一种新型真核表达系统、其构建方法及应用
【专利摘要】本发明的一种新型真核表达系统、其构建方法及应用属于生物技术领域。本发明设计不同长度的PolyA转录终止基因序列，并采用双启动子的表达方式构建新型真核表达系统。用于目标蛋白质的生产表达，可以提高目标蛋白质的生产表达量。
【专利说明】
一种新型真核表达系统、其构建方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种新型真核表达系统、其构 建方法及应用。
【背景技术】
[0002] CH0表达系统是被目前被广泛应用于大分子蛋白药物制备的真核表达系统。尤其 是抗体类药物，大部分均为CH0表达系统表达。CH0细胞属于哺乳动物细胞，其进化程度高， 有完善的蛋白翻译及修饰系统(含有丰富的内质网和高尔基体)，因而其表达的蛋白从结构 到功能均与人体内蛋白相近，作为药用蛋白，副作用的风险较小。其次，通过成熟的CH0表 达平台，创新性表达Fab片段，加上特异性载体构建，可以高效率的制备复杂结构的大分子 蛋白，包括抗体类药物，其表达量一般都达到克每升的水平，远高于原核表达系统。
[0003] 对于当今生物技术产业而言，如何更经济的进行重组蛋白的大规模表达、纯化，已 成为日益重要的问题。一般而言，重组蛋白的表达主要通过将编码目的蛋白的基因插入到 相应的表达载体后，利用哺乳动物细胞工程株或大肠杆菌细胞工程株进行生产。产生的重 组蛋白质要么直接分泌到细胞外的培养基中，要么就定留在细胞内部。对于后者而言，目的 蛋白的纯化过程就需要增加裂解细胞的步骤，比如超声波法、渗透压休克法、酶解法等。但 是这些裂解细胞的方法都会浆细胞中的其它蛋白释放出来，继而增加了后续纯化的压力。 同样的，对于直接分泌到胞外的蛋白而言，由于培养过程中细胞的希望，也会释放出细胞宿 主蛋白，进而影响下游纯化。对于治疗用的蛋白药物(如抗体)，往往需要较高的纯度来保证 避免杂质带来的毒性或免疫原性。
[0004] 至今为止，抗体及抗体片段的生产主要是依靠哺乳动物细胞，但也有大肠杆菌 E. coli及酵母(毕赤酵母)等系统被使用。选择何种生产方式主要决定于抗体产品的种类、 生产规模、成本、关键风险及生物安全性（Humphreys and Glover, 2001)。此外，也要考虑发 酵平台的成本、操作时间、培养基添加物、资产折旧，以及"下游过程"。而然，对于抗体类的 蛋白药物而言，目前几乎都是使用哺乳动物细胞表达系统。虽然哺乳动物细胞表达系统有 生产成本高，周期长的缺点，但其优势也非常明显：有完善的翻译修饰系统，表达的重组蛋 白空间结构正确率高，即哺乳动物细胞系统表达的蛋白药物质量要远高于原核表达系统。
[0005] 生物制药领域中宿主细胞的选择需要关注以下几个重要的方面：糖基化及其他翻 译后修饰类型避免带来免疫原性；宿主细胞适于生物反应器的大规模培养，并能在无动物 源性成分的化学成分限定性（chemically defined and animal component free，ACDF)培 养基中生长至高密度；病毒安全性；适于在ACDF中进行克隆及压力筛选。
[0006] 已经获得FDA、EMA批准的多数治疗性单克隆抗体选用CH0细胞作为宿主细胞，另 外还有少量选用小鼠骨髓瘤细胞系，如NS0和SP2/0-Agl4。另外还有BHK21、HEK293、HKB11 等细胞用于蛋白稳定表达的报道。另外还有人视网膜母细胞瘤Per. C6用于抗体稳定表达。 其他用于蛋白稳定表达的细胞还有鸟类胚胎干细胞EB66、人神经元细胞以及转化的人原代 细胞等。
[0007] CH0细胞可以在生物反应器中高密度生长，易于进行基因操作，N-糖基化类型与 人类相似，较低的病毒传播风险，因此广泛用于生物制药领域。工业生产中最常使用的克隆 为 CH0-K1，CH0-DXB11 和 CH0-DG44。CH0-K1 与原代 CH0 近似，而 DXB11 和 DG44 为经过随机 突变缺失DHFR基因，从而可以通过代谢缺陷标记进行基因扩增。CH0-K1使用GS筛选系统， 但GS在CH0-K1中有内源性表达，因而降低了筛选的效率。
[0008] 高效的表达系统，除了表达细胞外，表达载体的构建也十分关键。表达载体中，启 动子、增强子、信号肽以及poly A尾对于转录及翻译非常关键。其中poly A尾对于目的 mRNA的合成至关重要，因为它通过影响转录的终止效率直接决定了 mRNA的数量，而mRNA 的量会进而影响翻译，即目的蛋白的产量。通过比较不同来源的poly A尾，发现了它们之 间有一定的同源性，可以判断有共同的功能特点。在连续的A之后，有能够形成茎环结构的 stem序列及loop序列，最后有连续T的序列。
[0009] 目前最为常用的poly A序列是：SV40p〇lyA，然而有研究发现，选择合适的poly A 可以有效增高目的蛋白的表达量。
[0010] 然而，目前还未有一种通用的polyA序列可以用于所有的表达系统。因此，有必要 设计一种P〇ly A序列，可以持续地，直接有效地增加表达产量。
【发明内容】
[0011] 为了寻找最佳的P〇ly A序列，本发明的发明人设计了 16种不同的poly A序列。 为了评估这16种序列的效果，它们被用于表达一种抗体Fab片段，Ranitizumab。
[0012] Ranibizumab是FDA批准的首个用于治疗年龄相关性黄斑退行性病变的VEGF拮抗 剂(抗体Fab段)。但是目前上市的Ranibizumab是由大肠杆菌表达系统生产的，存在产量 低及存在非正确折叠的缺陷，造成该药品的价格较高及有潜在的副作用的风险。
[0013] 本发明用Ranibizumab来验证该新型真核表达系统，主要的考察参数包括mRNA的 量及蛋白产量。mRNA的检测通过半定量PCR进行分析，而蛋白产量直接检测。
[0014] 本发明公开了 ： 1、一种新型真核表达系统，其特征在于，所述真核表达载体含有不同长度的PolyA转 录终止序列。
[0015] 2、上述的一种新型真核表达系统，其中所述真核表达载体含有的PolyA转录终止 序列具有 5 ' GACGAATTCCAGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGCCTTT TTTATTTTTTTCTT 3'的序列。
[0016] 3、上述的一种新型真核表达载体，其中所述载体含有双启动子连接目标蛋白质的 基因序列。
[0017] 4、上述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质选自完整抗体、抗体片段、细胞 因子和其他类似物。
[0018] 5、上述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为抗体。
[0019] 6、上述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为Ranitizumab。
[0020] 7、一种载体，含有权利要求1、2、3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性 相连的表达调控序列，其中载体可以为pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ZE0 ( + )，pDHFR之 〇
[0021] 8、上述一种新型真核表达系统的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为真核哺 乳动物细胞CH0。
[0022] 9、一种新型真核表达系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： a) 设计合成新型转录终止序列； b) 设计合成双启动子连接的目标抗体轻链、重链基因序列； c) 将a)、b)所得基因序列连接，构建新型重组质粒； d) 利用步骤c)所得核苷酸片断构建的重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆； e) 通过检测目标蛋白质mRNA表达水平及目标蛋白质的表达量来筛选最佳表达系统 10、一种新型真核表达体统的应用，其特征在于，提高目标蛋白质的表达量。
[0023] 11、上述一种新型真核表达系统用于表达完整抗体或抗体片段或细胞因子或其他 类似物。
[0024] 本发明设计了 16种不同长度的PolyA转录终止序列，并采用双启动子的形式构建 新型真核表达系统，通过检测目标蛋白质的mRNA的含量及检测目标蛋白质的表达量来筛 选该新型真核表达系统。通过验证，其中优选实施例为具有PA9序列的PolyA转录终止序 列。
[0025] 该新型真核表达系统可用于完全抗体及抗体片段及细胞因子及其他蛋白质的表 达，使用该新型真核表达系统，其目标蛋白质的表达量较一般的表达系统的表达量高，可以 降低目标蛋白质的生产成本，可以减少或者及社会的经济负担。
【附图说明】
[0026] 图1、在轻链末尾的polyA序列的5'端加上Hind III酶切位点，3'加上Kpn I酶 切位点载体构建示意图 图2、在重链末尾的polyA序列的5'端加上Not I酶切位点，3'加上Xho I酶切位点 载体构建示意图 图3、P-HL-2P载体构建示意图 图4、不同长度PolyA细胞株的目标蛋白质的mRNA定量比较 图5、不同长度PolyA细胞株的目标蛋白质的表达量比较 图6、表达的Ranibizumab的LC/MS质谱分析图。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例、实验例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例、 实验例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
[0028] 实施例1、载体构建 设计不同长度的PolyA的核酸序列(转录终止序列)，其序列见表1。
[0029] 表1、不同长度PolyA的核酸序列
设计合成所需表达的抗体或抗体片段的核酸序列，在3'端加上新型专利终止序列，连 接如真核细胞高效表达载体中，获得新型真核高效表达载体。
[0030] 实施例2、目标蛋白基因合成 以Ranibizumab为例，作为目标蛋白进行构建新型表达载体，并对该新型表达载体进 行验证。
[0031] 根据专利W01998045331A中所公开的Ranibizumab的基因序列，合成所表达目的 蛋白的核酸序列。
[0032] 实施例3、新型表达载体的构建 双启动子载体构建示意图如图1、图2、图3所示： 在轻链末尾的polyA序列的5'端加上Hind III酶切位点，3'加上Kpn I酶切位点，如 图1所示。
[0033] 在重链末尾的polyA序列的5'端加上Not I酶切位点，3'加上Xho I酶切位点， 如图2所示。
[0034] 使用Hindlll与Kpn I双酶切，以及Not I和Xho I双酶切在轻重链的末端引入 不同的polyA序列。构建好的在天体转化大肠杆菌TG1进行扩增，并测序验证。测序正确， 用BamHI和Xhol将重链表达相关片段切下，连入含轻链片段的载体中，组成新型表达载体 P-HL-2P连接pcDNA3. 1 ( + )用于后续转染。
[0035] P-HL-2P，其结构如图3所示。 实施例4、转染宿主细胞 对不同的表达载体，使用相同量的质粒与转染试剂(脂质体)，转染相同数量的CH0细胞 (1 X 106/孔)，培养48h后将细胞转接入摇瓶，培养7天后取上清检测目的蛋白的表达量，同 时收集细胞检测mRNA。
[0036] 实验例l、mRNA比较研究 (1) 细胞总RNA的提取： a) 6孔板细胞（CNE-2)汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后， 每孔加TRIZ0L试剂（Gibco公司）1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟(观察：液体变粘稠， 细胞脱壁)。 b) 将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一 DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿 0. 2 ml，轻摇15秒。 c) 室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4°C，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml)到EP管（DEPC处理过)，加0. 5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。 d) 12000 rpm，10分钟，4°C，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清(小心别丢 了沉淀)，75%乙醇1.0 ml洗涤(用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4°C离心。5)、去 上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟，DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打 匀，55-60°C水浴10分钟溶解总RNA，测0D值。 (2) 从总 RNA 中分离 mRNA (Oligotex mRNA Mini Kit, Cat. no. :70022, QIAGEN): a) 、取上述提取的总RNA若干(少于0.25 mg)到一个新的无RNase的EP管中，用无 RNase的水定容到250 ul。 b) 、加入 Buffer 0BB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用 Tip 打匀或用手弹 匀。3)、70°C水浴，3分钟(裂解RNA的二级结构）。 c) 、20-30°C条件下，静置10分钟(让Oligotex与mRNA结合)。 d) 、高速离心2分钟，小心吸走上清(该上清要保留），留下约50 yl的上清在原管里。
[0037] e)、用Buffer 0W2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到 套有1. 5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。 f) 、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer 0W2 400 ill到柱子，高速离心1分 钟，丢掉滤过液。 g) 、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70°C)Buffer 0EB到柱子 上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。 h) 、为保证最大的mRNA产量，可再次重复第g步。
[0038] 分离提取mRNA后，使用RT-PCR进行半定量分析。对比不同细胞株的目的mRNA含 量，发现改造后的polyA可以增加目的蛋白mRNA的水平。
[0039] 实验例2、不同长度PolyA细胞株的目的mRNA定量比较 使用Realtime PCR对目的基因进行半定量分析。选择b-actin作为内参基因，制定阳 性标准曲线。在使用合成的进行目的基因的PCR扩增，通过换算目的基因和内参基因的模 板量之比，作为目的基因的mRNA在细胞中的表达水平的指标。
[0040] 结果显示，PA9对于Fab的mRNA在细胞中的含量提高作用最为明显。见图4。
[0041] 实验例3、Fab表达产量的比较研究 在摇瓶培养7天后，使用Capto-L纯化柱纯化Fab，纯化后的Fab蛋白用通过SDS-PAGE 电泳和紫外分光光度计来分析纯度和浓度。最后计算不同细胞的Fab产量用于比较不同 poly A尾对Fab表达的影响。
[0042] 结果显示，PA9对于Fab的表达产量提高作用最为明显。见图5。
[0043] 实验例4、抗体Fab的完整分子量分析 用pH :8. 0,浓度50mM NH4HC03溶解抗体样品；检测柱采用ACQUITY UPLC C-18柱， LC-MS质谱进行分子量确认，结果图如下，箭头所指示区域为Fab蛋白，该蛋白分子量和理 论分子量一致：质谱检测结果见图6。
[0044] 根据检测结果显示：本发明产品中未见糖基化修饰；本发明产品中未见脱氨基修 饰。
[0045] 实验例5、亲和力分析 本产品与Lucentis亲和力相似
实验例6、生物活性分析 (1) huvec细胞活性检测 1)取对数生长期的huvec细胞，胰蛋白酶消化，计数，每次检测（1块96孔板）取约 2*106个细胞，离心弃上清，加入培养液B调整细胞密度至1. 5*10 5/ml，加入96孔培养板中， 0. lml/孔，培养过夜（18-24h)。注意不使用96孔板边缘的孔，但在这些孔中加入无菌水(防 止多孔板的边缘效应)。
[0046] 2)次日用12mL培养液C稀释放线菌素D母液0. 48ml至终浓度为20 ii g/ml，取 2ml作为对照用（培养液D)，其余10ml加入2. 45 iilrh VEGF母液至浓度为4. 9ng/ml (培养 液E)。
[0047] 3)取Lucentis?，用培养液E逐步稀释至1000ng/ml。
[0048] 4)将本发明产品（CMAB-818)用培养液E逐步稀释至1000ng/ml。
[0049] 5)分别在10个1. 5ml无菌离心管中用培养液E连续倍比稀释标准品或样品的稀 释液（即稀释后所有管中含相同浓度的VEGF和放线菌素D，但VEGF单抗Fab的浓度不同）。 (计算时请注意：因为下一步加入含等体积培养液的孔中，所以实际的稀释度是这时的稀 释度的2倍）。
[0050] 6)将上步所有离心管内的稀释液彻底混匀，10, OOOrpm离心30秒将液体集中于管 底。
[0051] 7 )设定培养液D为阴性对照。
[0052] 8)接种了 huvec细胞的96孔板中，加入稀释好的样品或进口对照品0. lml/孔，或 者阴性对照用培养液。每个点设立2个复孔。置入5% C02,37°C孵箱培养。
[0053] 9) 96孔培养板在孵箱持续孵育14~16h，将新鲜配制的20:1混合的MTS/PMS溶液 加入孔内（20 ill/孔)，再在孵箱中持续孵育1-4小时，用酶标仪测量其A490-A630值。
[0054] 10) Logistic回归：横坐标为标准品浓度，纵坐标为光吸收值的平均数 (A490-A630)〇
[0055] 回归方程：Y = (A-B)/[1 + (X/C)D] + B 根据该方程，C的数值即为半数有效浓度（ED50)。
[0056] 相对中和活性（%)=标准品 ED50 (ng/mL) / 待测品 ED50 (ng/mL) *100% (2) 竞争ELISA检测 具体方法如下： 1) PBS将VEGF稀释至0? 1 ii g/ml，加入酶标板，100 ill/孔。
[0057] 2)37°C，包被 2 小时。
[0058] 3)弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
[0059] 4) PBS将牛血清白蛋白稀释至3%，加入酶标板，加满孔。
[0060] 5)37°C，封闭 2 小时。
[0061] 6)弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
[0062] 7)PBS 将 HRP 标记的 rc VEGF mAb 稀释至 0? 34ii g/ml，用 PBS 将 Lucentis 稀释至 10 U g/ml，再将二者等体积混匀。
[0063] 8) PBS 将 HRP 标记的 rc VEGF mAb 稀释至 0? 34 u g/ml，用 PBS 将 rc VEGF mAb 稀 释至lOy g/ml，再将二者等体积混匀。
[0064] 9)PBS将HRP标记的rc VEGF mAb稀释至0. 17 ii g/ml，并用该溶液分别2倍比序 列稀释上两步中的Lucentis及rc VEGF mAb液体将序列稀释的Lucentis及rc VEGF mAb 加入酶标板，100 P 1/孔。另外以〇. 17 y g/ml的HRP标记的rc VEGF mAb作为最强显色反 应对照，PBS作为最弱显色反应对照。
[0065] 10)37°C，温育 1 小时。
[0066] 11)弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
[0067] 12)将TMB显色底物A及B等体积混合，加入酶标板，100 ill/孔。
[0068] 13)室温避光反应10分钟。
[0069] 14)每孔加入50 ii 1浓度为0. 5M的硫酸终止反应。
[0070] 15)酶标仪检测0D450nm，630nm为参比波长。
[0071] 本产品与Lucentis体外生物活性相似。
【主权项】
1. 一种新型真核表达系统，其特征在于，所述真核表达载体含有不同长度的PolyA转 录终止序列。2. 权利要求1所述的一种新型真核表达系统，其中所述真核表达载体含有的PolyA转 录终止序列具有 5 ' GACGAATTCCAGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCTCCCAAATCGGGGG GCCTTTTTTATTTTTTTCTT 3' 的序列。3. 权利要求1所述的一种新型真核表达载体，其中所述载体含有双启动子连接目标蛋 白质的基因序列。4. 权利要求3所述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质选自完整抗体、抗体片 段、细胞因子和其他类似物。5. 权利要求3所述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为抗体。6. 权利要求3所述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为Ranitizumab。7. -种载体，含有权利要求1、2、3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连 的表达调控序列，其中载体可以为pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ZE0 ( + )，pDHFR之一。8. 权利要求1所述一种新型真核表达系统的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为 真核哺乳动物细胞CH0。9. 一种新型真核表达系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： a) 设计合成新型转录终止序列； b) 设计合成双启动子连接的目标抗体轻链、重链基因序列； c) 将a)、b)所得基因序列连接，构建新型重组质粒； d) 利用步骤c)所得核苷酸片断构建的重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆； e) 通过检测目标蛋白质mRNA表达水平及目标蛋白质的表达量来筛选最佳表达系统。10. -种新型真核表达体统的应用，其特征在于，提高目标蛋白质的表达量。11. 权利要求10所述，一种新型真核表达系统用于表达完整抗体或抗体片段或细胞因 子或其他类似物。
【文档编号】C12N15/66GK105821077SQ201510008491
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月8日
【发明人】钱卫珠
【申请人】上海张江生物技术有限公司