器件及其在细胞体外实验中的用图

器件及其在细胞体外实验中的用图
【专利摘要】本发明提供一种器件及其在细胞体外实验中的用途,该器件具有聚多巴胺层?羧甲基壳聚糖层?多肽层的结构，其能够调控人多能干细胞的行为,可用于细胞培养或细胞体外实验。
【专利说明】
器件及其在细胞体外实验中的用途
[0001 ] 本申请要求中国专利申请CN201410850755.0的优先权（申请日：2014年12月31日， 发明名称:器件及其在细胞体外实验中的用途）。
技术领域
[0002]本发明涉及可用于细胞培养的器件及该器件在细胞体外实验中的用途。具体涉及 一种具有聚多巴胺层_羧甲基壳聚糖层-多肽层结构的器件及其在细胞体外实验中的用途。
【背景技术】
[0003] 人诱导多能干细胞(Hyman pluripotent stem cells，hiPSCs)具有和人胚胎干细 胞(Hyman embryonic stem cells,hESCs)几乎同样的形态、扩增能力、表面抗原、基因表达 谱和甲基化位点等特征。hiPSCs克服了 hESCs存在的伦理道德困惑，增加了干细胞自体移植 治疗的可行性，并解决了细胞数量有限的问题。
[0004] 通常人多能干细胞的体外培养需借助于鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts，mEFs)滋养层或Matrigel c^mEFs培养体系因其操作过程繁琐，现逐渐被其它培 养体系取代。Matrigel是从￡^5(￡即611^61:11-11〇1111-5￥31'111)小鼠肉瘤中得到的可溶性基底膜 提取物，其能够在培养基底表面形成一层充当细胞外基质的薄膜，使人多能干细胞能够在 其构建的体外微环境中获得理想的贴壁和自我更新效果（Xu，C.，et al ?、Feeder_free growth of undifferentiated human embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、 10、971-4)。但是1&廿1861培养体系为异种来源且无法保证不同批次产品间的一致性，加之 其成分的不明确性，使其不适于人多能干细胞的大规模体外扩增，限制其在临床治疗中的 应用。所以许多科学家致力于构建可替代Matrigel的、成分明确的人多能干细胞体外培养 体系。
[0005] 首先，研究者相继发现纤连蛋白，玻连蛋白和层粘连蛋白等蛋白及层粘连蛋白的 某些特定部分，均可实现人多能干细胞的体外自我更新。但是，受限于昂贵的费用和物理吸 附导致的批次不一致，蛋白等生物制品难以广泛应用于人多能干细胞科研和临床中。因此， 近些年研究者成功开发出了，少数几种支持人多能干细胞体外培养和定向分化的人工合成 表面，其在成本和批次稳定性等方面具有显著优势。Villa-Diaz等在聚苯乙烯表面形成 PMEDSAH甲基丙烯酸酯类衍生物涂层，外加条件培养基或化学成分明确的"StemPro"培养基 可以实现 H9hESCs 干性维持（Villa-Diaz LG et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28: 581-3)〇
[0006] Melkoymian等通过在培养板表面形成聚丙稀酸层，并在其表面接枝能够促进 hESCs贴壁和增殖的多肽，实验证实hESCs在来源于骨涎蛋白（Bone Sialoprotein，BSP)的 Ac-KGGNGEPRGDTYRAY或来源于玻连蛋白（Vitronectin，VN)的Ac-KGGPQVTRGDVFTMP多肽功 能化修饰表面均能够实现10代左右的干性维持（Melkoymian Z et al. Synthetic peptide-aerylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28: 606-10)。
[0007] 但是，这些人工合成表面制备过程复杂，含生物惰性成分，不利于人多能干细胞的 自我更新和大量扩增。因此，希望利用体内细胞微环境成分来构建一种简单，稳定，有效的 成分明确人多能干细胞体外培养体系。

【发明内容】

[0008] 本发明人针对上述问题进行了深入研究，结果发现具有聚多巴胺层-羧甲基壳聚 糖层-VN多肽层的器件能够调控人多能干细胞的行为，从而完成了本发明。
[0009] 即，本发明如下。
[0010] 1 ?-种器件，其包括：
[0011] 基底，
[0012] 连接于所述基底上的聚多巴胺层，
[0013] 连接于所述聚多巴胺层上的羧甲基壳聚糖层，以及
[0014] 连接于所述羧甲基壳聚糖层上的多肽层；
[0015] 其中，所述多肽层包含下述多肽A或其变体多肽；
[0016] 多肽A:由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的多肽，
[0017]变体多肽是指：
[0018] (1)由在多肽A的氨基酸序列中发生1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添 加而得的氨基酸序列组成、且具有与多肽A等同的功能的多肽，
[0019] (2)由与多肽A的氨基酸序列具有70%以上氨基酸同源性的氨基酸序列组成、且具 有与多肽A等同的功能的多肽，或者
[0020] (3)由在严格条件下与编码多肽A的氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码、且具有与 多肽A等同的功能的多肽。
[0021] 2.根据项1所述的器件，其中，所述多肽层中所述多肽A的分布密度是1~200iig/ cm2。
[0022] 3.根据项1所述的器件，其中，"与多肽A等同的功能"是指能够调控人多能干细胞 的行为，所述人多能干细胞是人诱导多能干细胞或人胚胎干细胞，调控人多能干细胞的行 为是指：
[0023] (1)诱导人体细胞重编程为人多能干细胞，
[0024] (2)使人多能干细胞贴壁，和/或
[0025] (3)使人多能干细胞长期自我更新。
[0026] 4.根据项1所述的器件，其中，所述多肽A的变体多肽是VB多肽。
[0027] 5.根据项1所述的器件，其中，所述多肽层还包含具有促进人多能干细胞定向分化 的功能的化合物B。
[0028] 6.根据项5所述的器件，其中，所述多肽层中所述化合物B的分布密度是1~200yg/ cm2。
[0029] 7.根据项5所述的器件，其中，所述化合物B是BFP-1。
[0030] 8.根据项1~7中任一项所述的器件在细胞体外实验中的用途，其中，所述细胞体 外实验包括：
[0031 ] (1)诱导人体细胞重编程为人多能干细胞，
[0032] (2)使人多能干细胞贴壁，和/或
[0033] (3)使人多能干细胞长期自我更新。
[0034] 9.根据项5~7中任一项所述的器件在促使人多能干细胞定向分化中的用途。
[0035] 10.-种促使人多能干细胞定向分化的方法，该方法包括：
[0036] 步骤B:使用定向诱导培养基在权利要求1~7中任一项所述的器件表面培养人多 能干细胞。
[0037] 11.根据项10所述的方法，该方法还包括：
[0038] 步骤A:在所述步骤B之前，使用能够维持人多能干细胞自我更新的培养基培养人 多能干细胞。
[0039] 12.根据项10所述的方法，其中，该方法是促使人多能干细胞向成骨细胞定向分化 的方法，所述定向诱导培养基是含有巯基乙醇，地塞米松和维生素C以及胎牛血清的aMEM 培养基。
[0040] 13.根据项10所述的方法，其中，该方法是促使人多能干细胞向神经前体细胞定向 分化的方法，所述定向诱导培养基是添加有神经生长因子NGF和rmNoggin的N2B27培养液。
[0041] 14.根据项10所述的方法，其中，该方法是促使人多能干细胞向心肌细胞定向分化 的方法，先用含bFGF的MEF-CM培养基培养人多能干细胞2-3天，诱导第一天时换为RPMI+B27 培养基，并加入Activin A培养24h，诱导第二天加入BMP 4和bFGF连续四天不换液，然后换 为含有50ng/ml VEGF165的RPMI+B27培养基继续培养。
[0042] 15.根据项10所述的方法，其中，该方法是促使人多能干细胞向牙相关上皮细胞定 向分化的方法，所述定向诱导培养基是含有N2，BMP-4和RA的DMEM/F12培养基。
[0043] 16.根据项10所述的方法，其中，该方法是促使人多能干细胞向肝细胞定向分化的 方法，先用添加 Activin A的RPMI/B27诱导培养基培养人多能干细胞3天，再用添加 BMP2和 FGF4的RPMI/B27诱导培养基培养4天，然后用添加 Activin A的RPMI/B27诱导培养基培养3 天，再用添加 HGF和KGF的RPMI/B27诱导培养基培养6天，然后用添加 SingleQuots (不含EGF) 和Oncostatin-M的Hepatocyte Culture Media诱导培养基培养8天。
[0044] 发明的效果
[0045] 1.构成所述器件的材料均具有优良的生物相容性，构建了一种化学成分明确、无 外源物质、安全的调控人多能干细胞命运的体系。
[0046] 2.接枝不同的功能多肽可以赋予体系不同的生物学功能。
[0047] 3.聚多巴胺层-羧甲基壳聚糖层-多肽层的结构可以设置在多种基底材料表面(细 胞培养板，种植体等）。这种设置可以在常规条件下进行，步骤相对简单易行，不需要特殊设 备和高温高压等条件，更符合GMP的要求。而且，制备过程避免了使用对生物体有毒性的化 学物质，工艺过程更为环保。
[0048] 4.该体系制备过程均为化学反应，相较于Matrigel和蛋白质的物理吸附，具有更 优越的批次稳定性。
[0049] 5.采用不同的定向诱导培养基，即可促使人多能干细胞向不同类型的细胞定向分 化。
【附图说明】
[0050] 图1说明了 PS表面相继经PDA/CMC/VN修饰后的表征。（a)PS表面经PDA-CMC-VN修饰 接触角变化；（b)XPS结果；（c)AFM研究PS表面在PDA-CMC-VN修饰过程中的表面形貌变化。扫 面范围 lwn X lym(上图）和5_ X 5wn(下图）；（d)PS，PS-PDA，PS-PDA-CMC和PS-PDA-CMC-VN的 C元素高分辨率XPS图谱。
[0051 ] 图2(a)利用FITC-VN多肽比较PDA-VN和PDA-CMC-VN表面多肽接枝量，及对HlhESCs 和hNF-ClhiPSCs在表面生长四天后细胞数量的影响。（b)VN多肽浓度对HlhESCs和hNF-ClhiPSCs贴壁和生长的影响。（c)消化方式和Y-27632对培养在PDA-CMC-VN和Matrigel表面 的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs第四天细胞数量的影响。
[0052]图3说明了人尿液细胞重编程过程及多能性鉴定。（a)重编程前人尿液细胞形态； (b)重编程第8天有胚胎干细胞样人诱导多能干细胞克隆出现在PDA-CMC-VN表面；（c)重编 程第18天表面出现典型的胚胎干细胞样人诱导多能干细胞克隆；（d)培养在PDA-CMC-VN表 面的第16代roUE0304hiPSCs克隆形貌；（e)人尿液细胞在PDA-CMC-VN修饰的6孔板上重编程 至18天时进行AP染色；（f)细胞核型分析(g)RT-PCR分析细胞0ct-4，Sox-2，Nanog和Rex-1干 性基因表达；（h)流式细胞术检测在PDA-CMC-VN表面培养至P16的roUE0304hiPSCs表面标志 物0ct-4，SSEA-3和Tra-160表达；（i)免疫荧光检测细胞表面标志物Oct-4和SSEA-3表达。标 尺，l〇〇_;(j)定量RT-PCR分析PDUE0304hiPSCs形成的拟胚体的三胚层标志基因表达；（k) TOUE0304hiPSCs在TOA-CMC-VN表面培养至第16代后在N0D/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，对畸 胎瘤进行苏木精-伊红染色。标尺，200mi。
[0053]图4 PDA-CMC-VN表面支持人多能干细胞长期自我更新。（a)4个人多能干细胞系 (HlhESCs，H9hESCs, hNF-ClhiPSCs 和 UMC-ClhiPSCs)在 PDA-CMC-VN 表面连续传代至 P20 时的 核型分析；（b)利用流式细胞术(左图）和免疫荧光(右图）检测4个人多能干细胞系多能性标 志物0(^-4,33￡4-3 &11(11'瓜-160表达情况；（(3-(1)利用石英晶体微天平检测1111^3〇8和11即-ClhiPSCs在材料和Matrigel表面培养20代后的端粒酶活性。
[0054] 图5证实HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在PDA-CMC-VN表面连续传代至P20后维持多向分 化能力。（a-b)利用RT-PCR分析细胞形成的拟胚体是否表达三胚层标志基因；（c)细胞样品 注入N0D/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，切片后进行苏木精-伊红染色。标尺，200mi。
[0055] 图6显示了H9hESCs在PDA-CMC-VN表面定向诱导分化为神经细胞和心肌细胞。（a) 在PDA-CMC-VN表面培养的第15代H9hESCs(上图）消化为单细胞后，接种至AggreWell?800板 (中图）以形成均一的拟胚体(下图ha^ghESCs在神经诱导培养基中诱导至第14天后形成 神经玫瑰花环结构。（c)这些神经玫瑰花环结构继续诱导7天后出现神经元细胞。（d-e)免疫 荧光检测Sox-1(红)/Nestin(绿)和MAP-2(绿)/TUJ-l(绿)分别鉴定诱导形成的神经前体细 胞(d)和神经元细胞(e)。（f)在TOA-CMC-VN表面培养的H9hESCs诱导16后形成跳动的心肌细 胞。（g)心肌标记物a-actinin(绿)和0-myosin(绿）。细胞核经DAPI(蓝)染色。白色标尺，100 Mi;黑色标尺，200M1。
[0056] 图7显示了 PS-PDA-CMC-VN/BFP-1多肽混合接枝的材料表面荧光多肽定性和定量 表征结果(a-b)。图7c为H9hESCs和UMC-ClhiPSCs在不同PDA-CMC-VN/BFP-1表面成骨诱导28 天后的茜素红定性染色和定量测定结果。
[0057]图8显示了VB多肽可以替代VN多肽用于人多能干细胞的培养。（a)多肽浓度对培养 在PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面HIhECSs和hNF-ClhiPSC第四天细胞量的影响；（b)HIhECSs 和hNF-ClhiPSC在PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面的96h生长曲线。（c)HlhECSs和hNF-ClhiPSC以单细胞或克隆接种至PDA-CMC-VB和H)A-CMC-VN表面生长至第四天的细胞量；（d) 在6250-100000细胞? cm2接种密度范围内，HlhECSs和hNF-ClhiPSC在roA-CMC-VB和H)A-CMC-VN表面的贴壁24h的细胞量.上述实验均以Matrigel为对照。*代表p〈0.05，#代表p〈 0.01〇
[0058]图9显示了PDA-CMC-VB表面支持多个人多能干细胞系长期自我更新。（a)5个人多 能干细胞系（HlhESCs，H9hESCs，hNF-ClhiPSCs，UMC-ClhiPSCs和ipsN004hiPSCs)在H)A-CMC-VB表面连续传代至P20时的细胞形貌和核型分析；（b)利用流式细胞术(左图）和免疫荧 光（右图）检测5个人多能干细胞系多能性标志物Oct-4，SSEA-3and Tra-160表达情况;标 尺，lOOunio
[0059] 图10证实HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在TOA-CMC-VB表面连续传代至P20后维持多向 分化能力。（a-b)利用RT-PCR分析细胞形成的拟胚体是否表达三胚层标志基因；（c)细胞样 品注入N0D/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，切片后进行苏木精-伊红染色。标尺，200mi。
[0060] 图11显示了H9hESCs，iPSN004hiPSCs和VBUE hiPSCs3个人多能干细胞系均能够在 PDA-CMC-VB表面定向分化为神经前体细胞，神经元细胞和心肌细胞。免疫荧光检测Sox-1 (红)/Nestin(绿），MAP_2(绿)/TUJ_l (绿)和a-actinin(绿)和0-myosin(绿)分别鉴定诱导 形成的神经前体细胞，神经元细胞和心肌细胞。细胞核经DAPI (蓝)染色。标尺，50mi。
[0061]发明的【具体实施方式】
[0062] 本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义， 如有冲突以本说明书中的定义为准。
[0063] 碰
[0064] 本发明的一个方面提供一种器件（以下也称作本发明的器件），其包括：
[0065] 基底，
[0066]连接于所述基底上的聚多巴胺层，
[0067]连接于所述聚多巴胺层上的羧甲基壳聚糖层，以及
[0068] 连接于所述羧甲基壳聚糖层上的多肽层；
[0069] 其中，所述多肽层包含下述多肽A或其变体多肽；
[0070] 多肽A:由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的多肽，
[0071] 变体多肽是指：
[0072] (1)由在多肽A的氨基酸序列中发生1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添 加而得的氨基酸序列组成、且具有与多肽A等同的功能的多肽，
[0073] (2)由与多肽A的氨基酸序列具有70%以上氨基酸同源性的氨基酸序列组成、且具 有与多肽A等同的功能的多肽，或者
[0074] (3)由在严格条件下与编码多肽A的氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码、且具有与 多妝A等同的功能的多妝。
[0075] 本发明的器件可用于细胞体外实验或细胞培养。在本说明书中，细胞体外实验是 指：（1)诱导人体细胞重编程为人多能干细胞，（2)使人多能干细胞贴壁，和/或(3)使人多能 干细胞长期自我更新。
[0076] 1 ?基底
[0077] 对于用作本发明的器件的基底的材料没有特殊限制，可以使用通常用作细胞培养 表面的基底的那些材料，例如聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、玻璃等。作为基底，例如可以使用 细胞培养板，也可以使用种植体(钛或聚醚醚酮制）。
[0078] 2.聚多巴胺层
[0079]多巴胺(Dopamine，DA)在体内是一种生物神经递质，将基底材料浸没在含多巴胺 的缓冲液中，多巴胺会通过氧化聚合沉积到基底材料表面，从而在基底材料表面形成聚多 巴胺层。
[0080] 对于构成所述聚多巴胺层的聚多巴胺(P〇lyd〇pamine，roA)的分子量没有特殊限 制。聚多巴胺的分子量可以采用常规方法进行控制，例如0.01~l〇〇g/L多巴胺溶液5~90°C 反应1分钟~72小时。
[0081] 3.羧甲基壳聚糖层
[0082] 羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)是壳聚糖最重要的衍生物之一，与 细胞外基质成分糖胺聚糖(GAG)有相似之处，具有良好的生物相容性。
[0083]本发明人通过多肽荧光素标记研究发现，PDA层上能够接枝VN多肽，但所得器件不 能促使细胞贴壁。
[0084]令人惊奇的是，本发明人发现，在设置CMC层作为PDA层与VN多肽层的桥梁的情况 下，所得器件被赋予了调控人多能干细胞行为的功能。本发明中使用的羧甲基壳聚糖，通过 凝胶渗透色谱仪和参照《中国人民共和国药典》方法，测得的重均分子量可以为1000~20万 g/mo 1，优选1万~10万g/mol，更优选6~8万g/mo 1。例如实施例中制备的roA-CMC-VN器件的 CMC层中的羧甲基壳聚糖的重均分子量为83550g/mol。
[0085] 羧甲基壳聚糖含有氨基和羧基，其中的氨基可与聚多巴胺形成化学结合。羧甲基 壳聚糖与聚多巴胺的化学结合可利用本技术领域已知的化学反应来实现，例如迈克尔加成 和席夫碱反应。例如，可以将一定量的0.1重量％~30重量％溶液加至聚多巴胺层基 底上，5~60°C反应lh~72h，即可得到聚多巴胺-CMC基底层。
[0086] 4.多肽层
[0087] 所述多肽层应包含下述多肽A或其变体，视需要也可以包含其他成分(多肽、蛋白 质、核酸、小分子化合物等），只要本发明的器件能够发挥调控人多能干细胞行为的功能即 可。
[0088]所述多肽A是由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的多肽，称作VN多肽，其氨基酸序 列为SEQ ID NO: 1 iKGGPQVTRGDVFTMPJN多肽来自于玻连蛋白（Vitronectin，VN)，有报道 称，通过在培养板表面形成聚丙烯酸层，并在其表面接枝来源于骨涎蛋白（Bone Sialoprotein，BSP)的 Ac-KGGNGEPRGDTYRAY 和 N 端乙酰化的该 VN 多肽，能够实现 hESCs 的 10 代左右的干性维持（Melkoumian Z et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28:606-10.)〇
[0089]本发明的研究表明，在PDA层直接接枝该VN多肽，所得器件不能促使细胞贴壁，但 在设置CMC层作为PDA层与VN多肽层的桥梁的情况下，所得器件被赋予了调控人多能干细胞 行为的功能。
[0090] 所述多肽A的变体包括：
[0091] (1)由在多肽A的氨基酸序列中发生1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添 加而得的氨基酸序列组成、且具有与多肽A等同的功能的多肽。
[0092] 本说明书中，多肽A相对于变体多肽而言，在此是指上述多肽A。
[0093] 本说明书中，"与多肽A等同的功能"是指，将本发明的器件中的多肽A用多肽A的变 体多肽替换时，具有下述功能中的任意一项、任意两项或全部：
[0094] (i)诱导人体细胞重编程为人多能干细胞，
[0095] (ii)使人多能干细胞贴壁，和/或 [0096] (i i i)使人多能干细胞长期自我更新。
[0097]所述变体多肽中，氨基酸取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具 有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间 的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代）、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu 和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。在本说明书中，"一个或多个氨基酸"指通过人工合成 方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸，例如1~20个氨基酸、优选1~15个氨 基酸、更优选1~1 〇个氨基酸、更优选1~8个氨基酸、更优选1~2个氨基酸、更优选1个氨基 酸。
[0098]所述变体多肽是否具有与多肽A等同的功能可以这样来确定:将本发明的器件中 的多肽A用其变体多肽替换，并考察所得器件是否具有上述(i)~（iii)的功能中的任意一 项、任意两项或全部。
[0099]所述多肽A的变体还包括：
[0100] (2)由与多肽A的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、更优 选95%以上、更优选97%以上、更优选98%以上、更优选99%以上的氨基酸同源性的氨基酸 序列组成、且具有与多肽A等同的功能的多肽。
[0101]两个氨基酸序列的同源性％可通过目测和数学计算来确定。或者两个多肽序列的 同源性百分比可以通过使用以Needleman，S.B?及Wunsch，C.D. (J.Mol .Bol ? ,48:443-453， 1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程 序进行序列信息比较来决定。GAP程序优选的默认参数包括：（l)Henikoff，S.以及 Henikoff，J.G. (Proc.Natl .Acad. Sci.USA,89:10915-10919,1992)所记载的得分/矩阵、 bloswii62; (2)-个空位扣12分；（3)连续空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。也可使用 该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同源性百分比，例如 :Altschul等 (Nucl .Acids.Res .，25，p. 3389-3402，1997)中记载的可用BLAST程序对序列信息进行比较 和确定。该程序可于网络上在NantionalCenter for Biotechnology Information(NCBI) 或DNA Data Bank of Japan(DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用BLAST程序进行同源性检 索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常用默认值 进行。此外，两个氨基酸序列的同源性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver. 7(GENETYX 制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。
[0102]所述多肽A的变体还包括：
[0103] (3)由在严格条件下与编码多肽A的氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码、且具有与 多肽A等同的功能的多肽。
[0104] 本说明书中，"严格条件"是指形成所谓的特异性杂合体并且不形成非特异性杂合 体的条件。严格条件的实例包括如下的条件，在该条件下，高度同源的DNA彼此杂交，例如， 不低于80%同源的、优选不低于90%同源的、更优选不低于95%同源的、仍更优选不低于 97%同源的、特别优选不低于99%同源的DNA彼此杂交，并且同源性比上述低的DNA彼此不 杂交，或者典型Southern杂交的洗涤条件，即，在对应于1 x SSC，0.1%SDS在60°C、优选0.1 x SSC，0.1%SDS在60°C、更优选0.1 x SSC，0.1%SDS在68°C的盐浓度和温度下洗涤1次、优 选2或3次的条件。
[0105] 作为多肽A ( VN多肽）的变体，可以列举出VB多肽，VB多肽氨基酸序列为 KGGPQVTRGDTYRAY(该多肽可以乙酰化，即Ac-KGGPQVTRGDTYRAY)。VB多肽是本发明人等设计 的人工多肽，实验结果表明其具有与VN多肽等同的功能，且在性能方面不弱于VN多肽。
[0106] 对于实现本发明的器件的功能而言，所述多肽A或其变体的分布密度应为一定值 以上，例如为lyg/cm2以上，优选为1 Oyg/cm2以上，更优选为20yg/cm2以上，更优选为30yg/ cm 2以上，更优选为40iig/cm2以上。此外，对于所述多肽A或其变体的分布密度的上限没有特 殊限制，从可操作性的角度考虑，可以是例如200yg/cm 2以下或150yg/cm2以下或100yg/cm2 以下或80iig/cm2以下或60iig/cm2以下。
[0107] 羧甲基壳聚糖含有氨基和羧基，其中的羧基可与多肽进行接枝。羧甲基壳聚糖与 多肽的接枝可利用本技术领域已知的化学反应来实现，例如聚多巴胺-羧甲基壳聚糖表面 浸入活化剂溶液(例如，20mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺和20mg/ml 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙 基碳二亚胺盐酸盐，pH = 5.6吗啉乙磺酸缓冲液）中室温反应10~lOOOmin后，与0.1~ lOOmMVN多肽溶液4 °C过夜反应，即可通过迈克尔加成和席夫碱反应得到聚多巴胺-羧甲基 壳聚糖-VN多肽修饰的人多能干细胞培养表面。
[0108] 此外，作为使多肽A或其变体的分布密度达到lyg/cm2以上的方法，多肽A的反应溶 液浓度需在〇.25mM以上，优选为ImM以上。
[0109] 在一个优选的实施方案中，所述多肽层还可包含具有促进人多能干细胞定向分化 的功能的化合物B，结合特定的培养基，可在成分明确条件下实现人多能干细胞体外定向诱 导分化。所述化合物B可以是多肽、蛋白质、核酸或小分子化合物。对于所述化合物B和特定 培养基没有特殊限制，只要其具有促进人多能干细胞定向分化的功能即可。本领域技术人 员可以根据定向分化的需要，选择适宜的化合物B和定向诱导培养基。例如：
[0110] (1)多肽层接枝BFP-1多肽，结合含有e-巯基乙醇，地塞米松和维生素C的aMEM培养 基，可定向诱导人多能干细胞成骨向分化；
[0111] (2)多肽层接枝神经生长因子NGF，结合添加100ng/ml rmNoggin的N2B27培养液， 可定向诱导人多能干细胞为神经前体细胞。进一步，将神经前体细胞培养在含有神经因子、 BDNF、⑶NF、CNTF、IGF1和cAMP的N2B27培养液中可定向分化为神经元细胞;或者将神经前体 细胞接在聚左旋鸟氨酸基质上，配合含有 DEME/F12培养液，可定向诱导分化为少突胶质细胞。
[0112] 因此，本发明还提供一种促使人多能干细胞定向分化的方法，该方法包括步骤B: 使用定向诱导培养基在本发明的器件表面培养人多能干细胞。通过使用定向诱导培养基在 本发明的器件表面培养人多能干细胞，可以促使人多能干细胞定向分化。这里，定向诱导培 养基是指具有促进人多能干细胞定向分化的功能的培养基。何种定向诱导培养基能够促进 人多能干细胞向何种类型的细胞定向分化是本技术领域已知的。例如:含有巯基乙醇，地 塞米松和维生素C以及胎牛血清的aMEM培养基用于人多能干细胞向成骨细胞分化;含有N2， BMP-4和RA的DMEM/F12培养基可促使人多能干细胞向牙相关上皮细胞定向分化等。
[0113]优选地，上述促使人多能干细胞定向分化的方法，还可以包括步骤A:在所述步骤B 之前，使用能够维持人多能干细胞自我更新的培养基培养人多能干细胞。通过使用能够维 持人多能干细胞自我更新的培养基培养人多能干细胞，能够使人多能干细胞增殖。
[0114]使用定向诱导培养基培养人多能干细胞使其定向分化、以及使用能够维持人多能 干细胞自我更新的培养基培养人多能干细胞使其增殖的常规的操作方式及培养条件是本 领域技术人员已知的，本发明的促使人多能干细胞定向分化的方法中，除了使用本发明的 器件作为培养表面以外，可以适宜地采用这些常规的操作方式及培养条件。
[0115]本领域技术人员可以根据定向分化的需要，选择适宜的化合物B和定向诱导培养 基。列举如下：
[0116] (1)多肽层接枝BFP-1多肽，结合含有巯基乙醇，地塞米松和维生素C的aMEM培养 基，可定向诱导人多能干细胞成骨向分化；
[0117] (2)多肽层接枝神经生长因子NGF，结合添加100ng/ml rmNoggin的N2B27培养液， 可定向诱导人多能干细胞为神经前体细胞。进一步，将神经前体细胞培养在含有神经因子、 BDNF、⑶NF、CNTF、IGF1和cAMP的N2B27培养液中可定向分化为神经元细胞;或者将神经前体 细胞接在聚左旋鸟氨酸基质上，配合含有 DEME/F12培养液，可定向诱导分化为少突胶质细胞。
[0118] (3)本发明表面培养的人多能干细胞，用含bFGF的MEF-CM培养基培养2-3天。诱导 第一天时换为RPMI+B27培养基，并加入Activin A培养24h。第二天加入BMP 4和bFGF连续四 天不换液。随后，换为含有50ng/ml VEGF165的RPMI+B27培养基继续培养可定向分化为心肌 细胞。
[0119] (4)本发明表面培养的人多能干细胞，结合含有N2，BMP-4和RA的DMEM/F12培养基， 可定向诱导为牙相关上皮细胞。
[0120] (5)本发明表面培养的人多能干细胞，在不同时期使用含有不同化合物的培养基 进行诱导分化，可定向诱导为肝样细胞：第一阶段，配制基础培养基，RPMI/B27 (minus insulin)，添加细胞因子Activin A，培养3天;第二阶段，基础培养基为RPMI/B27(complete with Insulin)，添加细胞因子BMP2和FGF4，培养4天；第三阶段，基础培养基为RPMI/B27 (complete with Insulin)，添加细胞因子HGF和KGF，培养6天；第四阶段，基础培养基为 Hepatocyte Culture Media添加SingleQuots(without EGF)，并添加细胞因子 Oncostatin-M 培养8 天。
[0121] 对于所述化合物B的分布密度没有特殊限制，只要能够发挥促进人多能干细胞定 向分化的功能即可，优选至少为lyg/cm2以上，优选为10yg/cm 2以上，更优选为20yg/cm2以 上，更优选为30yg/cm2以上，更优选为40iig/cm 2以上。
[0122] 作为在羧甲基壳聚糖上接枝化合物B的方法，可以采用与接枝多肽A的方法相同的 方法。
[0123] 所述多肽可以适宜采用（1)化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获 得，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者 半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽 可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽 固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。
[0124] 此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子 TO2004/011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的 氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出：具 有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处 理物、或该微生物来源的肽合成酶。
[0125] 特别是，多肽的化学合成已经实现了商业化，可以容易地委托专业的多肽合成公 司来合成所述多肽。
[0126] 器件的用途
[0127] 本发明的另一方面提供本发明的器件在细胞体外实验中的用途。
[0128] 在本说明书中，细胞体外实验是指下述(1)~(3)中的任意一项、任意两项或全部：
[0129] (1)诱导人体细胞重编程为人多能干细胞，
[0130] (2)使人多能干细胞贴壁，和/或
[0131] (3)使人多能干细胞长期自我更新。
[0132] 在本说明书中，人多能干细胞是指人诱导多能干细胞(Hyman pluripotent stem cel Is, hiPSCs)和人胚胎干细胞(Human embryonic stem cel Is, hESCs)。
[0133] 在本说明书中，人多能干细胞贴壁是指人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞细胞能 够贴附于经处理的细胞培养培养板表面，一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快 进入对数生长期。
[0134] 在本说明书中，人多能干细胞自我更新是指人多能干细胞能够通过对称分裂产生 两个与原细胞相同的细胞。在本说明书中，人多能干细胞长期自我更新是指人多能干细胞 在体外微环境体系中连续传代培养超过20代仍维持多能性。
[0135] 在一个优选的实施方式中，在本发明的器件包含上述化合物B的情况下，本发明的 器件还可以用于促使人多能干细胞定向分化。
[0136] 在本说明书中，人多能干细胞定向分化是指人多能干细胞在相关因子的作用下， 细胞的形态，结构和功能发生差异的过程。 实施例
[0137] 以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。
[0138] 实施例1 PDA-CMC-VN器件的制备及表征
[0139] 以下制备的PDA-CMC-VN器件依次具备基底(细胞培养板表面）、聚多巴胺层、羧甲 基壳聚糖层和VN多肽层。
[0140] 将24克羧甲基壳聚糖加入含800ml纯水的蓝口瓶中，利用恒温搅拌器在50°C和150 转/分钟条件下过夜搅拌，获得质量分数为3%的CMC溶液。在经中速滤纸粗滤后，于超净工 作台内先后经〇 ? 45wii和0 ? 22mi滤膜过滤后获得无菌CMC溶液。将0 ? 2424克三羟甲基氨基甲 烧盐酸盐置入含200ml纯水的烧杯中，用滴管搅拌均匀，然后用lmol/L盐酸将溶液PH调为 8.5。将0.4克多巴胺粉末加入该缓冲液中，用滴管搅拌均匀。在超净工作台内经0.22mi滤膜 过滤后，以每孔5ml体积加入康宁6孔细胞培养板中，封口膜封闭后置于37°C恒温摇床(70 转/分钟)反应16h。在超净工作台内经无菌纯水冲洗3次后每孔加入5ml纯水，Paraf i lm封口 膜封闭后超声5min，再于超净间内用纯水冲洗一次后每孔加入CMC溶液5ml，封口膜封闭后 置于37°C恒温摇床反应70转/分钟)反应24h。然后，超净台内无菌纯水冲洗3次，干燥后紫外 照射lh。
[0141] 在超净工作台将5mg VN多肽溶于3.1ml DPBS缓冲液中，获得ImM VN多肽溶液。将 19.52克吗啉乙磺酸溶于1000ml纯水中，用玻璃棒搅拌均匀，然后用饱和氢氧化钠溶液将pH 调至5.6.将0.8g N-羟基琥珀酰亚胺和0.8克1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐 分别溶于20ml吗啉乙磺酸缓冲液后混匀，在超净工作台内经0.22mi滤膜过滤后，以每孔3ml 体积加入康宁6孔细胞培养板中室温反应40min，无菌纯水冲洗3次后每孔加入lml VN多肽 溶液，封口膜封闭后4°C过夜，再用无菌纯水冲洗3次，得到聚多巴胺-羧甲基壳聚糖-VN多肽 修饰的细胞培养板。利用X射线光电子能谱(XPS)，接触角和原子力显微镜(AFM)研究，细胞 培养板表面经PDA-CMC-VN涂层修饰后的化学和形貌变化。
[0142] 另外，我们利用FITC荧光蛋白标记的VN多肽(FITC-KGGPQVTRGDVFTMP)，对表面接 枝的VN多肽进行定量研究。首先，避光条件下用乙腈与纯水的1:1混合液配置0.2mM和2mM浓 度的FITC-VN溶液，然后在康宁96孔板中分别加入2ul 0.2mM，5ul0.2mM，lul 2mM，2ul 2mM， 4ul 2mM，8ul 2mM，16ul 2mM(每组4孔)后，在避光条件下自然干燥后，用全波长酶标仪以激 发光488nm，吸收光538nm测量荧光值，建立荧光-密度标准曲线。然后，配置ImM FITC-VN溶 液，利用上述方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，纯水清洗3次后在相同条件下测量荧光 值。
[0143] 如图la所示，修饰之前，PS呈现典型的水接触角值(86.36± 1.67°)，经HM/CMC/VN 修饰后表面接触角分别降低至61.54± 1.70°，41.48±7.16°和30.88±3.52°。我们利用原 子力显微镜测量了PS表面分别经PDA/CMC/VN多肽修饰后的表面形貌变化。我们选择了 lMi X lwii和5wnX 5wii两个扫面范围，AFM测量结果分别如图lb所示。lwnX lwii结果显示，PS未修 饰前的表面比较平滑(Ra = 4.83nm)，聚多巴胺修饰后，我们能够在这些基体的表面见到典 型的聚多巴胺颗粒，Ra值也分别增加至5. Olnm，进一步修饰CMC和VN多肽，我们发现表面的 Ra值均呈下降趋势，并最终获得非常平滑的表面(Ra = 2.20nm)。当AFM扫面范围扩大至5mi X5wii时，也发现了类似的AFM测量结果。该修饰过程进一步利用XPS进行表征（见图lc-d)， 新出现的N元素峰证实PDA层的形成，Na元素峰和"C-N"键的出现说明CMC成功与PDA层共价 结合。最后，接枝VN多肽后，其所含肽键使得"C-N"含量增高。上述表征结果说明我们开发的 PDA-CMC-VN表面能够共价结合至PS培养板表面。
[0144] 另外，我们测得？3-?04-011^11'(^柯_饰12孔板表面的荧光强度为399.695± 73.65291，根据96孔板标准曲线结果可知，表面VN多肽的接枝密度51.75 ± 9.53ug/cm2。
[0145] 实施例2 PDA-CMC-VN器件使人多能干细胞贴壁
[0146] 细胞培养
[0147] H1和H9人胚胎干细胞由中科院广州生物医药与健康研究院购买自WiCell研究所 后赠送。人诱导多能干细胞系(人皮肤细胞来源的hNF-Cl，以及人间充质干细胞来源的UMC- Cl)均由中科院广州生物医药与健康研究院以慢病毒重编程方法获得后赠送。这些人多能 干细胞系培养在铺有Matrigel(BD Biosciences，Canada)的培养板中，培养基使用的是成 分明确的mTeSR?l (StemCel 1 Technologies，Canada)。细胞培养在条件为37°C，100 %湿度 and 5%C02的培养箱中。Matrigel用DMEM/F12在冰上以1:80稀释后，以lml每孔体积加入6 孔板37 °C孵育lh以上。细胞每天换液，并每隔3-4天经0.5mMEDTA37 °C消化4-5min以1:3比例 传代。
[0148] PDA-CMC-VN修饰支持人多能干细胞在不同基体表面生长
[0149] 如上所述，制备接枝ImM VN多肽的PDA/VN和HM-CMC/VN修饰6孔培养板，同时利用 FITC标记的荧光多肽进行定量研究。用0.25%胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies, Canada)将hNF-ClhiPSCs消化为单细胞，然后以23500细胞/cm-2密度接种至H)A/VN和PDA-CMC-VN修饰6孔板中，并以预铺有Matrigel的培养板作为对照。每天更换新鲜培养基至第四 天，利用CCK8细胞计数试剂盒(Dojindo，Japan)测量每孔细胞数。每组含三个平行孔，每孔 吸光度值测量三次。具体实验方法如下：
[0150] 1.实验在避光条件下进行。将CCK8试剂以1:10比例加入至mTeSRl培养基中，均匀 混合后每孔加入lml。
[0151] 2.置于培养箱中反应2小时后，每孔吸取200ul转至96孔板中，然后用全波长酶标 仪(Model 680，Bio-Rad,Hercules，CA)测量吸光度值。
[0152] 另外，Matrigel上培养的hNF-Cl人诱导多能干细胞经EDTA消化后，以1:3比例传至 PDA-CMC-VN修饰的不同基体（PS，玻璃，PDMS和T i )表面。培养4天后，用倒置显微镜 (01ympusCKX31SF, Japan)和正置金相显微镜（01ympusBX51M, Japan)观察材料表面细胞形 貌。同时，收集细胞后，用流式细胞术测量〇ct-4表达情况。细胞贴壁研究
[0153] 选择H1人胚胎干细胞和hNF-ClhiPSC，研究多肽浓度，消化方法和ROCK抑制剂Y-27632对人多能干细胞贴壁的影响。首先，PDA/CMC修饰6孔板经NHS/EDC活化后，每孔加入 11111不同浓度的￥~多肽(0.251111，0.511^，0.751111 &11(111111)后4°(：过夜反应。第二天，接枝多肽 后的培养板用DMEM/F12培养基清洗三次，然后Matrigel上培养的HlhESC和hNF-Cl人诱导多 功能细胞经〇. 25 % Trypsin/EDTA消化为单细胞，再以23500个细胞每平方厘米密度接种。同 时，以相同密度传至Matrigel上作为对照。每天更换新鲜的培养基至第四天，然后用CCK8试 剂盒测量各孔细胞数。
[0154] 如前所述，以每孔lml体积将ImM VN加入活化后的TOA/CMC修饰培养板，制备PDA-CMC-VN表面用于后续人多能干细胞相关实验。H1人胚胎干细胞和hNF-Cl人诱导多功能细胞 分别以单细胞或者克隆的形式(23500个细胞每平方厘米)接种至PDA-CMC-VN和Matrigel表 面，研究传代方式对人多能干细胞贴壁和增殖的影响。同时，ROCK抑制剂Y-27632的作用也 进行了研究，即一组添加5mM Y-27632,另一组不添加。每天更换新鲜的培养基至第四天，然 后用CCK8试剂盒测量各孔细胞数。
[0155] 上述实验每组包含3个平行孔，每孔CCK8试剂吸光度值测量3次。
[0156] 实验结果
[0157] 如图2a所示，虽然荧光多肽实验证实有大量的VN多肽成功接枝到聚多巴胺表面， 但是没有发现贴壁的H1人胚胎干细胞和hNF-ClhiPSC，说明这种直接接枝的方式不可行。于 是，我们引入同时含有氨基和羧基的羧甲基壳聚糖，先共价接枝至聚多巴胺表面，然后通过 经典的NHS/EDC反应活化表面暴露的羧基，从而接枝VN多肽。有趣的是，虽然CMC的参入减少 了 VN多肽的接枝量，但实验证实H1人胚胎干细胞和hNF-ClhiPSC均能够很好地贴壁和生长 在PDA-CMC-VN修饰的培养板表面。
[0158] 选择HlhESCs和hNF-ClhiPSCs，研究多肽浓度、消化方式和ROCK抑制剂Y-27632对 PDA-CMC-VN修饰培养板表面人多能干细胞贴壁和增殖的影响。如图2b所示，随着VN多肽浓 度的增加，PDA-CMC-VN表面含有更多的VN多肽，hNF-ClhiPSCs的细胞数也随着逐渐增加，但 HlhESCs的细胞数没有显著变化，且两者均显著低于Matrigel对照组(p〈0.01)。该结果说 明，要想实现hPSCs在TOA-CMC-VN表面的长期培养和扩增，多肽的分布密度应为一定以上。 我们进一步研究了 H)TA消化方式和ROCK抑制剂Y-27632对hPSCs贴壁和生长的促进作用。无 论是以单细胞或者克隆方式消化，Y-27632的加入均能够显著增加在PDA-CMC-VN表面培养4 天的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs的细胞数量(p〈0.05)。然而，在Matrigel表面，单细胞或者克 隆，Y-27632的促进作用对于HlhESCs比较显著，而对于hNF-ClhiPSCs则不明显。此外，无论 是否增加Y-27632，在TOA-CMC-VN表面生长四天后，我们发现以克隆形式接种的HlhESCs和 hNF-ClhiPSCs的细胞数，明显多于以单细胞接种者(p〈0.05)。我们惊喜的发现，结合EDTA消 化方式和Y-27632，hNF-ClhiPSCs在PDA-CMC-VN表面生长四天后的细胞数与Matrigel相近。
[0159] 实施例3 PDA-CMC-VN器件诱导人体细胞重编程为人多能干细胞
[0160] 人尿液细胞重编程为人诱导多能干细胞实验在中科院广州生物医药与健康研究 院进行。首先，我们成功从一名男性帕金森患者尿液中，纯化获得尿液细胞。然后利用电穿 孔仪（AmaxaNucleofector 11，Lonza，Switzerland)按照操作手册，将同时编码0ct_4 (P0U5Fl)，Sox-2，SV40LT，Klf-4的非整合型附着体载体和MicroRNA MIR302-367转进 150万 尿液上皮细胞。将转染后的细胞转至3孔TOA-CMC-VN修饰6孔板中，用添加有丁酸钠的E7培 养基(Stem Cell)培养，隔天换液。在转染后的第14天，将培养基换成mTeSRUStem Cell)， 继续培养至第18天后挑取克隆。在PDA-CMC-VN表面培养至第16代后，利用核型、流式细胞 术、免疫荧光、体外拟胚体和畸胎瘤实验对所获得的roUE0304hiPSCs的多能性进行鉴定。
[0161] 实验结果:重编程至第8天即有少量胚胎干细胞样人诱导多能干细胞克隆，出现在 PDA-CMC-VN表面(见图3b)。继续诱导至第18天，表面有许多典型的胚胎干细胞样人诱导多 能干细胞克隆，我们挑取一个克隆至Matrigel表面(见图3c，e)。如图3d示，在PDA-CMC-VN表 面培养至P16的PDUE0304hiPSCs呈现典型的未分化克隆形貌，且核型完整（见图3f)。定量 RT-PCR证实细胞表达干性基因Oct-4，Nanog和Sox-2，而不表达分化基因Rex-1 (见图3g)。流 式和免疫荧光结果显示细胞高表达〇(^-4,33￡4-3&11(11> &-160等全能型标志物（见图311-i)。此外，体外拟胚体和畸胎瘤实验实验证实PDUE0304hiPSCs具备三胚层分化能力（见图 3 j-k)。这些结果证实，我们开发的PDA-CMC-VN器件能够支持人体细胞重编程。据我们所知， 该实验是首次报道多肽修饰表面能够在成分明确条件下，将人体细胞重编程为人诱导多能 干细胞，势必将促进人工合成表面在人多能干细胞中的应用。
[0162] 实施例4 PDA-CMC-VN器件使人多能干细胞长期自我更新
[0163] 人多能干细胞系长期自我更新
[0164] 培养在Matrigel上的人胚胎干细胞（H1，H9)和人诱导多能干细胞系（hNF-Cl， GZC2F6和UMC-C1)，经0.5mM EDTA 37°C条件下消化4分钟后，用含有5_ Y-27632的 mTeSR?l培养基将克隆吹打下来，并以1:3传至PDA-CMC-VN修饰的6孔板中。第二天，更换为 不含Y-27632的培养基并每天换液。同时，每天用倒置显微镜(01ympusCKX41，Japan)观察细 胞的形态，如发现有分化或异常的克隆，标记后在生物安全柜内用负压吸引器(YX932D， China)吸除。根据克隆的大小和密度，细胞每隔3-5天经EDTA消化后传代至新的PDA-CMC-VN 修饰6孔板中。
[0165] 定量RT-PCR检测
[0166] 细胞用TRiZol提取RNA，继而进行逆转录PCR合成cDNA，最后定量检测Oct-4， Nanog，Sox-2和Rex-1的表达量，以ACTB作为对照基因，各基因引物见序列见表1。
[0167] 表1.干性检测基因引物序列
[0169] 免疫荧光检测
[0170] 人胚胎干细胞(HI，H9)和人诱导多能干细胞系(hNF-Cl和UMC-C1)在H)A-CMC-VN表 面连续传至P20时，利用免疫荧光检测多能性标记物Oct-4和SSEA-3表达情况。免疫荧光实 验在12孔板中进行，具体检测步骤介绍如下：
[0171] 1)吸尽人多能干细胞的培养基，用DPBS洗一次，加入lml 4%多聚甲酵室温
[0172] 固定30分钟。
[0173] 2)吸去固定液，DPBS洗3次，每次在摇床上轻摇2min;
[0174] 3)加入lml 0.2%!>^〇111100(51811^，]\^88〇虹1，1]5八）室温通透30111111，然后0?85 洗三次，每次在摇床上轻摇2min;
[0175] 4)再利用 1ml 3%BSA(Aladdin，Shanghai，China)溶液室温封闭2小时；
[0176] 5)用 3%BSA与0.2%Triton-X100 的等比例混合液，以1:50 配制一抗(]?〇1186 411衍-0ct_3/4IgG to Hyman(sc-5279);Mouse Anti-SSEA_3IgM to Hyman(abl6286))，每孔加 200ul，然后再覆盖上比孔略小的封口膜，把培养板放到有水的针盒(湿盒)里4°C过夜；
[0177] 6)第二天用弯的针尖挑走封口膜，吸走一抗，PBS洗三次，每次在摇床上轻摇5min;
[0178] 7)以下避光操作。用DPBS以 1: 500比例稀释二抗（Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488IgG(Molecular Probes，Invitrogen,USA)和Goat Anti-mouse Alexa Fluor 488IgM (Molecular Probes，Invitrogen,USA))，然后每孔加入400ul反应lh;
[0179] 8)DPBS洗三次，每次在摇床上轻摇5min。用DPBS以1:5000比例稀释DAPI后，每孔加 入500ul室温染色5min;
[0180] 9)DPBS洗一次后加入新DPBS,利用尼康Eclipse E800显微镜或者蔡司 Axi〇vert200M倒置共聚焦显微镜观察和拍照。DAPI和绿色荧光标记抗体的激发波长分别是 405nm和488nm。
[0181]流式细胞术分析
[0182] 2个人胚胎干细胞系（H1，H9)和2个人诱导多能干细胞系（hNF-Cl和UMC-C1))在 PDA-CMC-VN表面连续传至P20时，利用流式细胞技术检测其多能性标记物Oct-4，SSEA-3和 Tra-160阳性表达率。具体实验过程如下：
[0183] 1)待处理细胞通过0.25%胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies,Canada)培养箱 内消化4分钟，加入含血清培养基终止并吹打成单细胞;2)200g离心5分钟，用lml流式缓冲 液(含2%FBS的DPBS)重悬细胞并转移到1.5mlEP管中，加入200ul 1 %多聚甲醛37°C固定5分 钟后200g离心5分钟。
[0184] 3)用流式缓冲液重悬细胞，200g离心后加入200ul冰上预冷的90%甲醇，置冰上通 透30分钟。200g离心5分钟后，流式缓冲液洗2次。
[0185] 4)用流式缓冲液按 1:100比例稀释Oct-3/4-抗(01550，StemCell Technologies, Canada)。以100ul-抗溶液重悬细胞，并在培养箱中孵育SOminJOOg离心5分钟，用流式缓 冲液洗1次。步骤3-4适于细胞内标记物Oct-4检测，细胞表面标记物SSEA-3和Tra-160无需 此操作；
[0186] 5)以下避光操作。用流式缓冲液按1:500比例稀释Oct-4二抗，以200ul体积重悬并 在培养箱中孵育30min。同时，用流式缓冲液按1:100比例稀释SSEA-3(60061PE，StemCell Technologies，Canada)和Tra-160(60064PE，StemCe 11 Technologies，Canada)直标抗体， 以lOOul溶液重悬细胞，并在培养箱中孵育30min。孵育结束后，200g离心5分钟。
[0187] 6)流式缓冲液洗1次后，用600ul流式缓冲液洗重悬细胞。过滤后，用BD FACS Ca 1 ibur System(LSRFortessa，USA)检测并通过F1 owj〇软件分析干性因子表达情况。
[0188] 4.4核型
[0189] 5个人多能干细胞系在PDA-CMC-VN修饰6孔板上传过20代后，回传至预铺有 Matrigel的10cm培养皿进行核型检测。待细胞生长到75%-85%密度，按50yg ? mr1浓度加 入秋水仙素（Dahui Biotech, China)并在培养箱内处理lhdPBS润洗2遍后，用0.25 % Trypsin/EDTA消化为单细胞。200g离心5分钟后弃上清，用8ml 37°C预热的0.075mol/LKCl 溶液重悬细胞，然后置于37°C水浴中反应20分钟。然后，加入2ml新鲜配制的卡诺固定液（甲 醇:冰醋酸3:1)并继续处理10分钟。细胞固定完成后，200g离心5分钟，用冰浴过的固定液重 悬细胞并制片。最后用BX51显微镜(Olympus Japan)观察染色体的排列。
[0190] 拟胚体形成实验
[0191] 在？04-011(^^上传过20代的1111^508和11呖-(：1111?508，当生长至培养板约70%面 积时，用lmg ? ml^Dispase消化7分钟。DMEM/F12培养基清洗3次后，加入EB培养基(DMEM/F12 基础培养基含20 %牛血清白蛋白，2mM L-glutaMax，1 % (wt/vo 1)NEAA，0. lmMP-巯基乙醇） 并将细胞克隆机械刮脱，然后转至低黏附6孔培养板中悬浮培养8天。根据细胞情况添加培 养基或2-3天换液。然后将拟胚体转至PDA-CMC-VN贴壁培养8天，并隔天换液。最后用Trizol 裂解细胞，提取总RNA后，荧光定量PCR检测三胚层标志性基因的表达情况（引物见表2)，与 未分化的人多能干细胞进行比较。
[0192] 表2.拟胚体三胚层鉴定引物序列
[0195] 畸胎瘤生成检测
[0196] 在PDA-CMC-VN上传过20代的HlhESC和hNF-ClhiPSC回传至Matrigel上培养，以用 于畸胎瘤生成实验。将待注射细胞经Dispase消化后，用1:80稀释的Matrigel重悬，然后以 一百万细胞量立即对N0D-SCID小鼠进行皮下注射，并做好标记。当有畸胎瘤形成并成长至 直径lcm时，处死小鼠，约6-8周后，一般即会有畸胎瘤长出。取出畸胎瘤，切片进行苏木精-伊红染色。显微镜观察寻找三个胚层典型的细胞。
[0197] 实验结果：
[0198] 选择2个人胚胎干细胞系H1和H9,以及2个人诱导多能干细胞系hNF-Cl和UMC-C1， 在roA-CMC-VN表面连续传代超过20代，以判断该表面是否能够支持人多能干细胞的长期自 我更新。在TOA-CMC-VN表面培养的4个人多能干细胞系，在传至P20时均保持完整的核型(见 图4a)。流式结果显示，对于这4个人多能干细胞系，细胞多能性标志物Oct-4，SSEA-3和Tra-160的阳性表达率均分别超过99.4%，82.6%和96.4% (见图4b，左图）。免疫荧光实验进一 步证实这些细胞克隆均高表达多能性标志物〇ct-4和SSEA-3(见图4b，右图）。
[0199] 我们通过拟胚体形成和畸胎瘤形成实验，进一步验证HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在 PDA-CMC-VN表面培养超过20代后仍保持多能性。PDA-CMC-VN表面培养的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs，经悬浮和贴壁培养各8天后提取细胞总RNA，q_PCR结果证实HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在H)A-CMC-VN表面形成的拟胚体均表达三胚层基因（见图5a-b)。此外，这些细胞 在注射入裸鼠皮下6-8周后形成了畸胎瘤，且包含来源于三胚层的组织(见图5c)。这些结果 证实长期培养在PDA-CMC-VN表面的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs仍保持多向分化能力。
[0200] 实施例5 PDA-CMC-VN器件支持人多能干细胞向神经样细胞和心肌样细胞定向分 化
[0201] H9hESCs在roA-CMC-VN表面连续传代至第 15时，利用STEMdiff neural system (Stem Cell Technologies,Canada)，并按照说明书步骤进行神经向诱导分化;另外，我们 参照文南犬报道的方法(Yang，L.etal .Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population.Nature、2008、453、524_528.)进 行了 H9hESCs向心肌细胞分化的实验，除第0，1和4天所用培养基如下所示之外，所有实验方 法与文献报道相同：第0天培养基：Stempr〇-34SFM10640medium，Glutamin(100X), transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500ml medium,3ul/ml of backbone),ascorbic acid(50ug/ml) ,BMP4(0 ? 05ng/ml) ,Y27632( lOug/ml)。第1天培养基： Stempr〇-34SFM 10640medium,Glutamin(100X),bFGF(6ng/ml),Activin A(2.5ng/ml), ascorbic acid(50ug/ml) ,BMP4( lOng/ml)。第4天培养基：Stempr〇-34SFM 10640medium, Glutamin(10OX),transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500ml medium,3ul/ml of backbone),ascorbic acid(50ug/ml),Y27632(lOug/ml),SB431542 (10nM)〇
[0202]定向分化形成的神经细胞和心肌细胞用4%多聚甲醛固定后，通过免疫荧光染色 检测是否表达相关标记物进行鉴定。所选用的神经特异性抗体为S0X-1(R&D AF3369，USA)， Nestin(R&D MAB1259，USA)，MAP-2(Millpore AB5622，USA)和厶11衍-0-1\113111111111(1'耵-1，Sigma-Aldrich T3952，USA);心肌细胞特异性抗体为a-actinin(Abcam AB9465，United Kingdom)和0_myosin(R&D MAB4470，USA)〇 [0203]实验结果
[0204] 在PDA-CMC-VN表面培养的第15代H9hESCs，利用AggreWell?800板形成均一的拟胚 体（图6a)，，并在成分明确条件下分别分化为神经细胞和心肌细胞。H9hESCs在神经诱导培 养基中诱导至第14天后形成神经玫瑰花环结构（图6b)，且阳性表达神经标记物Sox-1和 Nestin(图6d)，说明成功诱导成为神经前体细胞。与此同时，我们挑取神经玫瑰花环结构在 神经玫瑰花环选择培养基中培养7天出现典型的神经元形貌（图6c)，免疫荧光染色实验证 实阳性表达神经元标记物MAP-2和TUJ-1 (图6e)，说明成功分化为神经元细胞。此外， H9hESCs形成的拟胚体在H)A-CMC-VN表面诱导16后形成跳动的心肌细胞（图6f)，且这些细 胞表达心肌标记物a-actinin和0-11^〇8；[11。这些实验结果说明？0纟-0110'\^表面支持11￡308在 成分明确条件下定向诱导分化为神经细胞和心肌细胞。
[0205] 实施例6实施例6PDA-CMC-VN ? BFP-1器件促进人多能干细胞向成骨细胞定向分化
[0206] PDA-CMC-VN ? BFP-1器件的制备和表征
[0207] TOA-CMC修饰细胞培养板的制备如前所述，在超净工作台将5mg VN多肽溶于3.1ml PBS缓冲液中，获得ImM。将5mg BFP-1多肽溶于3.0ml PBS缓冲液中，获得ImM BFP-1多肽溶 液。将已制备的VN和BFP-1多肽溶液按照体积比10:0，7:3和5:5混合，得到VN1Q/BFP-1 Q(简称 VN)、VN7/BFP-13(简称7 : 3)和VN5/BFP-15 (简称5 : 5)三组多肽混合液。然后利用如前所述 NHS/EDC活化方法得到PDA-CMC-VN/BFP-1多肽混合修饰的细胞培养板。
[0208] 我们利用FITC荧光蛋白标记的VN多肽以及用罗丹明标记的BFP-1多肽（Rho-KGGQGFSYPYKAVFSTQ)对表面接枝的VN和BFP-1多肽进行多肽接枝情况的定量研究。首先，避 光条件下用无菌的PBS溶液分别配置0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1. OmM以及1.2mM浓度梯度 的FI TC-VN和Rho-BFP-1多肽溶液，然后在康宁24孔板中分别加入200u 1的多肽梯度液(每组 3个副孔）。用全波长酶标仪以激发光488nm，吸收光525nm测量VN多肽荧光值，以激发光 532nm，吸收光582nm测定BFP-1多肽荧光值，建立荧光-密度标准曲线。然后，配置VN1Q/BFP-1〇(简称VN)、VN7/BFP-1 3(简称7:3)和VN5/BFP-15(简称5:5)三组荧光多肽混合液。利用上述 方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，纯水清洗3次后在相同条件下测量荧光值。
[0209] 人多能干细胞向成骨细胞定向分化
[0210] 在 Matrigel 表面培养的 H9hESCs(代数为 30-50 代）及UMC-ClhiPSCs(代数为 30-45 代），用Acutase酶消化成单细胞，然后接种至材料表面(VN组，7:3组及5: 5组）。在mTESRl中 加入ROCK抑制剂(Y-27632)促进单细胞贴壁。12h后大部分的细胞已完全贴壁，此时更换为 不含ROCK抑制剂(Y-27632)的mTESRl培养基。继续培养1天后，更换mTESRl培养基为成骨诱 导培养基(a-MEM培养基含10%的FBS，5μg/ml的维生素C(AA)，10mM的甘油磷酸钠(0-GP) 及10_ 8M的地塞米松），每2天更换培养基至28天。在培养到第28天的细胞培养板中，冰roS冲 洗三遍后加入4%的多聚甲醛固定30min。每孔加入lml 2%质量分数茜素红水溶液(pH = 4.2)反应20min，蒸馏水多次冲洗后通过倒置光相差显微镜下拍摄钙结节的染色情况。然 后，在每孔中加入500ul的1 %质量分数十六烷基吡啶溶液，反应完全后每孔吸取100ul的上 清液转移至新的96孔板中，每组做3个副孔，在全波长酶标仪中用490nm的波长测定吸光度， 从而定量钙结节的形成量。
[0211] 实验结果
[0212] 不同多肽混合接枝的表面，荧光强度都较为均匀，证实我们构建了一个相对较为 均一的材料表面（图7a)。定量测量结果显示（图7b)，从VN组，到7:3组及5:5组，绿色荧光强 度逐渐降低(代表VN多肽的接枝量逐渐降低），红色荧光强度逐渐增强(代表BFP-1多肽的接 枝量逐渐增加），说明多肽按照预设的比例接枝在材料表面，荧光定量的实验进一步证实多 肽的混合接枝比例。
[0213]图7c显示了成骨诱导28天后，各组的茜素红定性染色和定量测定结果。通过28天 的成骨诱导，VN组，7:3组和5: 5组表面培养的H9hESCs及UMC-ClhiPSCs均有钙结节形成，且 随着BFP-1成骨多肽的含量增加，钙结节的形成量逐渐增加。定量结果进一步证实，成骨多 肽的确对干细胞的成骨起到促进的作用，但是不同的细胞系表现有一定的差异，H9hESCs较 UMC-ClhiPSCs成骨效果更好。
[0214] 实施例7 PDA-CMC-VB多肽器件支持人多能干细胞长期自我更新
[0215]将上述PDA-CMC-VN器件中的VN多肽换成我们课题组设计和筛选的VB多肽，其他实 验条件不变，重复上述实施例1~5。
[0216] 图8显示了在EDTA消化和添加ROCK抑制剂Y-27632条件下，PDA-CMC-VB和PDA-CMC- VN表面在支持HlhECSs和hNF-ClhiPSC贴壁和增殖方面的性能类似。首先，VB除在0.125mM浓 度条件下HlhECSs培养至第四天的细胞量少于VN外(p〈0.05)，其它接枝多肽浓度(0.25mM， 0.5mM，ImM)时，PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面培养四天的HlhECSs和hNF-ClhiPSC细胞量相 近(图8a)。另外，我们也看到，随着多肽浓度的升高，第四天材料表面的细胞量也逐渐增加， 说明较高的多肽浓度是必需的，所以后续实验VB和VN的浓度均为ImM。然后，96h生长曲线实 验证实，HlhECSs和hNF-ClhiPSC在PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面的增殖速度几乎相同（图 8b)。为了进一步比较VB和VN的促人多能干细胞贴壁性能，我们研究了消化方式和细胞接种 密度的影响。图8c显示，在单细胞接种条件下，hNF-ClhiPSC在PDA-CMC-VB表面生长至第四 天的细胞量显著高于H)A-CMC-VN表面(p〈0.01)，说明VB多肽较VN多肽更适合hiPSC单细胞 培养。在6250-100000细胞? cm2接种密度范围内，HlhECSs和hNF-ClhiPSC在roA-CMC-VB和 PDA-CMC-VN表面的贴壁24h的细胞量没有统计学差异（图8d)。这些结果说明我们设计和筛 选获得的VB多肽可以替代VN多肽用于人多能干细胞的培养。
[0217] 然后，图9和图10说明5个人多能干细胞系（HlhESCsjghESCsJNF-ClhiPSCsJMC-ClhiPSCs 和 ipsN004hiPSCs) 在 HM-CMC-VB 表面连续传代 20 代后仍维持多能性。图 11显示 H9hESCs，iPSN004hiPSCs和VBUE hiPSCs三个人多能干细胞系均能够在roA-CMC-VB表面定 向分化为神经细胞和心肌细胞。
[0218]还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中 作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用 于其它技术方案;并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案 的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本 发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本 说明书中。
[0219] 以上通过【具体实施方式】和实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应该理 解的是，这些并非意图对本发明的范围进行限定，本发明的范围应由权利要求书确定。
[0220] 工业实用性
[0221 ]根据本发明，能够提供一种可用于细胞培养或细胞体外实验的器件。
【主权项】
1. 一种器件，其包括： 基底， 连接于所述基底上的聚多巴胺层， 连接于所述聚多巴胺层上的羧甲基壳聚糖层，以及 连接于所述羧甲基壳聚糖层上的多肽层； 其中，所述多肽层包含下述多肽A或其变体多肽； 多肽A:由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的多肽， 变体多肽是指： (1) 由在多肽A的氨基酸序列中发生1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而 得的氨基酸序列组成、且具有与多肽A等同的功能的多肽， (2) 由与多肽A的氨基酸序列具有70%以上氨基酸同源性的氨基酸序列组成、且具有与 多肽A等同的功能的多肽，或者 (3) 由在严格条件下与编码多肽A的氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码、且具有与多肽 A等同的功能的多妝。2. 根据权利要求1所述的器件，其中，所述多肽层中所述多肽A的分布密度是1~200yg/ cm2。3. 根据权利要求1所述的器件，其中，"与多肽A等同的功能"是指能够调控人多能干细 胞的行为，所述人多能干细胞是人诱导多能干细胞或人胚胎干细胞，调控人多能干细胞的 行为是指： (1) 诱导人体细胞重编程为人多能干细胞， (2) 使人多能干细胞贴壁，和/或 (3) 使人多能干细胞长期自我更新。4. 根据权利要求1所述的器件，其中，所述多肽A的变体多肽是VB多肽。5. 根据权利要求1所述的器件，其中，所述多肽层还包含具有促进人多能干细胞定向分 化的功能的化合物B。6. 根据权利要求5所述的器件，其中，所述多肽层中所述化合物B的分布密度是1~200μ g/cm2 〇7. 根据权利要求5所述的器件，其中，所述化合物Β是BFP-1多肽。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的器件在细胞体外实验中的用途，其中，所述细胞 体外实验包括： (1) 诱导人体细胞重编程为人多能干细胞， (2) 使人多能干细胞贴壁，和/或 (3) 使人多能干细胞长期自我更新。9. 根据权利要求5~7中任一项所述的器件在促使人多能干细胞定向分化中的用途。10. -种促使人多能干细胞定向分化的方法，该方法包括： 步骤B:使用定向诱导培养基在权利要求1~7中任一项所述的器件表面培养人多能干 细胞。
【文档编号】C12N5/0735GK105820951SQ201510903953
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月9日
【发明人】魏世成, 周平, 张晓红, 李永亮, 王梦珂
【申请人】北京大学口腔医学院