一种发酵制备米渣蛋白抗氧化活性肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵制备米渣蛋白抗氧化肽的方法，包括如下步骤：（1）利用霉菌对米渣进行固态发酵：在米渣中加入水，米渣和水的重量比为（15?25）:9，搅拌浸润，灭菌后接种霉菌于30?35℃条件下进行前期发酵2?4天，得成曲；然后于40?42℃条件下进行后期发酵4?6天，得发酵产物；（2）将发酵产物通过超滤膜、凝胶层析过滤、制备型RP?HPLC进行抗氧化产物的分离纯化；即得米渣蛋白抗氧化肽F2d和F2e，所述F2d序列如SEQ ID NO.1所示，所述F2e序列如SEQ ID NO.2所示。利用霉菌固态发酵米渣制取抗氧化产物，可极大降低米渣综合利用的生产成本，丰富了米渣作为食品原料的应用范围，提高了米渣综合利用的技术水平和商品价值，并且为天然抗氧化产物的研究开辟了新途径。
【专利说明】
一种发酵制备米渣蛋白抗氧化活性肽的方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品蛋白加工技术领域，具体涉及一种发酵制备米渣蛋白抗氧化肽的 方法。
【背景技术】
[0002] 稻谷是我国第一大作物粮食，总产量长居世界第一。长期以来，稻谷生产和及其副 产物的深加工一直备受食品科学家的高度关注。长久以来，米渣的利用仅限于用作动物饲 料，远未得到更好的利用。近些年来，国内许多学者展幵了对米渣较为广泛深入的研究，主 要集中在米渣蛋白的提取、改性和利用蛋白酶对米渣蛋白水解获得米渣蛋白小分子生物活 性肽上。米渣肽的研究主要是米渣抗氧肽和米渣抑制肽。米渣蛋白经蛋白酶水解后，进行膜 分尚，大部分肽的分子量在lKDa下，并对多种自由基具有较强的清除力。
[0003] 米渣蛋白不溶于水，易溶于强碱、强酸，成为其应用的一大难题。米渣蛋白的修饰 改性可提高其水溶性、起泡性、乳化性等蛋白特性。利用蛋白酶有限水解米渣蛋白，改善其 蛋白特性是比较常用的蛋白改性方法。米渣除蛋白质外还含有丰富的糊精和多聚糖，可为 微生物的生长代谢提供足够的碳源和氮源。利用微生物发酵米渣，可使生产成本大幅降低， 使利用微生物发酵大规模生产发酵食品成为可能，这方面的研究仅有少量文献报道，而在 市场上也并未出现米澄发酵食品，因此米渣发酵食品极有市场开发前景。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种发酵制备米渣蛋白抗氧化肽的方法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 所述发酵制备米渣蛋白抗氧化肽的方法包括如下步骤： (1) 利用霉菌对米渣进行固态发酵:在米渣中加入水，米渣和水的重量比为（15-25) : 9， 搅拌浸润，灭菌后接种霉菌于30_35°C条件下进行前期发酵2-4天，得成曲；然后于40-42°C 条件下进行后期发酵4-6天，得发酵产物； (2) 将发酵产物通过超滤膜、凝胶层析过滤、制备型RP-HPLC进行抗氧化产物的分离纯 化；即得米渣蛋白抗氧化肽F2d和F2e，所述F2d序列如SEQ ID NO. 1所示，所述F2e序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006] 优选地，步骤（1)所述霉菌为黑曲霉;所述前期发酵条件为:32°C发酵3天;所述后 期发酵条件为：向成曲中加入无菌水，并于40.4 °C发酵5.5天，无菌水的加入量为80-85mL/ 10g成曲，优选为83.4mL/10g成曲。
[0007] 优选地，在对发酵产物进行抗氧化产物的分离纯化前，还包括对发酵产物进行成 分分析和体外抗氧化活性分析的步骤。所述对发酵产物进行成分分析是采用福林酚法测定 发酵产物总酚含量;用甲醛滴定法测定游离氨基酸含量，凯氏定氮法测定总蛋白质含量，然 后计算水解度;参照国标GB/T12456-2008测定总酸。所述对发酵产物进行体外抗氧化活性 分析是采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和? 0H自由基清除法。
[0008] 下面对本发明作进一步说明： 本发明以价格低廉、产量巨大的米渣为发酵基质，米渣中的糊精和多聚糖为氮源，蛋白 质为碳源，首次使用霉菌菌种制备具有抗氧化活性的小分子肽。以米渣蛋白为研究对象，采 用霉菌发酵法制备抗氧化活性肽，利用黑曲霉固态发酵，对发酵产生的产物进行体外抗氧 化活性的测定，经超滤、凝胶层析和制备型RP-HPLC进行分离纯化，获得高抗氧化活性产物， 并进行结构鉴定。有效拓展了其应用领域。
[0009] 具体步骤如下： (1) 利用霉菌对米渣进行固态发酵:在前期发酵阶段，分别称取20g米渣于锥形瓶中，加 入9g蒸馏水混合，使米渣充分浸润。而后置于高压蒸汽灭菌锅中，121°C灭菌30min，待冷却 后，将活化后的霉菌种接种于不同锥形瓶中。接种后，在恒温恒湿培养箱中32°C培养3天，待 米渣表面菌丝生长旺盛且产生大量孢子，即为成曲。在后发酵阶段，以83.4ml/10g无菌水加 入成曲中，于霉菌培养箱内40.4°C下，培养5.5天。发酵液经抽滤后，冷冻干燥成粉，备用； (2) 对发酵产物进行成分分析:采用福林酚法测定发酵产物总酚含量;用甲醛滴定法测 定游离氨基酸含量，凯氏定氮法测定总蛋白质含量，然后计算水解度；参照国标GB/T 12456-2008测定总酸； (3) 对发酵产物进行体外抗氧化活性分析:a、DPPH自由基清除法:将100此待测样品移 入10mL试管中，再加入2mL0 . ImM的DPPH的无水甲醇溶液。将试管放置于避光处反应15min 后，以无水甲醇调零，在517nm波长下测定其吸光值。根据公式计算清除率。b、ABTS自由基清 除法:7mM的ABTS溶液与2.45mM的过硫酸钾溶液混合，室温避光静置12-16h。在测定当天用 无水乙醇稀释，在734nm下测吸光值，根据公式计算清除率。c、? 0H自由基清除法：将 lmLO. 75mM邻二氮菲无水乙醇加入试管中，分别加2mL0.2M磷酸盐缓冲液，lmL蒸馏水，混合 均匀，加入现配的0. l%H2〇2，37°C水浴60min后，在510nm测其吸光值； (4) 通过超滤膜、凝胶层析过滤、制备型RP-HPLC对抗氧化产物分离纯化:a、超滤膜分 离:将卷式膜芯装入膜管内，关闭夹料套筒排水阀门，10L超纯水倒入夹料套筒中，打开电 源，将流速设置为18mL/s，压力差4.8kg/cm 2，将出口管接入夹料套筒，循环清洗30min，将出 口管放入排水池，将流速调至15mL/s，压力差为4.2kg/cm 2，进行一次性清洗。当夹料筒中的 超纯水液面低于3L时，继续添加超纯水，总计添加150L超纯水。清洗完成后，将抽滤后的发 酵液，倒入夹料套筒中，打幵电源，开启冷凝回流装置。超滤流速为15 mL/s，压力差为 4.2kg/cm2，浓缩液出口管，接入夹料套筒，在透析液出口管处进行收集。b、凝胶过滤:将处 理好的Sephadex G-25装入0.8cm X 90cm规格的层析柱中，用超纯水将超滤膜分离后得到的 高抗氧化活性组分配制成10mg/mL的溶液，上样量2mL，流速为30mL/h用超纯水进行洗脱。紫 外检测器在210nm下进行检测，重复收集各洗脱峰，冷冻干燥后，以DPPH清除率为指标，比较 各洗脱峰的抗氧化活性，筛选出抗氧化活性强的组分。c、制备型RP-HPLC:色谱条件： PURIFLASH450型色谱仪，Interchim Soft ? 0a工作站；色谱柱：SePaFlash C18反向硅胶快速 分离柱，流动相：乙腈、超纯水，上样量200mL，流速60mL/min，检测波长为210nm; (5) 利用质谱鉴定化合物的结构:利用MicroTOF-QII串联质谱仪，对分离纯化后的抗氧 化组分F2d和F2e进行鉴定。通过MSI对分子离子峰的分析，分别得到F2d和F2e的分子量，再 经MS2对碎片离子峰的分析，得到MS的化学结构。得到F2d为含10个氨基酸的多肽，序列为 VAEEELGGNR(SEQ ID N0.1)，F2e为含 11 个氨基酸的多肽，序列为LDPEGTGTFPP(SEQ ID N0.2)〇
[0010] 米渣是大米淀粉糖生产、有机酸发酵和味精生产的副产物，蛋白质含量高达40%以 上，价格低廉，产量巨大，是非常理想的蛋白质资源。米渣蛋白不溶于水，易溶于强碱、强酸， 成为其应用的一大难题。米渣制取抗氧化产物是以米渣中为单独的发酵基质，以米渣中的 多聚糖和糊精为碳源，蛋白质为氮源，接种霉菌菌种。通过前期发酵和后期发酵过程，使霉 菌产生的蛋白酶系和糖化酶系水解米渣中的蛋白质、糊精、多聚糖，生成具有抗氧化活性的 小分子肽。本发明首次利用黑曲霉固态发酵制备抗氧化活性产物，分析其发酵产物的成分， 使用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、? 0H自由基清除法测定发酵产物的体外抗氧 化性，并通过现代分离技术以及最新的质谱技术对米渣霉菌发酵产生的抗氧化肽进行分离 鉴定。利用霉菌固态发酵米渣制取抗氧化产物，可极大降低米渣综合利用的生产成本，丰富 了米渣作为食品原料的应用范围，提高了米渣综合利用的技术水平和商品价值，并且为天 然抗氧化产物的研究幵辟了新途径。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1 在前期发酵阶段，分别称取20g米渣于锥形瓶中，加入9g蒸馏水混合，使米渣充分浸润。 而后置于高压蒸汽灭菌锅中，121°C灭菌30min，待冷却后，将活化后的黑曲霉接种于不同锥 形瓶中。接种后，在恒温恒湿培养箱中32°C培养3天，待米渣表面菌丝生长旺盛且产生大量 孢子，即为成曲。在后发酵阶段，83.4ml/10g无菌水加入成曲中，于霉菌培养箱内40.4°C下， 培养5.5天。发酵液经抽滤后，冷冻干燥成粉，备用。
[0012] 采用福林酚法测定发酵产物总酚含量；用甲醛滴定法测定游离氨基酸含量，凯氏 定氮法测定总蛋白质含量，然后计算水解度;参照国标GB/T 12456-2008测定总酸。发酵产 物进行体外抗氧化活性分析，然后超滤膜分离:将卷式膜芯装入膜管内，关闭夹料套筒排水 阀门，10L超纯水倒入夹料套筒中，打开电源，将流速设置为18mL/s，压力差4.8kg/cm 2，将出 口管接入夹料套筒，循环清洗30min，将出口管放入排水池，将流速调至15mL/s，压力差为 4.2kg/cm 2,进行一次性清洗。当夹料筒中的超纯水液面低于3L时，继续添加超纯水，总计添 加150L超纯水。清洗完成后，将抽滤后的发酵液，倒入夹料套筒中，打幵电源，开启冷凝回流 装置。超滤流速为15 mL/s，压力差为4.2kg/cm2，浓缩液出口管，接入夹料套筒，在透析液出 口管处进行收集。b、凝胶过滤:将处理好的Sephadex G-25装入0.8cm X 90cm规格的层析柱 中，用超纯水将超滤膜分离后得到的高抗氧化活性组分配制成10mg/mL的溶液，上样量2mL， 流速为30mL/h用超纯水进行洗脱。紫外检测器在210nm下进行检测，重复收集各洗脱峰，冷 冻干燥后，以DPPH清除率为指标，比较各洗脱峰的抗氧化活性，筛选出抗氧化活性强的组 分。制备型RP-HPLC:色谱条件：PURIFLASH450型色谱仪，Interchim Sof t ? 0a工作站；色谱 柱：SePaFlash C18反向硅胶快速分离柱，流动相：乙腈、超纯水，上样量200mL，流速60mL/ min，检测波长为210nm〇
[0013]利用MicroTOF-QII串联质谱仪，对分离纯化后的抗氧化组分F2d和F2e进行鉴定。 通过MSI对分子离子峰的分析，分别得到F2d和F2e的分子量，再经MS2对碎片离子峰的分析， 得到MS的化学结构。得到F2d为含10个氨基酸的多肽，序列为￥ &141&-6111-6111-6111-1^11-Gly-Gly-Asn-Arg (V-A-E-E-E-L-G-G-N-R)(SEQ ID N0.1)，F2e为含 11 个氨基酸的多肽，序 ID N0.2)〇 [0014] 实施例2 在前期发酵阶段，分别称取20g米渣于锥形瓶中，加入9g蒸馏水混合，使米渣充分浸润。 而后置于高压蒸汽灭菌锅中，121°C灭菌30min，待冷却后，将活化后的黑曲霉接种于不同锥 形瓶中。接种后，在恒温恒湿培养箱中32°C培养3天，待米渣表面菌丝生长旺盛且产生大量 孢子，即为成曲。在后发酵阶段，100ml/10g无菌水加入成曲中，于霉菌培养箱内41°C下，培 养9天。发酵液经抽滤后，冷冻干燥成粉，备用。
[0015]采用福林酚法测定发酵产物总酚含量；用甲醛滴定法测定游离氨基酸含量，凯氏 定氮法测定总蛋白质含量，然后计算水解度;参照国标GB/T 12456-2008测定总酸。发酵产 物进行体外抗氧化活性分析，然后超滤膜分离:将卷式膜芯装入膜管内，关闭夹料套筒排水 阀门，10L超纯水倒入夹料套筒中，打开电源，将流速设置为18mL/s，压力差4.8kg/cm 2，将出 口管接入夹料套筒，循环清洗30min，将出口管放入排水池，将流速调至15mL/s，压力差为 4.2kg/cm 2,进行一次性清洗。当夹料筒中的超纯水液面低于3L时，继续添加超纯水，总计添 加150L超纯水。清洗完成后，将抽滤后的发酵液，倒入夹料套筒中，打幵电源，开启冷凝回流 装置。超滤流速为15 mL/s，压力差为4.2kg/cm2，浓缩液出口管，接入夹料套筒，在透析液出 口管处进行收集。b、凝胶过滤:将处理好的Sephadex G-25装入0.8cm X 90cm规格的层析柱 中，用超纯水将超滤膜分离后得到的高抗氧化活性组分配制成10mg/mL的溶液，上样量2mL， 流速为30mL/h用超纯水进行洗脱。紫外检测器在210nm下进行检测，重复收集各洗脱峰，冷 冻干燥后，以DPPH清除率为指标，比较各洗脱峰的抗氧化活性，筛选出抗氧化活性强的组 分。制备型RP-HPLC:色谱条件：PURIFLASH450型色谱仪，Interchim Sof t ? 0a工作站；色谱 柱：SePaFlash C18反向硅胶快速分离柱，流动相：乙腈、超纯水，上样量200mL，流速60mL/ min，检测波长为210nm〇
[0016]利用MicroTOF-QII串联质谱仪，对分离纯化后的抗氧化组分F2d和F2e进行鉴定。 通过MSI对分子离子峰的分析，分别得到F2d和F2e的分子量，再经MS2对碎片离子峰的分析， 得到MS的化学结构。得到F2d为含10个氨基酸的多肽，序列为￥ &141&-6111-6111-6111-1^11-Gly-Gly-Asn-Arg (V-A-E-E-E-L-G-G-N-R)(SEQ ID N0.1)，F2e为含 11 个氨基酸的多肽，序 ID N0.2)〇
[0017] 实施例3 在前期发酵阶段，分别称取20g米渣于锥形瓶中，加入9g蒸馏水混合，使米渣充分浸润。 而后置于高压蒸汽灭菌锅中，121°C灭菌30min，待冷却后，将活化后的黑曲霉接种于不同锥 形瓶中。接种后，在恒温恒湿培养箱中32°C培养3天，待米渣表面菌丝生长旺盛且产生大量 孢子，即为成曲。在后发酵阶段，60ml/ 10g无菌水加入成曲中，于霉菌培养箱内38 °C下，培养 6天。发酵液经抽滤后，冷冻干燥成粉，备用。
[0018] 采用福林酚法测定发酵产物总酚含量；用甲醛滴定法测定游离氨基酸含量，凯氏 定氮法测定总蛋白质含量，然后计算水解度;参照国标GB/T 12456-2008测定总酸。发酵产 物进行体外抗氧化活性分析，然后超滤膜分离:将卷式膜芯装入膜管内，关闭夹料套筒排水 阀门，10L超纯水倒入夹料套筒中，打开电源，将流速设置为18mL/s，压力差4.8kg/cm 2，将出 口管接入夹料套筒，循环清洗30min，将出口管放入排水池，将流速调至15mL/s，压力差为 4.2kg/cm2,进行一次性清洗。当夹料筒中的超纯水液面低于3L时，继续添加超纯水，总计添 加150L超纯水。清洗完成后，将抽滤后的发酵液，倒入夹料套筒中，打幵电源，开启冷凝回流 装置。超滤流速为15 mL/s，压力差为4.2kg/cm2，浓缩液出口管，接入夹料套筒，在透析液出 口管处进行收集。b、凝胶过滤:将处理好的Sephadex G-25装入0.8cm X 90cm规格的层析柱 中，用超纯水将超滤膜分离后得到的高抗氧化活性组分配制成10mg/mL的溶液，上样量2mL， 流速为30mL/h用超纯水进行洗脱。紫外检测器在210nm下进行检测，重复收集各洗脱峰，冷 冻干燥后，以DPPH清除率为指标，比较各洗脱峰的抗氧化活性，筛选出抗氧化活性强的组 分。制备型RP-HPLC:色谱条件：PURIFLASH450型色谱仪，Interchim Sof t ? Oa工作站；色谱 柱：SePaFlash C18反向硅胶快速分离柱，流动相：乙腈、超纯水，上样量200mL，流速60mL/ min，检测波长为210nm〇
[0019]利用MicroTOF-QII串联质谱仪，对分离纯化后的抗氧化组分F2d和F2e进行鉴定。 通过MSI对分子离子峰的分析，分别得到F2d和F2e的分子量，再经MS2对碎片离子峰的分析， 得到MS的化学结构。得到F2d为含10个氨基酸的多肽，序列为￥ &141&-6111-6111-6111-1^11-Gly-Gly-Asn-Arg (V-A-E-E-E-L-G-G-N-R)(SEQ ID N0.1)，F2e为含 11 个氨基酸的多肽，序 ID N0.2)〇
【主权项】
1. 一种发酵制备米渣蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 利用霉菌对米渣进行固态发酵:在米渣中加入水，米渣和水的重量比为（15-25) :9， 搅拌浸润，灭菌后接种霉菌于30-35Γ条件下进行前期发酵2-4天，得成曲；然后于40-42Γ 条件下进行后期发酵4-6天，得发酵产物； (2) 将发酵产物通过超滤膜、凝胶层析过滤、制备型RP-HPLC进行抗氧化产物的分离纯 化；即得米渣蛋白抗氧化肽F2d和F2e，所述F2d序列如SEQ ID NO. 1所示，所述F2e序列如SEQ ID NO .2所示。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述霉菌为黑曲霉;所述前期发酵条 件为:32°C发酵3天;所述后期发酵条件为：向成曲中加入无菌水，并于40.4°C发酵5.5天，无 菌水的加入量为80-85mL/10g成曲。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无菌水的加入量为83.4mL/10g成曲。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在对发酵产物进行抗氧化产物的分离纯化 前，还包括对发酵产物进行成分分析和体外抗氧化活性分析的步骤。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对发酵产物进行成分分析是采用福林酚 法测定发酵产物总酚含量；用甲醛滴定法测定游离氨基酸含量，凯氏定氮法测定总蛋白质 含量，然后计算水解度;参照国标GB/T12456-2008测定总酸。6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对发酵产物进行体外抗氧化活性分析是 采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和· 0H自由基清除法。
【文档编号】C07K1/34GK105821101SQ201610378598
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】梁盈, 黄萍, 林亲录, 田蔚, 吴伟, 马酉初
【申请人】中南林业科技大学