一种Fbxo40基因敲除猪的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种Fbxo40基因敲除猪的制备方法。本发明将CRISPR/Cas9打靶载体及PGK?Neo抗性基因共同转染猪胎儿成纤维细胞，获得G418抗性的阳性单克隆细胞，阳性单克隆细胞中的Fbxo40基因发生插入/缺失突变、且读码框产生移码并提前终止，将这样的细胞克隆作为核移植的供体细胞，以卵母细胞作为核移植的受体卵母细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎，将优质的克隆胚胎移植到发情母猪输卵管内，通过全期发育并获得Fbxo40基因敲除的克隆猪。本发明利用CRISPR/Cas9的基因编辑技术，低成本、高效率地获得了Fbxo40敲除猪，为研究肌肉发育及肌肉相关疾病提供了动物模型。
【专利说明】
一种Fbxo40基因敲除猪的制备方法
技术领域
[00011本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/ Cas9系统对猪Fbx040基因进行编辑，并通过体细胞核移植技术获得Fbx040基因敲除猪。
【背景技术】
[0002] IGF1可以通过激活IGF1R/IRS1/PI3K/AKT通路，导致肌肉的肥大，但在分化的肌肉 细胞中，IGF1的底物IRS1会被泛素化，并被蛋白酶体降解，从而导致IGF1信号通路的中断。 研究发现，介导IRS1快速转化的是E3泛素连接酶Fb X〇4(LFbX〇40-SCF-E3蛋白复合体能够直 接将IRS1泛素化，并且当IRS1的酪氨酸磷酸化时，这种泛素化作用会增强。在小鼠中敲除 Fbx 〇40之后，肌纤维显著增粗。在小鼠的快速生长期，IGF1处于高表达的状态，Fbx〇40敲除 之后，IRS1表达量会发生上调，小鼠的体重及肌肉量发生显著增加。
[0003] Fbx〇40可以作为大动物育种的一个候选基因。Fbx〇40的表达是肌肉特异的。在小 鼠中的报道表明，Fbx 〇40从出生后第四天开始表达，在青春期达到最高峰。首先，在小鼠中， Fbx〇40通过降解IRS1，阻断IGF1的信号通路。文献报道，在猪各个组织半定量的结果表明 Fbx 〇40在背最长肌及心肌中表达量最高，在其他组织中低表达，但Fbx〇40在猪中的信号通 路还没有研究。那么在猪中，Fbx 〇40的相关通路是否与小鼠一致呢?现有的文献资料并没有 给出这方面的报道。
[0004] 其次，在小鼠中报道的Fbx〇40只在骨骼肌、心肌中表达，且局限于分化的肌肉细胞 中表达。Fbx 〇40敲除小鼠表现出了显著的肌肉增加，并且没有其他异常表型出现。因而 Fbx〇40基因对于农业上大动物的育种改良，以及医学上肌肉萎缩的治疗具有重要的意义。
[0005] 因而通过制备Fbx〇40基因敲除猪，在此模型的基础上阐明Fbx〇40在猪肌肉发育中 信号通路的作用，具有重要的意义。
[0006] CRISPR/Cas9是一种存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统。利用人工合成的 sgRNA序列与基因组DNA的碱基互补配对，Cas9核酸内切酶可以实现基因组的定点切割，从 而产生DNA的双链断裂。DNA双链断裂可以通过两种方式进行修复：其一是采取非同源末端 连接修复方式(NHEJ)，这种方式会在双链断裂处产生随机类型的插入/缺失修复，可能会造 成基因的移码突变，造成基因功能缺失。另一种修复方式是在以单链寡核苷酸或者双链 Donor质粒载体为模板的指导下，通过同源重组(HR)的方式实现预期的精准修复。CRISPR/ Cas9系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本 低、作用高效。CRISPR/Cas9系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基 因功能研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种Fbx〇40基因敲除猪的制备方法，是利用CRISPR_Cas9系 统对Fbx 〇40基因进行编辑，并通过体细胞核移植技术获得Fbx〇40基因敲除猪。
[0008] 本发明首先提供了猪Fbx〇40基因第三外显子在制备Fbx〇40基因敲除猪中的用途。 所述猪Fbx〇40基因第三外显子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]本发明首先提供了猪Fbx〇40基因第四外显子在制备Fbx〇40基因敲除猪中的用途。 所述猪?1?〇40基因第四外显子的核苷酸序列如5￡0 10从).4所示。
[0010]本发明提供了特异性靶向猪Fbx〇40基因第三外显子的sgRNA，其序列为5'- 七区1：(^8丨8〇1:〇〇〇(^88〇88388-3'（如3￡(>)10勵.2所示）。与其互补配对的寡核苷酸序列为5'- cctccgccaggggagcacagaca-3'（如SEQ ID 勵.3所不）〇
[0011]本发明提供了上述sgRNA在制备Fbx〇40基因敲除猪中的应用。
[0012] 本发明提供了上述sgRNA在动物种质资源改良中的应用。
[0013] 本发明提供了上述sgRNA在构建与肌肉发育和肌肉疾病相关医学研究的动物模型 中的应用。
[0014] 本发明还提供了含有上述sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。
[0015] 本发明所述的CRISPR/Cas9打靶载体，其通过以下方法制备得到，将SEQ ID N0.2、 3所示的寡聚核苷酸在94°(：，51^11，37°(：，1〇1^11，然后立即放冰上对寡聚核苷酸进行退火 5min;px330骨架载体用限制性内切酶Bbsl进行酶切，回收后，与退火的寡聚核苷酸连接。 [0016]在本发明的一个实施例中命名该CRISPR/Cas9打靶载体为pX330 1-8,本发明提供 了该CRISPR/Cas9打靶载体在猪育种中的应用。
[0017]本发明提供了 CRISPR/Cas9打靶载体在构建与肌肉发育和肌肉疾病相关医学研究 的动物模型中的应用。所述的肌肉疾病包括肌肉萎缩。
[0018]本发明提供了该CRI SPR/Cas9打靶载体在制备肌肉量提高的转基因猪中的应用。 [0019]本发明还提供了一种制备Fbx〇40基因敲除猪的方法，将本发明的CRISPR/Cas9打 靶载体PX330 1-8与PGK-Neo基因线性载体共转入猪胎儿成纤维细胞中，G418筛选获得具有 抗性的阳性细胞克隆；以阳性细胞为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞，通过体 细胞核移植技术获得克隆胚胎;将克隆胚胎移入猪输卵管内妊娠获得Fbx 〇40基因敲除的克 隆猪。
[0020] 其中，CRISPR/Cas9打靶载体PX330 1-8与PGK-Neo基因线性载体共转入猪成纤维 细胞的方法为：CRISPR/Cas9打靶载体pX330 1-8加入2yg，并与PGK-Neo基因线性载体按照 摩尔比3:1混合，用电击转染或脂质体转染的方法转入猪成纤维细胞。
[0021] 本发明研究了 Fbx〇40基因第三、第四外显子，从众多备选的SgRNA中筛选了最优的 sgRNA，其特异性靶向Fbx 〇40基因第三外显子。利用CRISPR/Cas9的基因编辑技术，低成本、 高效率地获得了 Fbx〇40基因敲除猪。本发明一方面为阐明Fbx〇40在猪中信号通路提供了动 物模型，方便医学领域以此模型进一步研究肌肉发育及肌肉相关疾病，另一方面本发明的 方法为培育高瘦肉率的猪的新品系提供了技术依据。
【附图说明】
[0022]图1是本发明实施例1中CRSIPR/Cas9的sgRNA设计位置及序列示意图。
[0023]图2是本发明实施例4中使用PCR方法扩增靶点周围序列电泳结果图。通过与野生 型比较条带大小，检测单克隆细胞的打靶情况。图中泳道1-56分别为细胞单克隆的编号，图 中Marker为100bp DNA ladder，第5泳道为5#细胞单克隆，PCR产物大小约为643bp，第31泳 道为31#细胞单克隆，PCR产物大小约为1331bp。
[0024]图3A-图3D是本发明实施例4中，对单克隆细胞5#及31#进行测序后，序列比对的结 果图。图3A，图3B显示31#细胞单克隆的7个单克隆菌落与野生型序列相比，均发生了3bp的 替换，同时发生了323bp的插入，产生了移码突变及翻译的提前终止。图3C，图3D显示，5#细 胞单克隆的6个单克隆菌落与野生型序列相比，均缺失了365bp，删除了Fbx 〇40的重要结构 域，并产生了移码突变及翻译的提前终止。
[0025]图4A和图4B是本发明实施例5中，使用PCR方法鉴定新生猪的突变类型。图中每个 泳道对应本发明制备得到的不同编号Fbx〇40基因敲除猪的PCR结果。
[0026]图5是本发明实施例5中，使用Western blot的方法检测新生猪背最长肌中Fbxo40 蛋白的表达水平。
[0027] 图6是本发明实施例5中，使用Western blot的方法检测新生猪心肌中Fbxo40蛋白 的表达水平。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029] pX330载体、PGK-Neo载体购于Addgene公司；T4DNA连接酶、Q5超保真酶、Bbsl及 T7EN1购于NEB公司；引物合成由上海生工完成;测序由美吉生物公司合成。质粒去内毒素提 取试剂盒及基因组提取试剂盒购于QIAGEN公司。胶回收试剂盒购于GENSTAR公司。酶切、连 接、切胶回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
[0030] 实施例1 CRSIPR/Cas9打靶载体PX330 1-8的构建
[0031] 1、猪Fbxo40基因特异性sgRNA的设计和筛选
[0032] 猪Fbx〇40基因的第三外显子、第四外显子序列编码Fbx〇40蛋白重要的结构域一一 zinc-finger结构域和F_box结构域。
[0033] 根据CRISPR/Cas9的作用原理，在第三外显子及第四外显子的不同位置，共设计了 17条sgRNA序列。其序列及互补的序列如表1所示。
[0034]表 1
[0037] 表1中粗体部分为CRISPR/Cas9识别的PAM序列。
[0038] pX330载体骨架需要使用Bbsl进行酶切，所以需要在sgRNA序列上补出Bbsl酶切位 点的粘性末端，以利于其连入PX330载体骨架。
[0039]将设计好的加入Bbsl酶切位点粘性末端的sgRNA及其互补序列以合成引物的方式 进行合成。将合成的寡核苷酸进行退火操作，使其形成带有粘性末端的DNA双链。退火程序 如下：94°C，5min; 37°C，lOmin;冰上，51^1^X330载体骨架使用Bbsl酶切，37°C水浴4h。然后 进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的条带。载体骨架与sgRNA序列连接。将回收的载体骨 架与sgRNA序列退火产物于16°C连接仪进行连接过夜。将连接产物转化DH5a感受态细胞，37 °C培养箱培养，待其长出单克隆菌落后，挑取单克隆菌落划线，并进行测序鉴定阳性单克隆 菌落。测序引物为PX-F: 5 ' -GAGGGCCTATTTCCCATGAT-3 '，其位于pX330载体骨架上。
[0040]挑取测序正确的阳性单克隆菌落，将其加入2-5ml氨苄抗性的LB培养基中，于摇床 中37°C，300rpm剧烈摇动8h。将初始培养的菌液以1/500-1/1000的稀释比例加入到100ml氨 苄抗性的LB培养基中，于摇床中37°C，300rpm剧烈摇动12h-16h。
[0041 ] CRISPR/Cas9打靶载体质粒的去内毒提取：参见QIAGEN公司的EndoFree Plasmid Maxi Kit说明书。将提取好的质粒测浓度后分装、冻存，用于后续的猪胎儿成纤维细胞的转 染。
[0042]将一个六孔板孔中，已达到80-90%汇合的猪胎儿成纤维细胞，进行消化、离心，获 得数量约2 X 105-2 X 106的猪胎儿成纤维细胞。将CRISPR/Cas9打靶载体2yg，加入到Lonza转 染试剂中，混匀，使用加入质粒的转染试剂重悬细胞，并将细胞悬液加入到电击杯中，T-016 程序电击细胞。电击完成后，立即将细胞吸出，加3ml含10%血清的DMEM到六孔板的一个孔 中。37°C，5 %C02培养箱培养48h后，细胞达到80 %-90 %汇合，将细胞消化下来，提取细胞的 基因组，作为PCR扩增的模板。在sgRNA靶点的上游设计PCR上游扩增引物F，在sgRNA靶点的 下游设计PCR下游扩增引物R。利用PCR扩增包括sgRNA靶点的上下游序列，将PCR产物连接 peasy-blunt-s impl e载体，将连接产物转化DH5a感受态细胞，37 °C培养箱培养，待其长出单 克隆菌落后，随机挑取一定数量的单克隆菌落进行测序。将各个单克隆菌落测序结果与野 生型Fbx 〇40的序列进行比对，认定发生了碱基插入/缺失的单克隆为阳性单克隆菌落。将阳 性单克隆菌落个数除以测序的单克隆菌落总数，就是不同CRISPR/Cas9打靶载体的切割效 率。如表2所示。
[0043]表 2
[0046] 由表2可知，在猪Fbx〇40基因第三外显子及第四外显子设计的17条sgRNA靶点的切 割效率在2%-68%之间。为了避免过高的切割效率造成脱靶效应，本发明选取了效率适中 (34.6%)，且位置比较靠前(便于产生移码突变，使切割位点后面的蛋白序列发生改变及提 前终止)的1 -8靶点作为用于制备打靶克隆猪的sgRNA。
[0047] 2、CRSIPR/Cas9 打靶载体 pX330 1-8 的构建
[0048]选取了cas9祀点 1-8:5'-tgtctgtgctcccctggcggagg-3'。根据碱基互补配对的原 贝1J，其反向互补序列为5'_cctccgccaggggagcacagaca_3'。
[0049] pX330载体骨架需要使用Bbsl进行酶切，所以需要在sgRNA序列上补出Bbsl酶切位 点的粘性末端，以利于其连入PX330载体骨架。加入Bbsl粘性末端的sgRNA序列及其互补序 ?L^Sl^5'-CACCGtgtctgtgctcccctggcgg-3'，5'_AAACccgccaggggagcacagaca C-3'。 [0050]将设计好的加入Bbsl酶切位点粘性末端的sgRNA及其互补序列以合成引物的方式 进行合成。将合成的寡核苷酸进行退火操作，使其形成带有粘性末端的DNA双链。退火程序 如下：94°C，5min; 37°C，lOmin;冰上，51^1^X330载体骨架使用Bbsl酶切，37°C水浴4h。然后 进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的条带。载体骨架与sgRNA序列连接。将回收的载体骨 架与sgRNA序列退火产物于16°C连接仪进行连接过夜。将连接产物转化DH5a感受态细胞，37 °C培养箱培养，待其长出单克隆后，挑取单克隆划线，并进行测序鉴定阳性单克隆。测序引 物为PX-F: 5 ' -GAGGGCCTATTTCCCATGAT-3 '，其位于pX330载体骨架上。构建好的质粒命名为 pX330 1-8〇
[00511挑取测序正确的阳性单克隆菌落，将其加入2-5ml氨苄抗性的LB培养基中，于摇床 中37°C，300rpm剧烈摇动8h。将初始培养的菌液以1/500-1/1000的稀释比例加入到100ml氨 苄抗性的LB培养基中，于摇床中37°C，300rpm剧烈摇动Wh-iehpXSSO 1-8质粒的去内毒提 取参见步骤1。
[0052]实施例2猪胎儿成纤维细胞的建系
[0053]将妊娠30天的小香猪麻醉，从其子宫内无菌取出胎儿，用含双抗的PBS清洗胎儿 后，置于超净工作台中，用眼科剪去除胎儿的头部、四肢、内脏及软骨组织，用PBS冲洗干净； 在细胞培养皿内用眼科剪将剩余组织剪碎成约1_ 3小块;加入适量的FBS，保持组织不至于 过分干燥。将剪碎的组织块转移到1个T75细胞培养瓶中，将组织块均匀铺开;加入5mL细胞 培养基，将铺有组织块的一面向上，不被培养基浸没，于37 °C，5 %⑶2培养箱中培养3~5h 后，将T75翻转，使组织块被培养基浸没;培养3天左右，观察到组织块周围有大量细胞爬出， 待细胞生长至约90 %汇合度时，对细胞进行消化并冻存备用。
[0054] 实施例3猪胎儿成纤维细胞的转染和中靶细胞单克隆的筛选
[0055] l、PGK_Neo质粒的酶切
[0056] 使用NEB公司的限制性内切酶Not I和Nhe I对PGK-Neo质粒酶切，37 °C水浴4h。使用 Genstar的胶回收试剂盒回收PGK-Neo大小为1.8kb的片段。测浓度后分装，冻于-20°C冰箱 备用。
[0057] 2、将一个六孔板孔中，已达到80-90%汇合的猪胎儿成纤维细胞，进行消化、离心， 获得数量约2 X 105-2 X 106的猪胎儿成纤维细胞。
[0058] 3、CRISPR/Cas9打靶载体pX330 1-8加入2yg，并与PGK-Neo基因线性载体按照摩尔 比3:1加入Lonza转染试剂中，混匀。使用加入质粒的转染试剂重悬细胞，并将细胞悬液加入 到电击杯中，T-016程序电击细胞。电击完成后，立即将细胞吸出，加3ml含10%血清的DMEM 到六孔板的一个孔中。37 °C，5 % C02培养箱培养48h后，细胞达到80 % -90 %汇合，将细胞消 化下来，稀释至20-30个10cm细胞培养皿中。24-48h后，待10cm皿中的细胞贴壁、且状态良 好，加入400-600μg/ml的G418，每隔一天补加一次G418，加药量根据细胞状态及汇合度灵活 掌控，但最高浓度不能超过1000^/1111X418筛选8-12天后，可见优质细胞单克隆。
[0059] 4、细胞单克隆的挑取及扩大培养。在显微镜下，使用记号笔将状态良好的单克隆 用圆圈圈出。弃掉10cm培养皿中的培养基，PBS清洗一次，将克隆环蘸取明胶，用克隆环将细 胞单克隆圈住，加入10-30y 1 0.1 %的胰蛋白酶，37 °C消化lmin。在显微镜下观察，细胞变 圆、游离，加入含20%FBS的DMEM终止消化，将细胞吸出加入24孔板中。48-72h后，24孔板中 细胞汇合至80-90 %时，将细胞传至12孔板中。待12孔板中细胞达到80 % -90 %汇合时，对细 胞进行冻存。
[0060] 实施例4中靶阳性细胞单克隆的鉴定
[0061] 由于Cas9的切割造成双链断裂，NHEJ的修复方式会随机产生插入/缺失突变，因此 需要以打靶细胞单克隆的基因组为模板，PCR扩增打靶位点所在区域，对其区域进行测序， 检测其喊基的插入/缺失突变的情况。
[0062]提取48个细胞单克隆的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物为^11_ 1-(0，1，2)-2_F 5'_gcaacaggtcaaggatccag_3'及xin_l-(0，l，2)-2-R 5'-gcgcactgatgagcttgtta-3'，以野生型细胞的基因组作为阴性对照，其PCR产物大小约为 1008bp 1CR程序如下：98 °C，30s; 98°C，10s; 67 °C，30s; 72°C，lmin; 72 °C，2min。35个循环。缺 失或者插入大片段的细胞单克隆，可以使用琼脂糖凝胶电泳进行初步判定。可知5#细胞单 克隆发生大片段缺失，31#细胞单克隆发生了大片段的插入。如图2所示，5#细胞单克隆发生 了大片段的缺失，与6#细胞单克隆(其条带大小与野生型大小相同）相比，可见，5#细胞单克 隆的条带要小一些。同理，31#细胞单克隆发生了大片段的插入，与29#细胞单克隆（其条带 大小与野生型大小相同）相比，可见，31#细胞单克隆条带要大一些。38#细胞单克隆和25#细 胞单克隆与5#细胞单克隆类似，它们也发生了大片段缺失。综合考虑上述细胞单克隆的状 态，本发明选择了状态最佳的5#细胞单克隆和31#细胞单克隆，其更适合作为体细胞核移植 的供体细胞。
[0063]为了进一步确定5#细胞单克隆、31#细胞单克隆的突变类型，将PCR产物连接 peasy-simple blunt载体，将连接产物转化DH5a感受态细胞，37°C培养箱培养，待其长出单 克隆菌落后，随机挑取一定数量的单克隆菌落进行测序。将各个单克隆菌落测序结果与野 生型Fbxo40的序列进行比对。
[0064] 对于31#细胞单克隆，随机挑取的7个单克隆菌落与野生型Fbx〇40序列相比，由图 3A，图3B可知，它们均发生了 3bp的替换，同时发生了 323bp的插入，由此证明31#细胞单克隆 发生了 3bp的替换，同时发生了 323bp的插入，产生了移码突变及翻译的提前终止。图3A为5' 端序列比对结果，图3B为3'端序列比对结果。
[0065] 对于5#细胞单克隆，随机挑取的6个单克隆菌落与野生型Fbx〇40序列相比，由图 3C，图3D可知，它们均缺失了 365bp，由此可知5#细胞单克隆缺失了 365bp，删除了Fbxo40的 重要结构域，并产生了移码突变及翻译的提前终止。图3C为5'端序列比对结果，图3D为3'端 序列比对结果。
[0066] 实施例5 Fbxo40基因敲除猪的制备
[0067] 1、以实施例4获得的阳性猪胎儿成纤维细胞为核移植供体细胞。培养胎儿成纤维 细胞至100 %汇合1 -2天，去除培养皿内培养基，加入PBS洗涤1次，然后用0.1 %胰蛋白酶消 化约2min，待细胞变圆后立即后用含血清的细胞培养液终止消化，lOOOrpm离心5min，弃上 清，用操作液T2重悬离心沉淀的细胞，冰浴放置备用。
[0068] 以体外成熟的卵母细胞为核移植受体卵质。从母猪卵巢中采集卵丘卵母细胞复合 体，经过体外成熟并用透明质酸酶脱去卵丘细胞，而后在体式显微镜下挑选排出第一极体、 形态正常、胞质均匀的成熟卵母细胞备用。
[0069] 在显微操作仪下，将核移植供体细胞移入去核的成熟卵母细胞中。经过电融合及 化学激活，诱导细胞与卵子融合并同时激活卵母细胞。构建成重组胚胎，融合胚放入低氧培 养环境下（低氧培养箱或充入低氧混合配气封袋密闭培养)培养。采用微滴或四孔板培养， 气相条件为含7 %02、88%N2、和5 %C02的混合气体，培养温度为39°C，湿度为100%。体外发 育至1-4细胞期后观察卵裂情况及发育状态，并用于胚胎移植。
[0070] 挑选形态正常、发育优良的克隆胚胎用手术法移植入胚胎同期的母猪内。移植步 骤为舒泰常规麻醉，将母猪保定在手术架上面，尽量避开血管，在腹中线处切口，露出卵巢， 输卵管及子宫，使用胚胎移植管吸取胚胎，然后沿输卵管伞部进入将克隆胚胎释放到输卵 管壶腹部、峡部结合处。胚胎移植后给代孕母猪注射消炎针，30天后进行B超检测妊娠情况。
[0071] 2、Fbxo40基因敲除猪的DNA水平检测：
[0072]使用新生猪的耳组织提取基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。新生公猪7801#、 7802#、7803#、7804#、7901#、9402#的卩〇时广增引物为叉111-1-(0，1，2)-2-?5'-gcaacaggtcaaggatccag-3'及xin_l-(0，1，2)_2_R 5'-gcgcactgatgagcttgtta-3'。野生型 猪的PCR产物大小约为1008bp。若新生猪来自5#克隆点，则PCR产物大小约为643bp。若新生 猪来自31#克隆点，则PCR产物大小约为1331bp。
[0073] 如图4A和图4B所示，可知编号为（7802#、7803#、7804#、7901#、9402#)的新生公猪 来自5#克隆点，编号为(7801#)的新生公猪来自31#克隆点。
[0074] 3、Fbx〇40基因敲除猪的蛋白水平检测：
[0075] 取 7801#、7802#、7803#、7804#四头卩匕1〇40基因双敲以及304#、6#、254#、364#、11# 等野生型同日龄对照猪的心肌及背最长肌组织l〇〇mg，提取总蛋白，进行Western blot检测 Fbxo40的表达水平。
[0076] Western blot实验中，蛋白上样量为SOugaSDS-PAGE分离胶浓度为10%。60乂电泳 30min，90V电泳lh。电泳结束后，使用Bio-Rad转膜仪进行转膜，300mA恒流，111。5%的脱脂奶 粉封闭过夜，Fbxo40-抗（1:1000稀释）室温孵育lhTBST洗膜6 X 5min。山羊抗兔二抗（1: 10000稀释)室温孵育lhJBST洗膜6 X5min。进行显影。由结果可知，在双敲猪的背最长肌及 心肌组织中均未法检测到Fbx〇40蛋白的表达，而同日龄的野生型对照个体均可检测到 Fbx 〇40蛋白的表达。如图5,图6所示。结果说明，本发明构建的CRSIPR/Cas9打靶载体pX330 1-8能够高效、准确地敲除Fbx 〇40基因，从而成功得到Fbx〇40基因敲除猪。
[0077]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 猪Fbx〇40基因第三外显子在制备Fbx〇40基因敲除猪中的用途，所述猪Fbx〇40基因第 三外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 猪Fbx〇40基因第四外显子在制备Fbx〇40基因敲除猪中的用途，所述猪Fbx〇40基因第 四外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3. 特异性靶向猪Fbxo40基因第三外显子的sgRNA，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示。4. 权利要求3所述sgRNA在制备Fbx〇40基因敲除猪中的应用。5. 权利要求3所述sgRNA在动物种质资源改良中的应用。6. 权利要求3所述sgRNA在构建与肌肉发育和肌肉疾病相关医学研究的动物模型中的 应用。7. 含有权利要求3所述sgRNA的DNA序列的CRI SPR/Cas9打靶载体。8. 权利要求7所述的CRISPR/Cas9打靶载体在猪育种中的应用。9. 权利要求7所述的CRISPR/Cas9打靶载体在构建与肌肉发育和肌肉疾病相关医学研 究的动物模型中的应用。10. -种制备Fbx〇40基因敲除猪的方法，其特征在于，将权利要求7所述的CRISPR/Cas9 打靶载体与PGK-Neo基因线性载体共转入猪胎儿成纤维细胞中，G418筛选获得具有抗性的 阳性细胞克隆；以阳性细胞克隆为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细 胞核移植技术获得克隆胚胎;将克隆胚胎移入猪输卵管内妊娠获得Fbx 〇40基因敲除的克隆 猪。
【文档编号】C12N15/873GK105821049SQ201610285534
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】李秋艳, 邹云龙, 李宁, 赵要风, 李志远, 付怡静, 郝海阳
【申请人】中国农业大学