的测定：
[0036] 1、细胞培养。体外培养P3HR-1细胞(原发性渗出性淋巴瘤细胞系，含有潜伏感染期 EBV)。使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37°C，5%二氧化碳浓度条件下进行常 规维持培养和传代。
[0037] 2、药物干预。调整对数生长期P3HR-1细胞密度为3X105cells/ml，使用20ng/ mlTetradecanoyl phorbol acetate(TPA)诱导P3HR-1细胞进入裂解复制期。使用DMS0将待 测化合物配置为不同浓度的药物溶液。P3HR-1细胞经TPA处理3小时后，对细胞进行不同浓 度的化合物(芸香苦素和化合物4a-4p)处理，每个浓度设3个平行复孔，并设不进行TPA诱导 和不经化合物处理的对照组进行比较。
[0038] 3、测试方法。P3HR-1细胞经TPA诱导2天后收集细胞，提取细胞总DNA。应用实时定 量PCR技术，使用LightCycler FastStart DNA MasterPlus SYBR green试剂盒、EBNA1 引物 和GAPDH引物（引物序列需要放在说明书最后，单独成页，并提交光盘形式的序列格式，下 同）分别检测上述细胞总DNA中EBNA1和GAPDH的拷贝数，并计算EBNA1 /GAPDH的相对比值。 [0039] 4、结果处理。按照公式：EBV裂解复制相对抑制数=(￡8麻1/^?0册叫 +&。。__1+- EBNA1 /GAPDHTPA-&compound+ )/ (EBNA1 /GAPDHTPA+&compound-EBNAI/GAPDHtPA-&compound-)，计算各化合 物在不同浓度下的EBV裂解复制相对抑制数。以EBV相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐 标绘制各化合物对EBV裂解复制的抑制曲线，并计算各药物的复制半数抑制剂量(IC 5Q)以评 价各化合物对EBV裂解复制的抑制活性，结果见表2 [0040]实施例4对宿主细胞毒性测试：
[0041 ]对数生长期的P3HR-1细胞，不加诱导剂，直接加入不同梯度的药物，加药后2天或 者5天用台盼蓝染色细胞计数的方法计算细胞的毒性。台盼蓝染色机理是正常的活细胞，胞 膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性的细胞，胞膜的通透性增 加，可被台盼蓝染成蓝色。操作步骤为：
[0042] 1)细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以1:1混合混匀。
[0043] 2)在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
[0044] 3)统计细胞活力：活细胞率（％ )=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数）X 100%〇
[0045] 4)计算CC5 〇 ( 5 0 %细胞毒性浓度）时Y轴的值的计算公式为=NON I NDUCEx/ NONINDUCEo。)(代表的是加了不同梯度的药物，0代表的是没有加药物。另按照公式:选择抑 制常数(SI)=CC5Q/IC5Q计算各化合物的选择抑制常数，以评价各化合物的用药安全性。结 果见表2
[0046]表2芸香苦素类化合物抗EBV活性及毒性
[0050]对合成的芸香苦素衍生物进行了抗EBV活性研究。测试结果发现4k与4〇两个化合 物的IC5Q与芸香苦素相当。4n和4p两个化合物的IC5Q小于liiM，明显好于右旋芸香苦素，化合 物4n抗EBV活性达到0.32yM，选择性指数为211，显示高效低毒的活性。化合物4m毒性小，选 择性指数为801。
【主权项】
1. 一种芸香苦素类化合物，其特征在于，所述化合物结构式如式(I)所示：其中，R为MHCftOnR^O-KftOnRnn为1、2、3、4或5;Ri为胺基、氰基、卤基、羟基、酯基、 苯基、卤代苯基、杂环基。2. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R任选自：/3. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R任选自4. 一种权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，在氮气保护下，将去乙酰化 芸香苦素与三光气反应，再与胺类或醇类化合物反应得到所述化合物。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胺类化合物结构通式为NH2-R，所 述醇类化合物结构通式为R-OH。6. 权利要求1所述的化合物在制备抗EBV药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料或载 体。
【文档编号】A61K31/5375GK105820173SQ201610262207
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】徐峻, 林永胜, 王倩, 顾琼, 袁岩, 江程
【申请人】中山大学