传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，包括如下步骤，第1步是获取高免卵黄抗体：首先用多个免疫剂量的鸡法氏囊油乳剂灭活苗皮下注射获取基础免疫，其次加强免疫，然后再强化免疫并维持。第2步是提取卵黄液。第3步是卵黄免疫球蛋白去脂分层。第4步是提取卵黄抗体。本发明中将蛋鸡经多次免疫后，抗体水平提高。鸡蛋传染性法氏囊抗体水平效价达到 10lg2 以上，试验结果显示免疫后抗体水平1-5天上升较慢，在免疫后的10-15天抗体水平上升较快。
【专利说明】
传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺
技术领域
[0001] 本发明涉及禽类生物药制剂技术领域，具体涉及一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋 白优化提取工艺。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性法氏囊病（IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒引起的幼鸡一种急性、高度接 触性传染病，本病主要侵害雏鸡，以4-6周龄的鸡最易感，主要侵害鸡的体液免疫中枢器官 之一一法氏囊，使鸡法氏囊的淋巴细胞生产受到破坏，不能产生免疫球蛋白，导致免疫功 能降低，还容易伴发或继发其它疾病。
[0003] 抗体（antibody)是机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖 分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。禽的免疫系统包 括初级器官(法氏囊和胸腺）和次级器官(脾、淋巴结、骨髓等)，骨髓是胸腺和法氏囊的干细 胞来源，法氏囊是禽类B细胞分化成熟的器官。外来抗原刺激鸡体后法氏囊内的B细胞分 化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体在卵细胞中 逐渐大量蓄积，形成卵黄抗体。研究表明，血清中IgG (抗体）的含量与卵黄中IgY的含量 基本相同，每个卵黄含IgY高达100mg，所以提取卵黄中抗体，能有效治疗传染性疾病。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，用于提取卵 黄中抗体，有效治疗传染性疾病。
[0005] 采用如下技术方案：一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，包括如下 步骤： 第1步，获取高免卵黄抗体： (1) 基础免疫，用多个免疫剂量的鸡法氏囊油乳剂灭活苗皮下注射； (2) 加强免疫，在基础免疫后10天，以1BD弱毒苗用同样剂量和方法进行再次接种，同 时皮下接种1BD油乳剂灭活苗，lml /只； (3) 强化免疫，在加强免疫后10天，用IBD油乳剂灭活苗再次进行皮下接种，各2ml / 只； (4) 维持免疫在强化免疫后10天，根据抗体效价，每1~1. 5个月再次加强免疫1次； 从第3次免疫后10天开始定期分别用琼脂扩散试验，检测IBD抗体效价，IBD抗体效价为 1:256合格，合格后后即可收集高免蛋制备二联高免卵黄抗体液； 第2步，提取卵黄液： 免疫前鸡所产的蛋作为阴性对照；首次免疫后开始每日收集鸡蛋并编号，4°C保存；取 收集的高免蛋用清水擦拭，清除蛋壳上的污物，用〇. 1%新洁尔灭溶液浸泡消毒，取出晾干 后，在无菌条件下用蛋黄分离器分离蛋清和蛋黄，留取蛋黄用灭菌蒸馏水反复冲洗蛋黄表 面，用滤纸吸取表面多余的水分，用针头刺破蛋黄膜，分离出卵黄，放置于干净容器中； 第3步，卵黄免疫球蛋白去脂分层； 卵黄免疫球蛋白去脂分层方法为：每份取25ml卵黄液，1 :4倍体积的PH7. 4 PBS稀释 卵黄液，离心30分钟，丢弃沉淀，在上清液中分别加入终浓度为0. 6%-2. 5%的硫酸葡聚糖搅 拌10min，25°C静置分层。
[0006] 或者，卵黄免疫球蛋白去脂分层方法为：按照1.5%-4. 5% PEG6000的比例添加， 每个稀释比例所用卵黄体积均为25ml，卵黄液1 :4倍体积PH7. 4 PBS稀释，按比例加入稀 释液后，用盐酸调节溶液至PH5. 0,搅拌10min，25°C静置分层。
[0007] 或者，卵黄免疫球蛋白去脂分层方法为：取25ml卵黄液，用蒸馏水1:6-1 :9比例 稀释，用lmol/L的盐酸调节溶液至pH 5. 2,25°C静置分层。 第4步，提取卵黄抗体：调整卵黄抗体溶液pH7. 4,依据粗提物中蛋白组分在不同浓度 盐溶液中的溶解度不同，进行分级沉淀，得到纯度较高的IgY。
[0008] 第一：分别选取50%和33%饱和度的硫酸铵分级沉淀卵黄免疫球蛋白；将粗提液 中加入50%饱和度的硫酸铵溶液，沉淀，离心，将沉淀溶解，加入33%饱和度硫酸铵溶液，沉 淀，离心，将沉淀重新溶解到25ml测其抗体的效价； 第二：分别选取20%，36%浓度的硫酸钠进行分级沉淀；在粗提液中加入20%的硫酸钠 离心，丢弃上清，将沉淀重新溶解，加入36%硫酸钠溶液，沉淀，离心，将沉淀重新溶解到 25ml测其抗体的效价。
[0009] 对两种方法提取的抗体进行SDS-PAGE电泳纯度检测。
[0010] 以上方案具有如下效果： 1、蛋鸡经多次免疫后，抗体水平提高。鸡蛋传染性法氏囊抗体水平效价达到101g2以 上，试验结果显示免疫后抗体水平1-5天上升较慢，在免疫后的10-15天抗体水平上升较 快。
[0011] 2、通过两种不同的盐进行分级盐析，硫酸钠提取抗体的效价为8/8/9,硫酸铵提取 抗体的效价7/7/9。
[0012] 3、1. 2%硫酸酯葡聚糖组获得的上清液传染性法式囊效价与3. 5%PEG6000组上清 液效价相同，高出1:8水稀释法2 Lg2,蛋白质含量从中可以得出1.2%硫酸酯葡聚糖提取 法更高，所以1. 2%硫酸酯葡聚糖提取卵黄效果较好，并且，硫酸葡聚糖对身体不但无毒副 作用，而且起到很好的增强免疫力作用。操作简单，符合便捷有效的生产理念。
[0013] 4、采用不同沉降脱脂方法提取样品的蛋白条带效果相同，提取方法对IgY的纯度 没有明显差异。但硫酸钠提取的抗体效价稍高，而且有害离子很少。
【附图说明】
[0014] 图1是采用两种不同的盐进行分级盐析的纯度检测图。
【具体实施方式】 [0015] 1、试验材料 1. 1试验动物 本实验选用开产不久、产蛋正常且身体健壮的母鸡20只，均未经任何免疫，经AGP检测 IBD为阴性。
[0016] 1.2免疫鸡用疫苗 首免：鸡传染性法氏囊油乳剂灭活苗(荷兰英特威） 加强免疫：IBD二价弱毒细胞苗(荷兰英特威） 1. 3检测试剂 IBD (AGP)抗原、阳性血清。
[0017] 2、试验方法 2. 1高免方法 (1)基础免疫用10个免疫剂量的鸡法氏囊油乳剂灭活苗皮下注射。
[0018] (2)加强免疫在基础免疫后10天，以1BD弱毒苗用同样剂量和方法进行再次接 种，同时皮下接种1BD油乳剂灭活苗，lml /只。
[0019] (3)强化免疫在加强免疫后10天，用IBD油乳剂灭活苗再次进行皮下接种，各 2ml / 只。
[0020] (4)维持免疫在强化免疫后10天，根据抗体效价，每1~1. 5个月再次加强免疫1 次。从第3次免疫后10天开始定期分别用琼脂扩散（AGP)试验，检测IBD抗体效价，IBD 抗体效价为1:256合格，合格后后即可收集高免蛋制备二联高免卵黄抗体液。
[0021] 3.提取卵黄抗体工艺的优化 3. 1.卵黄液提取 免疫前鸡所产的蛋作为阴性对照。首次免疫后开始每日收集鸡蛋并编号，4°C保存。取 收集的高免蛋用清水擦拭，清除蛋壳上的污物，用0.1%新洁尔灭溶液浸泡消毒，取出晾 干后，在无菌条件下用蛋黄分离器分离蛋清和蛋黄，留取蛋黄用灭菌蒸馏水反复冲洗蛋黄 表面，用滤纸吸取表面多余的水分，用针头刺破蛋黄膜，分离出卵黄，放置于一干净带刻度 的容器中。
[0022] 3. 2卵黄免疫球蛋白去脂方法的优化 (1)硫酸葡聚糖不同浓度对去脂的影响每份取25ml卵黄液，1 :4倍体积的PH7. 4 PBS 稀释卵黄液，离心30分钟，丢弃沉淀，在上清液中分别加入终浓度为0. 6%、1. 2%、1. 8%、 2. 5%的硫酸葡聚糖搅拌lOmin，25°C静置观察，每个浓度比例做3个重复。观察记录出现分 层的时间、上清液体积、清澈程度、上清液的抗体效价、蛋白质含量等指标。
[0023] (2) PEG沉淀脂肪研究PEG6000不同的添加比例对卵黄抗体的提取影响，按照 1. 5%、2. 5%、3. 5%、4. 5% PEG6000的比例添加，每个稀释比例所用卵黄体积均为25ml，卵 黄液1 :4倍体积PH7. 4 PBS稀释，按比例加入稀释液后，用盐酸调节溶液至PH5. 0,搅拌 10min，25°C静置观察，每个浓度比例做3个重复。观察记录出现分层的时间、上清液体积、 清澈程度、上清液的抗体效价等指标，检测蛋白质的含量。
[0024] (3)水稀释法去脂取25ml卵黄液，用蒸馏水1:6、1:7、1 :8、1 :9比例稀释，用 lmol/L的盐酸调节溶液至pH 5. 2,每个比例3个重复，25°C静置观察，分离高脂肪含量卵 黄抗体，观察记录出现分层的时间、上清液体积、清澈程度、上清液的抗体效价等指标。
[0025] 3.3卵黄抗体提取的比较 调整卵黄抗体溶液PH7. 4，依据粗提物中蛋白组分在不同浓度盐溶液中的溶解度不同， 进行分级沉淀，可得到纯度较高的IgY。
[0026] (1)分别选取50%和33%饱和度的硫酸铵分级沉淀卵黄免疫球蛋白。将粗提液中 加入50%饱和度的硫酸铵溶液，沉淀，离心，将沉淀溶解，加入33%饱和度硫酸铵溶液，沉淀， 离心，将沉淀重新溶解到25ml测其抗体的效价。
[0027] (2)分别选取20%，36%浓度的硫酸钠进行分级沉淀。在粗提液中加入20%的硫酸 钠离心，丢弃上清，将沉淀重新溶解，加入36%硫酸钠溶液，沉淀，离心，将沉淀重新溶解到 25ml测其抗体的效价。
[0028] 对两种方法提取的抗体进行SDS-PAGE电泳纯度检测。
[0029] 3. 4抗体效价检测 琼指扩散试验法测定抗体效价 用去离子水配制1%的琼脂，待琼脂加热融化，倒约2_厚的平板，凝固后在琼脂板上打 直径为3mm的梅花孔。在梅花孔的中央孔加入IBDV抗原液，其它孔依次加入不同稀释倍数 的卵黄提取液或血清。根据沉淀线出现的情况判定抗体效价。
[0030] 4?试验结果 (1) 蛋鸡经3次免疫后，抗体水平鸡蛋传染性法氏囊抗体水平效价达到101g2以上， 试验结果显示免疫后抗体水平1-5天上升较慢，在免疫后的10-15天抗体水平上升较快，抗 体效价检测结果详见表1。
[0031] 表1免疫后机体抗体变化情况
(2) 不同去脂方法对去脂效果的影响 (I)不同浓度硫酸酯葡聚糖对去脂效果的影响 将同一批高免蛋分离卵黄，混匀卵黄液，用不同浓度硫酸酯葡聚糖提取卵黄抗体，观察 感官特性并测抗体效价和蛋白质浓度，结果见表2 表2不同浓度硫酸酯葡聚糖对去脂效果的影响
对照组常温下没有出现分层，其余各组均出现明显的分层，上清液清澈。可以看出，随 着硫酸酯葡聚糖浓度的增大，卵黄抗体水溶液逐渐澄清，颜色逐渐变淡。
[0032] 1. 2%为不影响效价的浓度范围，当硫酸酯葡聚糖浓度增加到1. 8%及以上时，抗 体效价有所下降。
[0033] ( II )PEG6000浓度对卵黄抗体提取的影响 将同一批高免蛋分离卵黄，混匀卵黄液，用不同浓度PEG6000提取卵黄抗体，测抗体效 价并观察感官特性。综合考虑提取液的澄清度和效价，PEG终浓度3. 5%的效果最好。故 确定3. 5%的PEG浓度为最佳浓度。结果见表3. 表3 PEG6000浓度对卵黄抗体提取的影响
(III)水稀释法去脂对卵黄抗体提取的影响 1:7-1:10稀释出现明显的分层，但1:7、1:8稀释上清液脂肪含量较高，1:9稀释上清 液较清澈，沉淀不结实不利于操作，总体比较1:9水稀释法提取去脂率较高，上清清澈，利 于生产应用，但是抗体滴度下降较多，结果见表4. 表4.水稀释法去脂对卵黄抗体提取的影响
(祕）四种卵黄抗体去脂方法比较结果 将同一批高免蛋分离卵黄，混匀卵黄液，分别用不同的方法1. 2%的硫酸葡聚糖，3. 5% 的PEG，1:8水稀释法提取卵黄抗体，测抗体效价和蛋白质浓度。结果见表5。
(3)通过两种不同的盐进行分级盐析，硫酸钠提取抗体的效价为8/8/9,硫酸铵提取抗 体的效价7/7/9,纯度检测图1。
[0035] 可以看出两种方法提取的抗体纯度差别不大，都有一条位于44KD位置附近的杂 带，从图上比较发现含量较少，但是主要集中在66KD条带。
[0036] 5分析讨论 5.1三种卵黄免疫球蛋白去脂方法的比较 硫酸酯葡聚糖浓度为1. 2%时，上清液清澈，呈乳白色，说明去脂效果比较好，其上清液 体积平均为76,效价101g2,沉淀结实。PEG在3%和3. 5%时其效价相同，但是3. 5%时的体 积明显高于3%，而且上清液为乳白色，说明去脂效果明显。水稀释法中，1:7不透明、1:8稀 释上清液发黄，1:9上清液较为清澈，说明1:9水稀释法去脂率较高，各组沉淀均不结实， 不利于生产应用，另外，抗体滴度下降较多，最后卵黄免疫球蛋白浓缩较困难。
[0037] 三种方法进行比较，1.2%硫酸酯葡聚糖组获得的上清液传染性法式囊效价与 3. 5%PEG6000组上清液效价相同，高出1:8水稀释法2 Lg2,蛋白质含量从中可以得出1. 2% 硫酸酯葡聚糖提取法更高，所以1. 2%硫酸酯葡聚糖提取卵黄效果较好，并且，硫酸葡聚糖 对身体不但无毒副作用，而且起到很好的增强免疫力作用。操作简单，符合便捷有效的生产 理念。
[0038] 5.2 IgY的纯度分析 IgY的分子量为180KD，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳，IgY的二硫键打 开，分成分子量65~70KD的重链和分子量为22~30KD的轻链。可以看出，2种不同沉 降脱脂方法提取样品的蛋白条带没有明显的区别。2种提取方法对IgY的纯度没有明显差 异。但硫酸钠提取的抗体效价稍高，而且有害离子很少。
【主权项】
1. 一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，其特征在于，包括如下步骤： 第1步，获取高免卵黄抗体： (1) 基础免疫，用多个免疫剂量的鸡法氏囊油乳剂灭活苗皮下注射； (2) 加强免疫，在基础免疫后10天，以1BD弱毒苗用同样剂量和方法进行再次接种，同 时皮下接种1BD油乳剂灭活苗，lml /只； (3) 强化免疫，在加强免疫后10天，用IBD油乳剂灭活苗再次进行皮下接种，各2ml / 只； (4) 维持免疫在强化免疫后10天，根据抗体效价，每1~1. 5个月再次加强免疫1次； 从第3次免疫后10天开始定期分别用琼脂扩散试验，检测IBD抗体效价，IBD抗体效价为 1:256合格，合格后后即可收集高免蛋制备二联高免卵黄抗体液； 第2步，提取卵黄液： 免疫前鸡所产的蛋作为阴性对照；首次免疫后开始每日收集鸡蛋并编号，4°C保存；取 收集的高免蛋用清水擦拭，清除蛋壳上的污物，用〇. 1%新洁尔灭溶液浸泡消毒，取出晾干 后，在无菌条件下用蛋黄分离器分离蛋清和蛋黄，留取蛋黄用灭菌蒸馏水反复冲洗蛋黄表 面，用滤纸吸取表面多余的水分，用针头刺破蛋黄膜，分离出卵黄，放置于干净容器中； 第3步，卵黄免疫球蛋白去脂分层； 第4步，提取卵黄抗体：调整卵黄抗体溶液pH7. 4,依据粗提物中蛋白组分在不同浓度 盐溶液中的溶解度不同，进行分级沉淀，得到纯度较高的IgY。2. 根据权利要求1所述的一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，其特征在 于，步骤3中，卵黄免疫球蛋白去脂分层方法为：每份取25ml卵黄液，1 :4倍体积的PH7. 4 PBS稀释卵黄液，离心30分钟，丢弃沉淀，在上清液中分别加入终浓度为0. 6%-2. 5%的硫酸 葡聚糖搅拌l〇min，25°C静置分层。3. 根据权利要求1所述的一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，其特征在 于，步骤3中，卵黄免疫球蛋白去脂分层方法为：按照1.5%-4. 5% PEG6000的比例添加，每 个稀释比例所用卵黄体积均为25ml，卵黄液1 :4倍体积PH7. 4 PBS稀释，按比例加入稀释 液后，用盐酸调节溶液至PH5. 0，搅拌lOmin，25 °C静置分层。4. 根据权利要求1所述的一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，其特征在 于，步骤3中，卵黄免疫球蛋白去脂分层方法为：取25ml卵黄液，用蒸馏水1:6-1 :9比例稀 释，用lmol/L的盐酸调节溶液至pH 5. 2,25°C静置分层。5. 根据权利要求1所述的一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，其特征在 于，步骤4中，提取卵黄抗体还包括以下两步： 第一：分别选取50%和33%饱和度的硫酸铵分级沉淀卵黄免疫球蛋白；将粗提液中加 入50%饱和度的硫酸铵溶液，沉淀，离心，将沉淀溶解，加入33%饱和度硫酸铵溶液，沉淀， 离心，将沉淀重新溶解到25ml测其抗体的效价； 第二：分别选取20%，36%浓度的硫酸钠进行分级沉淀；在粗提液中加入20%的硫酸钠 离心，丢弃上清，将沉淀重新溶解，加入36%硫酸钠溶液，沉淀，离心，将沉淀重新溶解到 25ml测其抗体的效价。6. 根据权利要求5所述的一种传染性法式囊卵黄免疫球蛋白优化提取工艺，其特征在 于，对两种方法提取的抗体进行SDS-PAGE电泳纯度检测。
【文档编号】C07K16/10GK105820242SQ201410763147
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月5日
【发明人】索江华, 江青东, 吴玉臣
【申请人】郑州牧业工程高等专科学校