一株高地芽孢杆菌菌剂的制备及应用
【专利摘要】本发明涉及一种用于防治桃采后真菌病害的拮抗菌及由该菌株制备的微生物菌剂。本发明提供了一株保藏号为CGMCC No.12180的高地芽孢杆菌14b(Bacillus altitudinis)，以及高地芽孢杆菌14b制备得到的微生物菌剂发酵液和发酵滤液在防治桃采后真菌病害中的应用。本发明所公开的高地芽孢杆菌14b是在未施用化肥农药的肥城桃园中采集桃树根际土壤分离获得的，能有效的防治桃褐腐病、灰霉病、软腐病及青霉病等多种真菌病害，是一种生防效果好、无污染、防治范围广、安全生态的生物防治潜力菌株，有广阔的市场应用前景。CGMCC No.1218020160304
【专利说明】
一株高地芽孢杆菌菌剂的制备及应用 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物和生物防治领域中的一种高地芽孢杆菌及其制备的微生物菌 剂发酵液和发酵滤液，特别是涉及其在防治桃采后病害中的应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 桃是重要的核果类果树，在我国分布范围广，栽种面积大。随着栽培面积、产量的 逐年提升，由桃褐腐菌(Monilinia fructicola)引起的褐腐病、由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病、由葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)引起的软腐病和由扩展青霉 (PeniciIlium expansum)引起的青霉病等引起的问题日益突出，严重影响了桃的运与加 工。国内外的科研工作者都在致力寻找替代或降低化学防腐的新方法。但是，目前的防治手 段主要以化学防治为主，严重影响了人类的健康，并造成了环境污染。因此，以高效、低毒、 低残留的环境友好型生物农药逐步替代传统的高毒化学农药便成为新型农药研发的必然 趋势。作为生物防治的一种，拮抗菌一般不会对环境及果品造成污染，不仅安全性较高，而 且成本相对较低，对人和牲畜相对安全。
[0003] 高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)在防治桃采后病害上鲜有报道。其具有营 养简单，在自然界中存在广泛，繁殖速度快、抗逆性强等特点，具有作为优势生防菌株的潜 力。以其生物活体及其代谢物制备微生物菌剂，成本较低，防效高，为开发新型桃采后真菌 病害生防产品奠定了基础。 (三)
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种对桃采后多种真菌病害具有显著生物防治效果的高地 芽孢杆菌14b(B.altitudinis)和由该菌株发酵制成的微生物菌剂发酵液和发酵滤液，用于 控制多种常见的桃采后病害，具有安全高效、操作简便、可持续发展的优点。
[0005] 本发明所采取的技术方案如下。
[0006] 本发明采用稀释分离法和平板对峙法在未施用化肥农药的桃园中采集桃树根际 土壤分离筛选获得一种能够用于防治桃采后病害的拮抗菌株14b，经过菌种鉴定后，对16S rDNA序列在ncbi核糖体数据库上比对，选择亲缘关系远近不同的16S rDNA序列做系统发育 树，14b被鉴定为高地芽孢杆菌，与Bacillus altitudinis DSM 21631T(AJ831842)有最高 的同源性，同源性达99%以上。该菌株于2016年03月04日在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心进行了检测和保藏，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏 号为CGMCC No. 12180,建议分类命名为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。
[0007] 微生物菌剂的制备方法：
[0008] 1)活化菌株:将保存好的高地芽孢杆菌14b划线转接到NA培养基，置培养箱40 °C恒 温保湿培养24h;
[0009] 2)制备种子液:挑取NA培养基上生长良好的拮抗菌株高地芽孢杆菌14b单菌落接 种到NB液体培养基中，40 °C下振荡培养48h，振荡频率130~180r/min;
[0010] 3)制备发酵液:按体积比以3%的接种量将步骤2)中制备的菌株14b种子液接种于 NB液体培养液中，装料量为50-100mL/250mL，培养基初始pH值为7、发酵温度为40°C、振荡频 率为130~180r/min、发酵时间为48h制得14b发酵液，经镜检计数，菌液浓度大于2.5 X 1010cfu/mL；
[0011] 4)制备发酵液滤液：将步骤3)制备得到的14b发酵液在8000r/min下离心10~ 20min，取上清，通过D = 0.22wii的微孔滤膜过滤得到发酵滤液原液，用无菌水将该发酵滤液 原液稀释至20-100倍制得14b发酵滤液。
[0012]本发明提供的菌株14b摇瓶发酵培养基包括牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/ L，初始pH = 7。为保护发酵液中活菌数，降低紫外线对其产生的杀伤作用，延长液体制剂贮 藏期，使液体制剂均匀、稀释，可考虑在液体制剂中加入紫外防护剂、防腐剂、表面活性剂等 助剂。
[0013]利用上述微生物菌剂进行了离体和果实试验，均得到了良好的效果。
[0014]本发明的有益效果在于：
[0015] 本发明提供的高地芽孢杆菌14b对桃褐腐病、灰霉病、软腐病及青霉病等多种真菌 病害具有显著的防治效果，以高地芽孢杆菌14b制备发酵液、发酵滤液等微生物菌剂，防治 效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉，具有很高的应用价值 和广阔的市场前景。 (四）
【附图说明】
[0016] 图1是基于菌株14b的16S rDNA构建的系统发育树。
[0017]图2为菌株14b发酵滤液对桃褐腐菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉菌丝生长的影响(AB为 桃褐腐菌、CD为灰葡萄孢菌、EF为匍枝根霉，其中ACE为CK、BDF为发酵滤液处理）。
[0018] 图3为肥城白里桃接种桃褐腐菌不同处理方式对病斑扩展的抑制作用(A:CK、B为 菌株14b发酵液处理、C为发酵滤液稀释50倍处理）。
[0019] 图4为肥城白里桃接种扩展青霉不同处理方式对病斑扩展的抑制作用(A:CK、B为 菌株14b发酵液处理、C为发酵滤液稀释50倍处理）。 (五)
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图表和【具体实施方式】来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技 术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
[0021 ]实施例一:高地芽孢杆菌14b的分离筛选
[0022] 在未施用化肥农药的桃园中采集桃树根际土壤，采用稀释分离法，做好1(^、10一2、 10一3和10-4的土壤稀释液，用移液枪分别吸取10- 2、10-3和10-4的土壤稀释液O.lmL加到NA培 养基平板上，用无菌涂布器涂匀，标明编号，放置一小时后将培养皿反转，于37°C中培养。从 培养的第二天起，根据菌落形态等特点挑选细菌单菌落，分别移接到NA培养基上，培养48h 后用于后续试验。经纯化的菌株于NA斜面培养基上，4°C保存。
[0023] 采用平板对峙法筛选拮抗菌。在PDA平板的中央接种病原菌菌饼（8mm打孔器打 取），以病原菌菌饼为中心，划十字，在十字交叉线的四端、距离平板1.5cm处，接种同一种分 离出的细菌，每个处理3皿。室温下培养96h，以不接种细菌的病原菌培养皿为对照，测定平 均抑菌率。筛选出对桃病原菌的抑制效果最强的菌株，命名为14b，经过菌种鉴定后，对16S rDNA序列在ncbi核糖体数据库上比对，选择亲缘关系远近不同的16S rDNA序列做系统发育 树，14b被鉴定为高地芽孢杆菌，与Bacillus altitudinis DSM 21631T(AJ831842)有最高 的同源性，同源性达99 %以上。
[0024] 实施例2:微生物菌剂的制备
[0025] 用于防治桃采后真菌病害的微生物菌剂包括高地芽孢杆菌14b的发酵液和发酵滤 液，制备步骤如下：
[0026] 1)活化菌株:将保存好的高地芽孢杆菌14b划线转接到NA培养基，置培养箱40 °C恒 温保湿培养24h;
[0027] 2)制备种子液:挑取NA培养基上生长良好的拮抗菌株高地芽孢杆菌14b单菌落接 种到NB液体培养基中，40 °C下振荡培养48h，振荡频率130~180r/min;
[0028] 3)制备发酵液:按体积比以3%的接种量将步骤2)中制备的菌株14b种子液接种于 NB液体培养液中，装料量为50-100mL/250mL，培养基初始pH值为7、发酵温度为40°C、振荡频 率为130-180r/min、发酵时间为48h制得14b发酵液，经镜检计数，菌液浓度大于2.5X 1010cfu/mL；
[0029] 4)制备发酵液滤液：将步骤3)制备得到的14b发酵液在8000r/min下离心10~ 20min，取上清，通过D = 0.22wii的微孔滤膜过滤得到发酵滤液原液，用无菌水将该发酵滤液 原液稀释至20~100倍制得14b发酵滤液。
[0030]菌株14b摇瓶发酵培养基包括牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，初始pH=7。 [0031 ]实施例3:微生物菌剂对病原菌菌丝生长的影响
[0032 ]微生物菌剂包括实施例2制备的高地芽孢杆菌14b的发酵液和发酵滤液。
[0033] 采用滤纸片法测量菌株14b发酵液对菌丝生长的影响。在PDA平板中心分别接种桃 褐腐菌、灰葡萄孢菌、软腐病菌、青霉病菌菌饼，无菌滤纸片（〇=8mm)蘸取生防菌发酵液后 对称贴在距离病原菌菌饼2.5cm处，26 °C培养，3d后观察并记录病原菌生长直径并计算抑制 率，详情见表1。
[0034] 采用含滤液平板法测量发酵菌液对菌丝生长的影响。将发酵滤液与PDA培养基按 体积比1:9比例混合后，制成发酵滤液平板，对照组不加发酵滤液而加入等体积的无菌水， 在平板中心分别接种桃褐腐菌、灰葡萄孢菌、软腐病菌、青霉病菌，每个处理3个重复，26°C 培养，3d后观察并记录病原菌生长直径并计算抑制率，详情见表1。
[0035] 生长抑制率=(对照组菌丝直径-处理组菌丝直径)/对照组菌丝直径X 100%
[0036]表1高地芽孢杆菌14b的发酵液和发酵滤液处理对平板上菌丝生长的影响
[0038] 注:每一行的不同字母(a，b)表示同一品种桃果实处理和对照间在P〈0.05水平上 有显著性差异。
[0039]由表1可见，滤纸片法测定菌株14b发酵液抑菌率在70.5%以上，抑菌效果显著。含 滤液平板法测定滤液抑菌活性发现，菌株14b发酵滤液抑菌率在61 %以上，明显抑制各种病 原菌的生长。结果说明，高地芽孢杆菌14b发酵液和发酵滤液均能显著抑制桃病原菌的生 长。
[0040] 实施例4:高地芽孢杆菌14b发酵液对果实病斑扩展的影响
[0041] 取新鲜肥城白里桃，用高地芽孢杆菌14b发酵液浸泡15min(对照组用无菌水），室 温下放置自然瞭干后在赤道处每果刺3_X3mm 1个伤口，再分别接种1 X 104cfu/mL的桃褐 腐菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉和扩展青霉的孢子悬浮液30此。将上述处理的果实于20土 TC 保湿贮藏，3天后测量病斑直径，计算抑菌率，详情见表2。每次每个处理20个果实，该试验重 复二次。
[0042] 生长抑制率=(对照病斑直径_处理病斑直径)/对照病斑直径X 100%
[0043] 实施例5:高地芽孢杆菌14b发酵滤液对果实病斑扩展的影响
[0044] 取新鲜肥城白里桃，用高地芽孢杆菌14b发酵滤液原液稀释50倍得到的发酵滤液 浸泡15min(对照组用无菌水），室温下放置自然晾干后在赤道处每果刺3_X3mm 1个伤口， 再分别接种1 X 104cfU/mL的桃褐腐菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉和扩展青霉的孢子悬浮液30y L。将上述处理的果实于20 ± 1°C保湿贮藏，3天后测量病斑直径，计算抑菌率，详情见表2。每 次每个处理20个果实，该试验重复三次。
[0045] 生长抑制率=(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径X 100%
[0046] 表2高地芽孢杆菌14b的发酵液和发酵滤液处理对果实上病斑扩展的影响
[0048] 注:每一行的不同字母(a，b)表示同一品种桃果实处理和对照间在P〈0.05水平上 有显著性差异。
[0049] 由表2可见，经菌株14b发酵液和发酵滤液处理过的桃果实的病斑直径明显小于对 照组，有较高的抑制率，说明高地芽孢杆菌14b微生物菌剂可抑制病斑扩展，有效延缓采后 病害的发生，减轻采后病害的侵染情况。
[0050] 综上所述，本发明提供的高地芽孢杆菌14b微生物菌剂发酵液和发酵滤液对桃褐 腐病、灰霉病、软腐病、青霉病等采后病害均有较强的拮抗作用，在该领域具有广阔的应用 前景。
【主权项】
1. 一种高地芽孢杆菌14b，该高地芽孢杆菌于2016年3月4日在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC No. 12180。2. 根据权利要求1所述的一种高地芽孢杆菌14b制备的微生物菌剂，其特征在于，所述 的微生物菌剂包括其发酵液和发酵液滤液。3. 根据权利要求1所述的根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于， 其制备步骤如下： 1) 活化菌株:将保存好的高地芽孢杆菌14b划线转接到NA培养基，置培养箱40°C恒温保 湿培养24h; 2) 制备种子液:挑取ΝΑ培养基上生长良好的拮抗菌株高地芽孢杆菌14b单菌落接种到 NB液体培养基中，40 °C下振荡培养48h，振荡频率130~180r/min; 3) 制备发酵液:按体积比以3 %的接种量将步骤2)中制备的菌株14b种子液接种于NB液 体培养液中，装料量为50~100mL/250mL，培养基初始pH值为7、发酵温度为40°C、振荡频率 为130-180r/min、发酵时间为48h制得14b发酵液，经镜检计数，菌液浓度大于2.5X10 1()Cfu/ mL； 4) 制备发酵液滤液:将步骤3)制备得到的14b发酵液在8000r/min下离心10~20min，取 上清，通过D = 0.22μπι的微孔滤膜过滤得到发酵滤液原液，用无菌水将该发酵滤液原液稀释 至20-100倍制得14b发酵滤液。4. 根据权利要求3高地芽孢杆菌14b微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂的摇 瓶发酵培养基为牛肉膏3g/L、蛋白胨1 Og/L、NaCl 5g/L，初始pH=7。5. 根据权利要求2所述的一种高地芽孢杆菌14b微生物菌剂在防治桃采后真菌病害上 的应用，其特征在于，所述的真菌病害包括:桃褐腐病、灰霉病、软腐病和青霉病。6. 根据权利要求2所述的一种高地芽孢杆菌14b微生物菌剂在防治桃采后真菌病害上 的应用，其特征在于，所述的桃品种为肥城白里桃。
【文档编号】A01P3/00GK105820981SQ201610270554
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】石晶盈, 殷晓慧, 王庆国, 张畅, 彭勇, 张欣, 刘佩
【申请人】山东农业大学