一种角蛋白酶的分离纯化方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一种角蛋白酶的分离纯化方法及应用，步骤为：将粗酶液用硫酸铵梯度沉淀后，用缓冲液重悬沉淀、透析；用缓冲液平衡离子交换柱，上样，酶活峰在穿过峰中；收集有酶活的组分，用缓冲液透析；用缓冲液平衡离子交换柱，上样，用NaCl梯度洗脱，得纯化后的角蛋白酶。本发明中1L发酵液可收获角蛋白酶Ker FJ纯酶16.59mg，总酶活2989U。且获得的角蛋白酶Ker FJ在畜禽废弃物降解、脱毛及作为洗涤剂添加剂方面均有非常好的效果。CGMCC NO.1208620160120
【专利说明】
一种角蛋白酶的分离纯化方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种角蛋白酶的分离纯化方法及应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 家禽羽毛、羊毛、动物皮毛、蹄角的主要成分是角蛋白。角蛋白是硬性蛋白，结构致 密复杂，很难被普通的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等水解，只能被称作"角 蛋白酶"的蛋白酶所水解。由于角蛋白酶能降解普通蛋白酶难以降解的富含角蛋白的羽毛、 羊毛、蹄甲、毛发，因此被广泛应用于制革业、纺织业和角蛋白废弃物的处理。现有市售的角 蛋白酶酶制剂例如Versazyme?、Valkerase?等都是由角蛋白酶KerA改造而来(Gupta R et al.，Appl Microbiol Biotechnol.2013,97:9931_9940)〇
[0003] 全球范围内禽畜养殖业、屠宰业、制革业、毛皮加工业带来大量的家禽羽毛和猪、 牛、羊等的皮毛蹄角这些蛋白质废弃物，这些废弃物富含角蛋白，在厌氧条件下释放氯硫化 物和氨气，带来严重的环境问题，同时又难以降解，给废物处理带来困难。微生物及分泌的 胞外酶(主要是角蛋白酶)能降解这些角蛋白废弃物。微生物和角蛋白酶在温和的反应条件 下将难降解的角蛋白转化为多肽和氨基酸，富含氮元素的水解产物可用作饲料饲喂禽畜， 提高饲料的营养价值和动物的消化吸收效率;能用作土壤的营养肥料;用于叶面施肥;还可 生产甲烷和生物氢等生物能源。如何解决畜禽废弃物的无害化处理、资源化利用成为我国 养殖业亟待解决的重要课题。
[0004] 传统制革业中皮毛浸泡、脱毛、软化和鞣革过程需用到大量碱、硫化物、盐、有机溶 剂、石灰等难处理的化学物质，不仅产生S21亏染，而且使废水中的C0D、B0D值升高，废水呈强 碱性且带有恶臭味，引起严重的环境污染。利用酶法脱毛来代替传统的化学试剂脱毛，可避 免使用硫化钠及其他有毒物质，从而减少废弃物的产生，降低工业排污，保护环境，是实现 制革清洁化生产的有效途径之一。商品化蛋白酶制剂Aqimderm?:、NUB?、Pyrase? 和Clarizyme已被广泛应用于制革业中毛皮的清洗、脱毛等程序（Gupta et al.，Appl Microbiol Biotechnol. 2013，97:9931-9940)。但完全使用蛋白酶代替化学试剂成本高，亟 需开发更高效的酶制剂。角蛋白酶能高效降解普通蛋白酶难以降解的角蛋白，包括富含角 蛋白的羽毛、羊毛、蹄甲、毛发，因此在制革行业中，角蛋白酶就成为了比普通蛋白酶更有优 势的替代品。没有胶原酶活性、有微弱弹性蛋白酶活性的角蛋白酶可用于制革业的脱毛，这 些酶松弛角蛋白组织，不破坏皮革的弹性而拔出完整毛皮，角蛋白水解物还能用作复鞣剂 充盈皮革质地，提高毛皮品质（Gupta et al.，Appl Microbiol Biotechnol.2013,97: 9931-9940)。多篇文献报道了产角蛋白酶的芽孢杆菌属细菌Bacillus subtilis S14 (Macedo AJ et al.,Appl Environ Microbiol?2005,71:594-596)、B.pumilus(Kumar AG et al.,J Appl Microbiol.2008,104:411-420)nB.1icheniformis ER-15(Tiwary E, Gupta R et al.,Bioresour Technol.2010,101:6103-6110)nB.halodurans PPKS-2 (Prakash P et al.，Appl Biochem Biotechnol.2011，160:1909_1920)、B.halodurans JB99(Shrinivas D，Naik GR et al.，Int Biodeter Biodeger.2011,65:29-35)胞外粗酶 液对不同毛皮的脱毛作用；国内主要围绕有脱毛能力的菌株资源的筛选及粗酶液脱毛效果 粗评价等方面来研究菌株的脱毛效果(谢菲等，微生物学报，2010，50(4): 537-541;刘彦等， 中国皮革，2013,42 (23):15-18)。有报道称来自短短芽孢杆菌Brevibaci llus brevis US575的角蛋白酶KERUS单独作用即可完成兔皮、山羊皮、绵羊皮、牛皮的脱毛(Jaouadi NZ et al.,Plos One,2013,8(10):e76722)〇
[0005] 与普通蛋白酶相比，角蛋白酶能更容易洗掉衣物表面沾有的角质化废物，可用作 洗涤剂的添加剂。该应用要求蛋白酶的耐碱性好、在较宽的温度范围内仍能保持高活性，此 外还要对蛋白污渍的有良好的洗涤效果、能耐受洗涤剂中的离子型/非离子型表面活性剂、 氧化剂、漂白剂、酶类等其他成分并保持自身活性的稳定（Vojcic L et al.，New Biotechnol，2015,32(6): 342-348)。尽管蛋白酶可应用于洗涤剂添加剂的报道有多篇，但 对角蛋白酶在此方面的应用研究较少。来自短短芽孢杆菌Brevibaci llus sp.AS-S10-II的 角蛋白酶在EDTA、SDS、Triton X-100、Tween 20、H2〇2中仍保持较高酶活，但与不同种类洗涤 剂共同保温后酶活均有不同程度降低（Rai KR，Mukherjee AK.Biochem Eng J.2011，54: 47-56);来自B.pumilus KS12的角蛋白酶最适pH是10,最适酶活温度60°C，在去垢剂皂苷、 胆酸钠、SDS、Tri ton X、Tween-80，氧化剂H2〇2、次氯酸钠及各品牌洗涤剂中酶活均有不同程 度提高，但未见对污渍洗涤效果的报道(Rajput R et al.，Enzyme Research,2010,2010: 7)。
[0006] 直至目前，筛选、发掘、研究有角蛋白酶生产能力的微生物菌株，以及继续开发这 些菌株产的有潜在工业、商业应用潜力的角蛋白酶资源，仍是角蛋白酶研究中的重要的、待 解决的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种角蛋白酶的分离纯化方法及应用，通过本发明纯化方 法，1L B.subtilis FJ-3-16发酵液可收获角蛋白酶Ker FJ纯酶16.59mg，总酶活2989U。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] -种角蛋白酶的分离纯化方法，具体步骤如下：
[0010] 将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16发酵培养，获得粗酶液，用质量分数 为40~70%的硫酸铵梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl缓冲液重悬沉淀、透 析；用pH 10.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，酶活 峰在穿过峰中；收集有酶活的组分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡SP Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，用0~1M NaCl梯度洗脱， 在0.25M NaCl处洗脱出有酶活的组分，即得纯化后的角蛋白酶Ker FJ。
[0011] 利用SDS-PAGE检测各纯化步骤获得的角蛋白酶Ker FJ的纯度（图1)。经过硫酸铵 梯度沉淀和两步离子交换层析，我们获得了电泳纯的角蛋白酶Ker FJ。
[0012] 本发明中，枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16于2016年01月20日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC N0.12086,保藏地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Bacillus subtilis。
[0013] 本发明中，所述粗酶液的发酵培养基为：
[0014] FM3培养基（g ? L-玉米粉20,大豆粉20,麸皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇43，CaCl2 l，pH 7.5。
[0015]发酵培养的条件为:温度为30°C，转速为200rpm，培养72h，接种量为6 % (体积比）。 [0016]发酵培养后，获得粗酶液的方法：
[0017]用纱布过滤发酵培养后的渣滓，llOOOrpm离心15min，收集发酵液上清即为粗酶 液。
[0018]本发明中角蛋白酶Ker FJ分离纯化的具体步骤为：
[0019] (1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16单菌落用接种针接种至LB液体 培养基中，30°C，200rpm培养18h;
[0020] LB液体培养基(g ? L-1蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10，pH 7.5;
[0021] (2)将LB液体培养基中的对数期种子液按6% (体积比）接种量接种于FM3培养基 中，30°C，200rpm 培养 72h;
[0022] FM3培养基（g ? L-玉米粉20,大豆粉20,麸皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇43，CaCl2 l，pH 7.5；
[0023] (3)用纱布过滤掉步骤(2)培养后的培养基渣滓，llOOOrpm离心15min收集发酵液 上清即为粗酶液；
[0024] (4)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16发酵培养，获得粗酶液，用质量 分数为40~70 %的硫酸铵梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl缓冲液重悬沉淀、 透析；用pH 10.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，酶 活峰在穿过峰中；收集有酶活的组分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液透析；用pH 7.0， 50mM Tris-HCl缓冲液平衡SP Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，用0~1M NaCl梯度 洗脱，在0.25M NaCl处洗脱出有酶活的组分，即得纯化后的角蛋白酶Ker FJ。
[0025] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0026] 现有技术中，多种细菌分泌的蛋白酶多是通过离子交换层析与分子筛层析相结合 达到纯化目的。与分子筛层析相比，离子交换层析具有上样量大、流速快、耗时短、操作简 便、收集的样品浓度高等优点。本发明首先利用Q阴离子柱除去粗酶液的色素组分，再利用 SP柱分离其他杂质组分而获得纯酶，纯化步骤操作简单、回收率高、纯化效果好。通过本发 明纯化方法，1L B.subtilis FJ-3-16发酵液可收获角蛋白酶Ker FJ纯酶16.59mg，总酶活 2989U。且获得的角蛋白酶Ker FJ在畜禽废弃物降解、脱毛及作为洗涤剂添加剂方面均有非 常好的效果。
【附图说明】
[0027]图1为分离纯化角蛋白酶Ker FJ的SDS-PAGE检测图；
[0028]图2为为进化树分析菌株B.subtilis FJ-3-16的进化位置图；
[0029]图3为角蛋白酶Ker FJ对天然角蛋白底物羽毛和羊毛的膨胀和降解图；
[0030]图4为角蛋白酶Ker FJ对羊皮和驴皮的脱毛作用图；
[0031]图5为角蛋白酶Ker FJ在各品牌洗涤剂中保温lh、6h、12h后测残余酶活；
[0032]图6为角蛋白酶Ker FJ作为洗涤剂添加剂，对不同污渍（番茄酱、姜粉、甜面酱、辣 酱。血渍)的去污效果图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0034] 实施例1角蛋白酶的分离纯化方法，具体步骤如下：
[0035] (1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16单菌落用接种针接种至LB液体 培养基中，30°C，200rpm培养18h;
[0036] LB液体培养基(g ? L-1蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10，pH 7.5;
[0037] (2)将LB液体培养基中的对数期种子液按6% (体积比）接种量接种于FM3培养基 中，30°C，200rpm 培养 72h;
[0038] FM3培养基（g ? L-玉米粉20,大豆粉20,麸皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇4 3，CaCl2 l，pH 7.5；
[0039] (3)用纱布过滤掉步骤(2)培养后的培养基渣滓，11 OOOrpm离心15min收集粗酶液；
[0040] (4)用质量分数为40~70%的硫酸铵梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0,50mM Tris- HC1缓冲液重悬沉淀、透析；用pH 10.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow 离子交换柱，上样，酶活峰在穿过峰中；收集有酶活的组分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲 液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡SP Sepharose fast-flow离子交换柱，上样， 用0~1M NaCl梯度洗脱，在0.25M NaCl处洗脱出有酶活的组分，即得纯化后的角蛋白酶Ker FJ。
[00411利用SDS-PAGE检测角蛋白酶Ker FJ的纯度，如图1所示，获得电泳纯的角蛋白酶 Ker FJ。
[0042]枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16从家禽屠宰场长期堆放羽毛废弃物的 土壤中筛选获得，于2016年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，菌种保藏号CGMCC N0.12086,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为 Bacillus subtilis。
[0043]实施例2B. subtil is FJ-3-16 菌种鉴定
[0044] 1^液体培养基(8/1):蛋白胨10.0、酵母粉5.0、似(：110.〇4117.5。如用于转化子 筛选，培养基中加入终浓度50yg/mL氨苄青霉素(Amp)。
[0045] 1^固体培养基(8/1):蛋白胨10.0、酵母粉5.0、恥(：110.0，琼脂15.0 4117.5。
[0046]将FJ-3-16菌株单菌落接种于5mL液体LB培养基中，37°C培养过夜。取lmL培养好的 菌液，按照"百泰克细菌基因组提取试剂盒"说明书提取细菌总DNA。
[0047]设计16S通用引物2 7F(5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R(5 ' -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '）。以细菌基因组为模板，按照Taq DNA聚合酶说明书中的PCR体 系及程序，PCR获得DNA片段。
[0048] PCR体系如表1所示，PCR程序如表2所示：
[0049]表 1
[0053]利用DNA胶回收试剂盒(Omega)回收DNA片段，操作按试剂盒说明书进行。回收的 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用Solution I连接酶（大连宝生物）连接至载体 pMD19_T easy(大连宝生物)载体上。连接体系lOyl :DNA片段4yl，pMD19_T easy载体lyl， Solution I 5yl。连接条件：16°C，8h。连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，转化方法按 照《分子克隆实验指南》（第三版）（萨姆布鲁克，拉塞尔著，2002)说明进行。按照pMD19-T easy载体序列设计引物 Ml 3F: CAGGAAACAGCTATGAC，Ml 3R: GTTTTCCCAGTCACGA，利用菌落 PCR 方法筛选转化子，PCR体系及程序同上述。转化子测序在铂尚生物技术(上海)有限公司完 成。
[0054] 测序共测得16S rRNA序列全长1514bp。将序列在NCBI数据库中BLAST比对分析 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ?PR0GRAM = blastn&PAGE_TYPE = BlastSearch&LINK_LOC = blasthome)，序列一致性较高的均为枯草芽抱杆菌Baci 1 lus subtilis，identity为99 %。利用Clustalx XI ? 83软件对序列一致性较高的菌株的16S rRNA进行多重比对，利用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-Joining Method)绘制序列进 化树，如图2所示。
[0055]实施例3角蛋白酶Ker FJ的酶活测定
[0056] 取lml稀释好的粗酶液加入lml质量分数为2%的keratin底物(TCI公司，K0044)， 在55°C反应lh后加入2ml 0.4M TCA终止反应，llOOOrpm离心2min后取上清lml，加入5ml 0.4M Na2C〇3和lml Fol in试剂，在40°C显色20min后，在660nm比色，在660nm每分钟吸光值升 高0.1定义为1个酶活单位(U)。
[0057]蛋白浓度测定
[0058]根据"BCA蛋白浓度测定试剂盒"说明书操作(碧云天生物技术），本发明中获得的 B.subtilis FJ-3-16发酵液，1L中角蛋白酶总酶活73820.16U。利用本发明纯化方法，1L B.subtilis FJ-3-16发酵液可收获角蛋白酶Ker FJ纯酶16.59mg，总酶活2989U。
[0059]实施例3本发明获得的角蛋白酶Ker FJ的应用 [0060] 1、畜禽废弃物降解
[0061]角蛋白酶Ker FJ底物广泛，能降解酪蛋白（casein )、可溶性角蛋白（参考 Wawrzkiewi方法自制，Wawrzkiewicz K et al.，J Med Vet Mycol, 1987,25:261-268)、羽 毛粉、羊毛粉、天青角蛋白（Keratin azure,Sigma,K8500)、keratin(TCI公司，K0044)等。 [0062]角蛋白酶Ker FJ对天然羽毛、羊毛的降解：
[0063] 酶解条件：45°C，150rpm酶解48h。未灭菌的羊毛、羽毛2.5mg/ml，酶浓度25U。添加 0-ME质量浓度为0.1%。
[0064]酶解结果：角蛋白酶Ker FJ对天然状态下的羽毛和羊毛有很强的降解作用，酶解 时羽毛的羽枝部分从羽轴上解离、坚硬的羽轴断裂，羊毛团变松散。在还原剂P-ME(0.1%) 存在时降解更彻底，降解率由30%提高到80%，如图3所示。
[0065] 2、脱毛作用
[0066] 实验条件:45°C，150rpm酶解24h。驴皮、羊皮购自屠宰场，切成5cm X 5cm小块;酶浓 度 45U。
[0067]实验结果：角蛋白酶Ker FJ对黑驴皮和白羊皮的脱毛效果显著，且该酶没有胶原 酶活性、有微弱弹性蛋白酶活性；目视观察脱毛后的皮张纹路完整、毛孔清晰，皮张的胶原 层未受破坏，如图4所不。
[0068] 3、作为洗涤剂添加剂
[0069] 角蛋白酶Ker FJ催化角蛋白水解的最适pH 9.0~9.5;pH稳定性良好，在pH 6.0~ 11.5范围内酶活稳定，pH12.0时仍保持90 %酶活。该酶最适酶活温度55 °C ;热稳定性良好， 40°(：时酶活半衰期约10.611。该酶属于中温碱性角蛋白酶。金属离子此2+、1( +、似+、512+、1^2+、 Mg2+、Ca 2+、Ba2+对酶活无影响;5mM还原剂DTT、DTNB、P-ME使酶活提高10% ;质量分数为1 %的 去垢剂皂苷、作1切11乂-100、1'冊611-80不仅不能使酶活降低，还能使酶活提高104~32.56% 不等;质量分数为1~3 %的氧化剂H2O2对酶活无降低作用。上述数据表明角蛋白酶Ker FJ的 抗逆性能优异。
[0070] (1)实验条件:角蛋白酶Ker FJ稀释到合适浓度，与质量分数为2%的洗涤剂1:1混 合，混合后酶浓度40U/ml，在室温下保温lh、6h、12h后，利用Fol in-酸法测残余酶活。以不与 洗涤剂混合的角蛋白酶Ker FJ保温lh时的酶活作为100%。
[0071]实验结果：角蛋白酶Ker FJ在市售液体洗涤剂奥妙、立白、开米、碧浪、蓝月亮、安 利中，室温保温1~12h酶活不仅不降低，反而有所升高；在超能、白猫中保温lh仍能残留 95 %以上酶活;在雕牌、汰渍中酶活降低，如图5所示。
[0072] (2)实验条件：碧浪洗涤剂浓度1%，酶浓度9.6U/ml，洗涤条件：30°C，150rpm洗涤 lh〇
[0073]实验结果:与不添加角蛋白酶Ker FJ质量分数为1%的碧浪相比，添加了酶的洗涤 剂在洗涤番茄酱、姜粉、甜面酱、辣酱、血渍等污渍时，洗涤效果更好，如图6所示。
[0074]上述结果表明角蛋白酶Ker FJ具备开发成洗涤剂添加剂的应用潜力。
【主权项】
1. 一种角蛋白酶的分离纯化方法，步骤如下： 将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16发酵培养，获得粗酶液，用质量分数为40 ~70 %的硫酸铵梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl缓冲液重悬沉淀、透析；用 pH 10.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，酶活峰在 穿过峰中；收集有酶活的组分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡SP Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，用0~1M NaCl梯度洗脱， 在0.25M NaCl处洗脱出有酶活的组分，即得纯化后的角蛋白酶Ker FJ; 所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16于2016年01月20日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO. 12086,保藏地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Bacillus subtilis。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粗酶液的发酵培养基为： FM3培养基（g.L-玉米粉20,大豆粉20,麸皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇4 3，CaCl2 1，ρΗ 7.5。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粗酶液发酵培养的条件为:温度为30°C，转 速为200rpm，培养72h。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，粗酶液发酵培养时接种量为6 % (体积比）。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述粗酶液的制备方法： 用纱布过滤发酵培养后的渣滓，llOOOrpm离心15min，收集发酵液上清即为粗酶液。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述角蛋白酶的分离纯化的具体步骤为： (1) 将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16单菌落用接种针接种至LB液体培养 基中，30°C，200rpm培养 18h; LB液体培养基(g · L-1):蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7 · 5; (2) 将LB液体培养基中的对数期种子液按6 % (体积比）接种量接种于FM3培养基中，30 °C，200rpm 培养 72h; FM3培养基（g.L-玉米粉20,大豆粉20,麸皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇4 3，CaCl2 1，ρΗ 7.5; (3) 用纱布过滤掉步骤(2)培养后的培养基渣滓，llOOOrpm离心15min收集发酵液上清 即为粗酶液； (4) 将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16发酵培养，获得粗酶液，用质量分数 为40~70%的硫酸铵梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl缓冲液重悬沉淀、透 析；用pH 10.0，50mM Tris-HCl缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，酶活 峰在穿过峰中；收集有酶活的组分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl缓冲液平衡SP Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，用0~1M NaCl梯度洗脱， 在0.25M NaCl处洗脱出有酶活的组分，即得纯化后的角蛋白酶Ker FJ。7. 如权利要求1-6任一项所述方法制备的角蛋白酶在畜禽废弃物降解方面的应用。8. 如权利要求1-6任一项所述方法制备的角蛋白酶在脱毛方面的应用。9. 如权利要求1-6任一项所述方法制备的角蛋白酶在作为洗涤剂添加剂方面的应用。
【文档编号】C12R1/125GK105821023SQ201610289190
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】边斐, 岳寿松, 张晓玮, 朱耀霞, 马德源, 彭振英, 陈高, 毕玉平, 宣宁
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心