一种药用植物九里香的snp标记及其鉴别方法与用图
【专利摘要】本发明提供的药用植物九里香的SNP标记，所述SNP标记为SEQ ID No.1所示序列中自5’端起第75位的核苷酸为T、第109位的核苷酸为T和/或第173位为A；所述SEQ ID No.1所示序列为所述九里香的ITS2基因间隔区序列，通过采用上述SNP标记可以快捷的、准确的鉴别药用九里香，适用性广，能够从源头上保证鉴别结果的稳定可靠性，与传统的形态学鉴定方法相比，所述的药用植物九里香的SNP标记能够实现快速、准确的鉴定药用九里香。
【专利说明】
一种药用植物九里香的SNP标记及其鉴别方法与用途
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种药用植物九里香的SNP标记及其鉴别方 法与用途。
【背景技术】
[0002]九里香Murraya exotica L?是芸香科（Rutaceae)九里香属（Murraya Koenig ex Linnaeus)的植物，产于台湾、福建、广东、海南和广西等五省区南部。九里香的根、茎、叶所 含化学成分与千里香Murraya paniculata(L. )Jack.类同，两者共同被2015版《中华人民共 和国药典》收载为中药材九里香Murrayae Folium et Cacumen的基原植物。九里香具有行 气止痛、活血散瘀、祛风除湿和麻醉镇惊等功效，临床上用于治疗胃痛，风湿痹痛，牙痛，跌 扑肿痛和虫蛇咬伤等。九里香M.exotica L.浑身都是宝，除了其本身的药用价值外，由于其 花香浓烈，持久，花色洁白美丽，树形端正和四季常青等优点，常作为观赏植物，其花叶果中 含有的丰富精油可以被加工成香精或者调味香料。
[0003] 中药材基原植物的种子、种苗作为源头，直接影响着中药材质量及经济效益。因 此，中药材种子和种苗基原物种的准确鉴定，可确保种质来源纯正可靠，既为大规模规范种 植生产中药材打下基础，也为中药材的临床用药安全提供保障。然而，处于植物生长发育阶 段初期的种子和种苗，形态特征不明显，鉴定比较困难。因此，亟需寻求一种方法来鉴别药 用植物九里香。
[0004] DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，生物条形码联盟 (Consortium for the Barcode of Life，CB0L)阐述了DNA条形码的优点：（1)不受个体形 态特征限制；（2)不受个体发育阶段影响；（3)对于分类学中难以区分的类群，采用DNA条形 码可以抛开形态相似的假象，从基因水平上提供分类依据；（4)核苷酸序列组成的数据库可 以提供明确的信息，不仅弥补了形态描述的不足，而且可以加快已知物种的识别速度，同时 便于新物种的发现，将会使分类学科的发展更加快速和深入；（5)如果设想的条形码扫描仪 可以实现，将会减少对传统分类学人力和物力的需求。因此DNA条形码技术已广泛应用于鉴 定药用植物及中药材。
[0005] 如中国专利文献CN103898234A中公开的一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法和其 C0I序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出样品C0I的基因，将PCR产物经过琼 脂糖胶进行验证后送至生物测序公司进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与 公开序列进行比对，如果与所述基因序列SEQ IDN0.1-N0.4的同源性在99%以上，即可判断 所述的待测组织即为广地龙或者沪地龙来源。上述方案采用可靠的DNA分子鉴定技术，无需 对地龙品种进行形态学鉴定，可以快速、准确的鉴定《中华人民共和国药典》规定的地龙品 种和非药材地龙品种，此外可以进一步区分广地龙和沪地龙品种，增强了准确性和可靠性， 确保地龙作为药材入药的安全性。然而，上述方案中仅是通过检测待测植物的基因与所述 基因序列SEQ IDN0.1-N0.4的同源性在99%以上，即判断所述的待测组织即为广地龙或者 沪地龙来源，忽视了基因中单核苷酸多态性(SNP)的影响，即当待测样品的基因与所述基因 序列SEQ IDNO. 1-NO.4的同源性在99%以上，但其中并没有检测关于广地龙或者沪地龙的 单核苷酸多态性(SNP)位点，则该待测组织可能是非药材地龙品种，无法从"源头"上保证其 正确性。
[0006] SNP(Single-nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)标记是由DNA序列中单 个碱基的变异引起的遗传多态性，突变频率高，是基因组分布密度最高的标记。SNP包括两 种形式，碱基的转换或碱基的颠换，具有分布广泛、数量巨大、遗传稳定性强的特点，基因编 码区的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平等优点，而且也易于自动快 速检测和自动化分析，是研究复杂遗传性状和基因组进化的理想标记。
[0007] 然而，在现有技术中还没有提出一种准确的、快速的利用DNA条形码或SNP标记鉴 别药用九里香的方法。为了能够更加准确的、快捷的鉴别药用植物九里香，本发明提供了一 种药用植物九里香的SNP标记及其鉴定方法与用途，实现对药用九里香的种子种苗的快速 准确鉴定，从"源头"上保证其正确性。
【发明内容】
[0008] 因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种药用植物九里香的SNP标记及其鉴 定方法与用途。
[0009] 本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种含有药用植物九里香的SNP标记的 基因。
[0010] 本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种用于检测所述的药用植物九里香 的SNP标记的引物。
[0011] 本发明要解决的第四个技术问题在于提供一种药用植物九里香的快速分子鉴定 方法。
[0012] 为此，本发明提供了一种药用植物九里香的SNP标记，所述SNP标记为SEQ ID No.l 所示序列中自5'端起第75位的核苷酸T、第109位的核苷酸T和/或第173位的核苷酸A;所述 SEQ ID No.l所示序列为所述九里香的ITS2基因间隔区序列。
[0013]本发明提供了一种含有药用植物九里香的SNP标记的基因，所述的基因的核苷酸 序列如SEQ ID No.l所示，所述SEQ ID No.l所示序列为所述九里香的ITS2基因间隔区序 列。
[0014] 本发明提供了一种用于检测所述的药用植物九里香的SNP标记的引物，所述引物 如下：
[0015] ITS2F:5 '-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '，
[0016] ITS3R:5 '-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 '。
[0017] 本发明提供了一种药用植物九里香的快速分子鉴定方法，包括检测待测九里香的 ITS2基因间隔区序列是否含有所述的药用植物九里香的SNP标记和/或所述的含有药用植 物九里香的SNP标记的基因的步骤，以鉴别所述待测九里香，若所述待测九里香含有所述 SNP标记和/或所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因，则所述待测九里香为药用植 物九里香，反之，为非药用植物九里香。
[0018] 所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，包括如下步骤：
[0019] S1、提取所述待测九里香的总基因组DNA;
[0020] S2、以步骤S1所得的所述总基因组DNA为模板，设计如下引物：
[0021] ITS2F:5，-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3，，
[0022] ITS3R: 5 '-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 '，对所述总基因组DNA进行PCR扩增；
[0023] S3、将步骤S2中获得的扩增产物进行测序，将所得测序结果进行拼接并去除序列 两端5.8S和28S基因区，获得完整ITS2基因间隔区序列，然后将所得ITS2基因间隔区序列进 行比对，若所述ITS2基因间隔区序列含有所述SNP标记和/或所述的含有药用植物九里香的 SNP标记的基因，则所述待测九里香为药用植物九里香，反之，为非药用植物九里香。
[0024] 所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，所述步骤S2中，所述PCR扩增反应体 系包括：
[0025] DNA 模板，30-50ng，2yL;
[0026] 正、反向引物，2.5處，各lyL;
[0027] 2XTaq PCR Master Mix，12.5yL;
[0028] ddH20,8.5yL。
[0029] 所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，所述步骤S2中，所述PCR扩增程序如 下:94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，进行40个循环，最终72°C延 伸1 Omin，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C或-20 °C保存，备用。
[0030] 所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，所述步骤S3中，分别将步骤S2中获 得的扩增产物进行正向和反向测序，然后将正向测序结果与反向测序结果进行拼接。
[0031] 所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，所述步骤S3中，对拼接得到的DNA序 列使用基于隐马尔可夫模型的HMMER注释方法去除两端的5.8S和28S区段。
[0032] 本发明提供了一种上述的鉴定方法在鉴别药用植物九里香中的用途。
[0033]本发明提供了一种所述的药用植物九里香的SNP标记在鉴别药用植物九里香中的 用途。
[0034]本发明提供了一种所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因在鉴别药用植物 九里香中的用途。
[0035]本发明提供了一种所述的用于检测所述的药用植物九里香的SNP标记的引物在鉴 别药用植物九里香中的用途。
[0036]本发明技术方案相比现有技术，具有如下优点：
[0037] (1)本发明所述的药用植物九里香的SNP标记，所述SNP标记为SEQ ID No.l所示序 列中自5'端起第75位的核苷酸为T、第109位的核苷酸为T和/或第173位为A;所述SEQ ID No.l所示序列为所述九里香的ITS2基因间隔区序列，通过采用上述SNP标记可以快捷的、准 确的鉴别药用九里香，适用性广，能够从源头上保证鉴别结果的稳定可靠性，与传统的形态 学鉴定方法相比，所述的药用植物九里香的SNP标记能够实现快速、准确的鉴定药用九里香 品种。
[0038] (2)本发明所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因，所述的基因的核苷酸序 列如SEQ ID No.l所示，所述SEQ ID No.l所示序列为所述九里香的ITS2基因间隔区序列， 可以将待测九里香的基因与所述含有药用植物九里香的SNP标记的基因进行比对，进而实 现鉴别药用九里香和非药材九里香的目的，鉴别过程简单、快速，且鉴别结果更加准确，能 够有效的区分近缘中和混淆品。
[0039] (3)本发明所述的用于检测所述的药用植物九里香的SNP标记的引物，通过特定选 择ITS2F: 5 ' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '，ITS3R: 5 ' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 ' 作为引物 进行PCR扩增，使得对所述药用植物九里香鉴定更加准确可靠。
[0040] (4)本发明所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，通过检测待测九里香的 ITS2基因间隔区序列是否含有所述的药用植物九里香的SNP标记和/或所述的含有药用植 物九里香的SNP标记的基因的步骤，进而达到鉴别所述九里香是否为药用植物九里香的目 的，鉴别过程简单、快速，且鉴别结果更加准确。
[0041] (5)本发明所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，通过提取待测九里香的 总DNA，然后进行扩增，将扩增的产物进行测序，将测序结果进行拼接并去除序列两端5.8S 和28S基因区后的序列与药用植物九里香的SNP标记或含有药用植物九里香的SNP标记的基 因进行比对，鉴别出待测九里香是否为药用植物九里香，鉴别简单易操作，结果准确可靠。
[0042] (6)本发明所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，通过优化PCR的反应体系 对待测九里香的基因组DNA进行PCR扩增，更加有助于快速鉴定药用植物九里香方法的优 化，通过优化的PCR的扩增程序对待测九里香的基因组DNA进行PCR扩增，能够快速准确的测 定待测九里香是否为药用植物九里香。
【附图说明】
[0043] 为了更清楚地说明本发明【具体实施方式】或现有技术中的技术方案，下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前 提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0044] 图1是本发明实施1所述的药用植物九里香种内ITS2基因间隔区序列比对图；
[0045] 图2是本发明实施2所述的为药用植物九里香和同属其它近缘物种ITS2基因间隔 区序列的不同单倍型比对图。
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所用的试剂为市售产品。所述引物由生工生物工程公司有限公司 (北京）提供。MM400球磨仪生产厂家为德国Retsch。植物基因组DNA提取试剂盒由Tiangen biotech Co.，China提供。
[0047]样本的采集：药用植物九里香样本32份，来源于广西（几X-1--几X-4、几X-8、 JLX-ll、JLX-14、JLX-18JLX-20、JLX-23JLX-24、PS1605MT04、RC_JLX-8、jlxfs)、r* (JLX-5--JLX-7、JLX-9、JLX-12、JLX-16、JLX-17、JLX-19、JLX-21、JLX-2 2、RC_JLX-6)、福 建（JLX-10)、海南（JLX-13)、云南（PS1605MT01、05、jlxhd)、四川（PS1605MT02)、深圳（JLX-l5);种子l份(Y15028-l)，来自中国医学科学院药用植物研究所国家药用植物种质资源库； 对照药材1份(FDC355)，购自中国食品药品检定研究院;GenBank下载序列1条(JX144211)。 同属近缘种千里香M.paniculata来源于广西、广东、越南、海南和贵州，调料九里香 M.koenigii来源于华南植物园和GenBank，广西九里香11^^1^81611818来源于广西，小叶九 里香M. mi crophy 11a来源于海南三亚和GenBank，翼叶九里香M. a lata来源于海南三亚和 GenBank，豆叶九里香M. euchrestifolia来源于GenBank，四数九里香M. tetramera来源于 GenBank，共计 22 份。
[0048] 实施例1
[0049] 本实施例所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，包括如下步骤：
[0050] S1、按照常规方法提取所述各待测药用九里香样本的总DNA，所述提取步骤如下： 分别取所述待测九里香样本的叶片（约30mg)，在MM400球磨仪上进行研磨，然后用植物基因 组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取总基因组DNA，备用；
[0051] S2、以步骤S1所得的各所述总基因组DNA为模板，设计如下引物：
[0052] ITS2F:5 '-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '，
[0053] ITS3R:5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'，所述引物如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3 所示，对所述总基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增反应体系包括：
[0054] DNA 模板，50ng，2yL;
[0055] 正、反向引物，2.5iiM，各 luL;
[0056] 2XTaq PCR Master Mix，12.5yL;
[0057] ddH20,8.5yL；
[0058] PCR扩增程序如下：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，进 行40个循环，最终72°C延伸lOmin，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C或_20°C保存，备用；
[0059] S3、将步骤S2中获得的扩增产物进行测序，所述扩增产物直接送中国农业科学院 重大工程实验室进行测序，所述扩增产物进行正向和反向测序，然后将正向测序结果与反 向测序结果应用生物软件(CodonCode Aligner(CodonCode Co.，USA))进行拼接，为确保拼 接的DNA序列的可靠性，去除测序结构两端信号弱或重叠峰区域，序列方向应与PCR扩增正 向产物方向一致，对上述拼接得到的DNA序列使用基于隐马尔可夫模型的HMMER注释方法 (可参见Profile hidden Markov models.Eddy SR.Bioinformatics，1998，14:755?和 5.8S-28S rRNAinteractionand HMM-based ITS2annotation.Keller A,Schleicher T, Schultz J, et al ? Gene , 2009,430:50 ?)去除序列的5 ? 8S和28S区段，获得完整ITS2基因间 隔区序列，将所得ITS2基因间隔区序列进行比对，若所述ITS2基因间隔区序列含有所述SNP 标记或与所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因如SEQ ID No. 1所示序列相同，则所 述待测九里香为药用植物九里香，反之，为非药用植物九里香，鉴定结果表示，如图la、图 lb、图lc所示为药用植物九里香种内ITS2基因间隔区序列比对图，其中图la为第1位到第 100位的ITS2基因间隔区序列，其中如三角标记所示，从5 '端起第75位为T，图lb为第101位 到第200位的ITS2基因间隔区序列，其中如三角标记所示，第109位为T，第173位为A，图lc为 第201位到第222位的ITS2基因间隔区序列，由上述可以得出药用植物九里香中未发现种内 变异，所有的ITS2基因间隔区序列共享同一种单倍型，上述各待测药用植物九里香样本的 1丁52基因间隔区序列如5￡〇10如.4-5￡〇10如.38所示，其与5￡〇10如.1所示序列相同。
[0060] 实施例2
[0061] 本实施例所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，包括如下步骤：
[0062] S1、按照常规方法分别提取所述待测药用九里香以及同属近缘种九里香样本的总 DNA，所述提取步骤如下:分别取上述待测样本的叶片约30mg，在MM400球磨仪上进行研磨， 然后用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总基因组DNA，备用； [0063] S2、以步骤S1所得的各所述总基因组DNA为模板，设计如下引物：
[0064] ITS2F:5 '-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '，
[0065] ITS3R: 5 '-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 '，对所述总基因组DNA进行PCR扩增，所述 PCR扩增反应体系包括：
[0066] DNA 模板，50ng，2yL;
[0067]正、反向引物，2.5liM，各 luL;
[0068] 2XTaq PCR Master Mix，12.5yL;
[0069] ddH20,8.5yL;
[0070] PCR扩增程序如下：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，进 行40个循环，最终72°C延伸lOmin，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C或_20°C保存，备用；
[0071] S3、将步骤S2中获得的扩增产物进行测序，所述扩增产物直接送中国农业科学院 重大工程实验室进行测序，所述扩增产物进行正向和反向测序，然后将正向测序结果与反 向测序结果应用生物软件(CodonCode Aligner(CodonCode Co.，USA))进行拼接，为确保拼 接的DNA序列的可靠性，去除测序结构两端信号弱或重叠峰区域，序列方向应与PCR扩增正 向产物方向一致，对上述拼接得到的DNA序列使用基于隐马尔可夫模型的HMMER注释方法 (可参见Profile hidden Markov models.Eddy SR.Bioinformatics，1998，14:755?和 5.8S-28S rRNAinteractionand HMM-based ITS2annotation.Keller A,Schleicher T, Schultz J，et al.Gene,2009,430:50.)去除序列的5.8S和28S区段，然后完整的ITS2基因 间隔区序列，将所得ITS2基因间隔区序列进行比对，若所述ITS2基因间隔区序列含有所述 SNP标记或与所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因如SEQ ID No. 1所示序列相同， 则所述待测九里香为药用植物九里香，反之，为非药用九里香，鉴定结果表示，如图2所示为 药用植物九里香和同属其它近缘物种ITS2基因间隔区序列不同单倍型的比对结果，其中图 2a为第61位到第110位的ITS2基因间隔区序列，5 '端起第75位，药用植物九里香为T，同属其 他物种为C;第109位，药用植物九里香为T，同属其他物种为C;图2b为第171位到第200位的 ITS2基因间隔区序列，在第173位药用植物九里香为A，同属其他物种为G或C。从图2中可以 看出，共获得3个SNP位点，所有的药用植物九里香样品的ITS2基因间隔区序列（SEQ ID No. 39)的第75位为T，第109位为T，第173位为A，而其他物种(千里香、调料九里香、广西九里 香、小叶九里香、翼叶九里香、豆叶九里香、四数九里香）的ITS2基因间隔区序列的第75位为 C，第109位为C，第173位为G或C，表明这3个SNP位点可特异性地用于药用植物九里香的鉴 定。这三个所述SNP标记存在于所有的实验数据及GenBank数据中，由于数据量较大，图2中 仅显示了各物种单倍型的比对结果，上述各待测九里香样本的ITS2基因间隔区序列如SEQ ID No.39-SEQ ID No.61所示，来源于广西、广东、福建、海南、云南、四川和深圳的药用九里 香Murraya.exotica共享同一种单倍型A1，如SEQ ID No.39所示，来源于广西、广东、越南、 海南和贵州的同属近缘种千里香M.paniculata共享10种单倍型B1-B10，如SEQ ID No.40-SEQ ID 1'1〇.49所示，来源于华南植物园和66111^1^的同属近缘种调料九里香11.1^〇61118；[;[共 享5种单倍型C1-C5,如SEQ ID No.50-SEQ ID No.54所示，来源于广西的同属近缘种广西九 里香]?.1〇^即81611818共享2种单倍型01-02，如3￡0 10吣.55-3￡0 10吣.56所示，来源于海 南三亚和GenBank的同属近缘种小叶九里香M.microphylla共享2种单倍型E1-E2,如SEQ ID No. 57-SEQ ID No. 58所示，来源于海南三亚和GenBank的同属近缘种翼叶九里香M. alata拥 有1种单倍型F1，如SEQ ID No.59所示，来源于GenBank的同属近缘种豆叶九里香 M. euchrestifolia拥有1种单倍型G1，如SEQ ID No ? 60所示，来源于GenBank的同属近缘种 四数九里香1丨61:瓜1116瓜拥有1种单倍型111，如3￡(>)10 1'1〇.61所示。
[0072] 实施例3
[0073]本实施例所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，包括如下步骤：
[0074] S1、按照常规方法提取所述各待测药用九里香样本的总DNA，所述提取步骤如下： 分别取所述待测九里香样本的种子1粒，在MM400球磨仪上进行研磨，然后用植物基因组DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取总基因组DNA，备用；
[0075] S2、以步骤S1所得的各所述总基因组DNA为模板，设计如下引物：
[0076] ITS2F:5 '-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '，
[0077] ITS3R:5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'，所述引物如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3 所示，对所述总基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增反应体系包括：
[0078] DNA 模板，40ng，2uL;
[0079] 正、反向引物，2.5yM，各lyL;
[0080] 2XTaq PCR Master Mix，12.5yL;
[0081] ddH20,8.5yL；
[0082] PCR扩增程序如下：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，进 行40个循环，最终72°C延伸lOmin，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C或_20°C保存，备用； [0083] S3、将步骤S2中获得的扩增产物进行测序，所述扩增产物直接送中国农业科学院 重大工程实验室进行测序，所述扩增产物进行正向和反向测序，然后将正向测序结果与反 向测序结果应用生物软件(CodonCode Aligner(CodonCode Co.，USA))进行拼接，为确保拼 接的DNA序列的可靠性，去除测序结构两端信号弱或重叠峰区域，序列方向应与PCR扩增正 向产物方向一致，对上述拼接得到的DNA序列使用基于隐马尔可夫模型的HMMER注释方法去 除序列的5.8S和28S区段，然后获得ITS2基因间隔区序列，将所得ITS2基因间隔区序列进行 比对，若所述ITS2基因间隔区序列含有所述SNP标记或与所述的含有药用植物九里香的SNP 标记的基因如SEQ ID No.1所示序列相同，则所述待测九里香为药用九里香，反之，为非药 用九里香。
[0084] 实施例4
[0085] 本实施例所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，包括如下步骤：
[0086] S1、按照常规方法分别提取所述待测药用九里香以及同属近缘种九里香样本的总 DNA，所述提取步骤如下:分别取上述待测样本的药材约40mg，在MM400球磨仪上进行研磨， 然后用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总基因组DNA，备用； [0087] S2、以步骤S1所得的各所述总基因组DNA为模板，设计如下引物：
[0088] ITS2F:5 '-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '，
[0089] ITS3R: 5 '-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3，，对所述总基因组DNA进行PCR扩增，所述 PCR扩增反应体系包括：
[0090] DNA 模板，30ng，2yL;
[0091] 正、反向引物，2.5yM，各lyL;
[0092] 2XTaq PCR Master Mix，12.5yL;
[0093] ddH20,8.5yL;
[0094] PCR扩增程序如下：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，进 行40个循环，最终72°C延伸lOmin，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C或_20°C保存，备用；
[0095] S3、将步骤S2中获得的扩增产物进行测序，所述扩增产物直接送中国农业科学院 重大工程实验室进行测序，所述扩增产物进行正向和反向测序，然后将正向测序结果和反 向测序结果应用生物软件(CodonCode Aligner(CodonCode Co.，USA))进行拼接，为确保拼 接的DNA序列的可靠性，去除测序结构两端信号弱或重叠峰区域，序列方向应与PCR扩增正 向产物方向一致，对上述拼接得到的DNA序列使用基于隐马尔可夫模型的HMMER注释方法 (可参见Profile hidden Markov models.Eddy SR.Bioinformatics，1998，14:755?和 5.8S-28S rRNAinteractionand HMM-based ITS2annotation.Keller A,Schleicher T, Schultz J, et al ? Gene , 2009,430:50 ?)去除序列的5 ? 8S和28S区段，然后获得ITS2基因间 隔区序列，将所得ITS2基因间隔区序列进行比对，若所述ITS2基因间隔区序列含有所述SNP 标记或与所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因如SEQ ID No. 1所示序列相同，则所 述待测九里香为药用植物九里香，反之，为非药用九里香。
[0096] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种药用植物九里香的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为SEQ ID No.l所示序列 中自5'端起第75位的核苷酸T、第109位的核苷酸T和/或第173位的核苷酸A;所述SEQ ID No.l所示序列为所述九里香的ITS2基因间隔区序列。2. -种含有药用植物九里香的SNP标记的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列 如SEQ ID No.l所示，所述SEQ ID No.l所示序列为所述九里香的ITS2基因间隔区序列。3. -种用于检测权利要求1所述的药用植物九里香的SNP标记的引物，其特征在于，所 述引物如下： ITS2F:5 '-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '， ITS3R:5 '-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 '。4. 一种药用植物九里香的快速分子鉴定方法，其特征在于，包括检测待测九里香的 ITS2基因间隔区序列是否含有如权利要求1所述的药用植物九里香的SNP标记和/或权利要 求2所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因的步骤，以鉴别所述待测九里香，若所述 待测九里香含有所述SNP标记和/或所述的含有药用植物九里香的SNP标记的基因，则所述 待测九里香为药用植物九里香，反之，为非药用植物九里香。5. 根据权利要求4所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，其特征在于，包括如下 步骤： 51、 提取所述待测九里香的总基因组DNA; 52、 以步骤S1所得的所述总基因组DNA为模板，设计如下引物： ITS2F:5 '-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 '， ITS3R: 5 '-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 '，对所述总基因组DNA进行PCR扩增； 53、 将步骤S2中获得的扩增产物进行测序，将所得测序结果进行拼接并去除序列两端 5.8S和28S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，然后将所得ITS2基因间隔区序列进行比对， 若所述ITS2基因间隔区序列含有所述SNP标记和/或所述的含有药用植物九里香的SNP标记 的基因，则所述待测九里香为药用植物九里香，反之，为非药用植物九里香。6. 根据权利要求5所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，其特征在于，所述步骤 S2中，所述PCR扩增反应体系包括： DNA 模板，30-50ng，2yL; 正、反向引物，2·5μΜ，各lyL; 2XTaq PCR Master Mix?12.5uL； ddH2〇?8.5uL〇7. 根据权利要求5或6所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，其特征在于，所述 步骤S2中，所述PCR扩增程序如下：94 °C预变性5min，94 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 45s，进行40个循环，最终72°C延伸lOmin，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C或_20°C保存， 备用。8. 根据权利要求5-7任一项所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，其特征在于， 所述步骤S3中，分别将步骤S2中获得的扩增产物进行正向和反向测序，然后将正向测序结 果与反向测序结果进行拼接。9. 根据权利要求5-8任一项所述的药用植物九里香的快速分子鉴定方法，其特征在于， 所述步骤S3中，对拼接得到的DNA序列使用基于隐马尔可夫模型的HMMER注释方法去除序列 两端的5.8S和28S区段。10. -种如权利要求1所述的药用植物九里香的SNP标记、权利要求2所述的含有药用植 物九里香的SNP标记的基因、权利要求3所述的用于检测所述的药用植物九里香的SNP标记 的引物以及权利要求4-9任一项所述的鉴定方法在鉴别药用植物九里香中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK105821128SQ201610258117
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】姚辉, 周红, 马双姣, 陈士林, 宋经元, 陈贝贝, 邢建永, 杨锐培, 马鹏岗
【申请人】华润三九医药股份有限公司, 中国医学科学院药用植物研究所