一种用于检测直肠癌易感性相关的snp位点的引物及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点的引物，包括C11orf93基因的rs3802842位点的引物、SMAD7基因的rs4939827位点的引物、POU5F1B基因的rs6983267位点的引物和RNA5SP229基因的rs10795668位点的引物。采用该引物检测直肠癌易感性相关SNP位点的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取DNA；(2)采用四种引物分别进行目的基因的PCR扩增、胶回收；(3)对胶回收产物进行浓度测定，PCR扩增并纯化；(4)将纯化产物上样，并对SNP检测结果进行分析。该引物特异性好、灵敏度高、准确性好，检测方法简单，可预测受检者患直肠癌的风险。
【专利说明】
一种用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点的引物及检测 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点 的引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 直肠癌(rectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤，在消化道肿瘤中直肠癌的发 病率仅次于胃癌，发病年龄以40~60岁之间居多，平均发病年龄为48.3岁。随着我国经济的 发展和人民生活水平的提高，生活方式和膳食结构的改变，直肠癌的发病率呈逐年上升的 趋势，发病年龄逐渐年轻化。因此，早期的预测预防和早期诊断对直肠癌的防治有着重大意 义。
[0003] 疾病的遗传易感基因检测是当前国内外的热点，而在遗传因素的易感基因检测 中，采用单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphsm，SNP)作为基因组标志的关联 分析方法较为有效和常用。SNP是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态 性，在人群中的发生频率大于1%，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多 态性的90%以上。SNP遗传稳定性强，易于检测，位于基因内部的SNP能直接影响到蛋白质的 结构或表达水平，进而影响到组织、器官乃至生理功能。在直肠癌人群和正常对照人群中进 txSNP对比分析，可以确定相关基因多态性与疾病患病风险的关系。通过米集受检者的血 液，然后对直肠癌易感基因中的关键性基因的遗传位点进行检测，能有效地为直肠癌的预 测、预防、诊断和治疗提供依据和指导，从而对加强直肠癌的防治起到积极作用。
[0004] 但中国专利申请号为CN201410452337.6,专利名称为《结直肠癌易感性诊断试剂 盒和SNP在其制备中的应用》公开了SNP的位点rsl2522693和rsl7836917,但rs3802842位 点、rs4939827位点、rs6983267位点和rsl0795668位点及其各位点的引物以及将这些引物 用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点的方法未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测直肠癌易感性相关的 SNP位点的引物及检测方法，本发明提供了多个位点及各位点的引物以及使用这些引物来 对直肠癌高危人群进行筛选，有利于预防。
[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] 一种用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点的引物，这些引物包括Cllorf93基因 的rs3802842位点的引物、SMAD7基因的rs4939827位点的引物、P0U5F1B基因的rs6983267位 点的引物和RNA5SP229基因的rs 10795668位点的引物；
[0008] 其中，Cllorf93基因的rs3802842位点的上下游引物序列分别为5/_ CTGCTGTTCCTATGACTTCT-SlSEQ ID No:l)和S'-CCACCTAGTTTATTTGGTTC-SlSEQ ID No: 2)；
[0009] s M A D 7基因的r s 4 9 3 9 8 2 7位点的上下游引物序列分别为5/_ GGACAAGCCTAAGATAAAAG-SlSEQIDNodWPS'-GATTCATCGTCTGATCTGTT-SlSEQIDNo: 4)；
[0010] p 〇 u 5 F 1 B基因的r s 6 9 8 3 2 6 7位点的上下游引物序列分别为5/_ GCACTAGACTGGGAATTAGA-SlSEQIDNoJWPS'-GGACTTGCTGGTAGAACTTA-SlSEQIDNo: 6)；
[0011] RNA5SP2 29基因的r s 1 0795668位点的上下游引物序列分别为5/_ GAACCCAGATTTTCTCTATG-SlSEQIDNoJMPS'-TATAAGGGAGCCAGAAAGTA-SlSEQIDNo: 8) 〇
[0012] 采用上述引物检测直肠癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，包括以下步骤：
[0013] (1)采集样品并提取其基因组DNA;
[0014] (2)采用所述的四种引物分别对基因组DNA进行目的基因的PCR扩增，并对扩增产 物进行胶回收；
[0015] (3)对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，采用所述四种引物的单向引物进行 PCR扩增并纯化；
[0016] (4)将步骤(3)中的纯化产物在贝克曼GeXP测序仪上样，并对SNP检测结果进行分 析。
[0017] 进一步地，步骤（2)中PCR扩增体系为：Primer STAR Max 25yL、Primer F 3此、 Primer R 3yL、DNA模板 100-150ng，用ddH20补足体积至50yL。
[0018] 进一步地，步骤(2)中PCR扩增反应条件为:95°C预变性5min，95°C变性10s，55°C退 火10s，72 °C延伸30s，进行35个循环，最后72 °C延伸2min，于4°C保存。
[0019] 进一步地，步骤（3)中PCR扩增体系为：DTCS Master Mix 2.5此，浓度为5pmol/yL 的Primer R 1.0iiL，DNA模板20ng，用ddH2〇补足体积至 10yL。
[0020] 进一步地，步骤（3)中PCR扩增反应条件为：94°C预变性30s，94°C变性25s，55°C退 火25s，60°C延伸3min，30个循环，最后60°C延伸20min。
[0021] 本发明提供的一种用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法，具 有以下有益效果：
[0022] (1)本发明提供了一种用于检测直肠癌易感基因相关位点的引物，该引物具有特 异性高、准确性好的优点，根据该引物对目的基因进行PCR扩增，通过直接测序可准确的测 定人直肠癌易感基因中的多态性位点基因型，可根据基因型结果预测受检者患直肠癌的风 险几率，并针对性的采取有效预防措施进行预防，尽可能规避或者延迟该病的发生，这对直 肠癌的预测和预防具有重大的意义。
[0023] (2)本发明还提供了一种使用特异性的引物检测直肠癌易感性相关SNP位点的方 法，该检测方法简单，其检测结果也具有特异性好，灵敏度高，准确性好等优点。
【附图说明】
[0024]图1为不同受检者血液DNA样品在4种不同引物下的PCR扩增电泳图；
[0025] 图2为Cllorf93基因的rs3802842位点的测序峰图；
[0026] 图3为SMAD7基因的rs4939827位点的测序峰图；
[0027] 图4为P0U5F1B基因的rs6983267位点的测序峰图；
[0028] 图5为RNA5SP229基因的rsl0795668位点的测序峰图；
[0029] 图6为Cllorf93基因的rs3802842位点的测序峰图；
[0030] 图7为SMAD7基因的rs4939827位点的测序峰图；
[0031] 图8为P0U5F1B基因的rs6983267位点的测序峰图；
[0032] 图9为RNA5SP229基因的rsl0795668位点的测序峰图。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] 1、样品的采集及其全基因组DNA的提取
[0035]用EDTA抗凝管采集健康人的外周血3.OmL(随机选择3个受检者），采用天根血液基 因组提取试剂盒提取受检者全基因组DNA，操作过程按试剂盒说明书进行操作，获得的全基 因组DNA使用超微量蛋白核酸分析仪(柏精BioDrop yLite)检测其浓度以及纯度，记录原始 数据，将浓度和纯度都达到要求的DNA置于-20°C冰箱保存备用。
[0036] 2、目的基因的PCR扩增、胶回收、纯化和测序
[0037] 用Cl lorf93基因的rs3802842位点的引物、SMAD7基因的rs4939827位点的引物、 P0U5F1B基因的rs6983267位点的引物和RNA5SP229基因的rsl0795668位点的引物分别对所 提取的DNA进行目的基因的PCR扩增，反应体系为50此，具体如表1所示；
[0038] 表1PCR反应体系
[0040] PCR扩增程序为:95°C预变性5min，95°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，进行 35个循环，最后72°C延伸2min，于4°C保存，过夜需放置_20°C冷冻；
[0041] PCR扩增结束后，取50此扩增产物，1 %琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图1所示；电泳完 成后在凝胶成像仪下切取含有目的片段的凝胶装入EP管中，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒进行胶回收，得到目的片段的DNA，测定其浓度后 进行记录，取一只干净的〇.2mL PCR管，依次加入:PCR Mix、测序引物、灭菌超纯水、模板 DNA，其中模板DNA和灭菌超纯水的用量由上一步所测定的DNA浓度决定，所添加的模板DNA 量为20ng，反应体系为10yL，具体如表2所示，然后进行PCR，扩增程序见表3;
[0042] 表2PCR反应体系
[0044] 表3PCR扩增程序
[0046] ?0?程序结束后对产物进行纯化:将浓度为3111〇1/1，？11值为5.2的醋酸钠缓冲液、 0 ? lmol/L，pH值为8 ? 0的Na2EDTA缓冲液和Glycogen以体积比为2:2:1配制终止液，然后取5y L终止液加入PCR产物中充分混匀，离心，将液体转移至一只新的1.5mL EP管中，然后加入50 此预冷无水乙醇，充分混勾，放入冰箱-20°C冷冻lOmin后于12000r/min离心5min，弃去上 清，再向6?管中加入15〇1^预冷70%乙醇，放入高速离心机离心，1200〇1'/1]1；[11离心21]1；[11，弃去 上清，稍离心，用移液器吸干EP管内剩余的液体，打开EP管盖，室温晾干至白色沉淀变透明， 再向EP管中加入25yL SLS(Sample Loading Solution)溶解DNA;
[0047]上样测序:将溶解的DNA加入96孔样品板孔中，加入的过程中不能产生气泡，然后 再加入适量矿物油;取一块新的96孔板，在对应孔中加入10滴分离缓冲液，最后将96孔样品 板和96孔缓冲液装入GeXP测序仪进行测序。
[0048] 通过序列分析软件(GenomeLab? GeXP(Genetic Analysis System))，将测序结果 与标准序列进行比对，寻找SNP位点，通过分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点 的基因型，样本的检测结果如图2、图3、图4、图5所示，然后再将其中一份受检者的血液DNA 使用本发明提供的引物扩增后送到成都擎科生物有限公司进行测序，得到的测序结果为图 6_图9,其结果与图2-图5结果相同，说明本发明设计的引物特异性好。图2和图6显示的均是 Cllorf93基因的rs3802842位点的测序峰图；图3和图7显示的均是SMAD7基因的rs4939827 位点的测序峰图；图4和图8显示的均是P0U5F1B基因的rs6983267位点的测序峰图；图5和图 9显示的均是RNA5SP229基因的rsl0795668位点的测序峰图。
[0049] 结果分析：
[0050] 图1中1、2、3孔为Cl lorf 93基因的rs3802842位点的引物扩增出的条带，4、5、6孔为 SMAD7基因的rs4939827位点的引物扩增出的条带，7、8、9孔为P0U5F1B基因的rs6983267位 点的引物扩增出的条带，10、11、12孔为RNA5SP229基因的rsl0795668位点的引物扩增出的 条带。由图1可知，每个基因的引物扩增的条件相同，即它们的TM值(DNA的解链温度)是固定 的，不会随目的基因的序列不同而导致TM值不同，且电泳图无非特异性条带。
[0051 ] 图2和图6显示的均是Cllorf93基因的rs3802842位点的测序峰图，Cllorf93基因 的rs3802842位点的非易感基因型为AA，易感基因型为AC和CC，由图2和图6可知，基因型为 CC，说明该样本的该位点基因型为易感基因型。
[0052] 图3和图7显示的均是SMAD7基因的rs4939827位点的测序峰图；SMAD7基因的 rs4939827位点的非易感基因型为CC，易感基因型为TC和TT，由图3和图7可知，基因型为CC， 说明该样本的该位点基因型为非易感基因型。
[0053] 图4和图8显示的均是P0U5F1B基因的rs6983267位点的测序峰图；P0U5F1B基因的 rs6983267位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TG和GG，由图4和图8可知，基因型为GG， 说明该样本的该位点基因型为易感基因型。
[0054] 图5和图9显示的均是RNA5SP229基因的rsl0795668位点的测序峰图；RNA5SP229基 因的rsl0795668位点的非易感基因型为AA，易感基因型为AG和GG，由图5和图9可知，基因型 为AA，说明该样本的该位点基因型为非易感基因型。
[0055] SEQUENCE LISTING <】10>成都中创清科医学检验所有限公司 <12(T> -种用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法 <130> 2016 <160> 8 Patenlln version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工庁列 <4()0> 1 ctgctgttcc tatgacttct 20 ^2i0> 2 -211 ? 20 <212> DNA <213>人工序到 <400> 2 ccacctagtt tatttggttc 20 <m)> 3 <211> 20
[0056] <212> DNA <213>人工序列 <400> 3 ggacaagcct aagataaaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <21:3> 人工序列 <400> 4 gattcatcgt ctgatctgtt 20 <210 5 <2!1> 20 <212> DNA <213>人工序列 400^ 5 gcaGtagact gggaattaga 20 <210> 6 <21r> 20 -212 DMA <21:3>人工序列
[0057] <400> 6 ggacttgctg gtagaaetta 20 <2i0> 7 <21卜 20 <21.2> DNA <213>人工序列 <400> 7 O gaacecagat tttctctatg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DHA <213>人丁序列 <400> 8 tataagggag ccagaasgta 20
【主权项】
1. 一种用于检测直肠癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述引物包括 Cllorf 93基因 rs3802842位点的引物、SMAD7基因 rs4939827位点的引物、P0U5F1B基因 rs6983267位点的引物和RNA5SP229基因 rs 10795668位点的引物； 其中，Cllorf93基因 rs3802842位点的上下游引物序列分别为S'-CTGCTGTTCCTATGACTT CT-3'和5' -CCACCTAGTTTATTTGGTTC-3'; SMAD7基因 rs4939827位点的上下游引物序列分别为S'-GGACAAGCCTAAGATAAAAG-S'和 57-GATTCATCGTCTGATCTGTT-37 ； P0U5F1B基因 rs6983267位点的上下游引物序列分别为S'-GCACTAGACTGGGAATTAGA-S' 和5' -GGACTTGCTGGTAGAACTTA-3'; RNA5SP229基因 rsl0795668位点的上下游引物序列分别为S'-GAACCCAGATTTTCTCTATG-3'和5' -TATAAGGGAGCCAGAAAGTA-3'。2. 采用权利要求1所述的引物检测直肠癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征 在于，包括以下步骤： (1) 米集样品并提取其基因组DNA; (2) 采用所述的四种引物分别对基因组DNA进行目的基因的PCR扩增，并对扩增产物进 行胶回收； (3) 对胶回收产物进行浓度测定，计算模板量，采用所述四种引物的单向引物进行PCR 扩增并纯化； (4) 将步骤(3)中的纯化产物在测序仪上样，并对SNP检测结果进行分析。3. 根据权利要求2所述的检测直肠癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在 于，步骤（2)中PCR扩增体系为：Primer STAR Max 25yL、Primer F 3yL、Primer R 3yL、DNA 模板100_150ng，用ddH2〇补足体积至50yL。4. 根据权利要求2所述的检测直肠癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在 于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为:95°C预变性5min，95°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸 30s，进行35个循环，最后72°C延伸2min，于4°C保存。5. 根据权利要求2所述的检测直肠癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在 于，步骤（3)中PCR扩增体系为:DTCS Master Mix 2.5yL，浓度为5pmolAxL的Primer R 1·0μ L，DNA模板20ng，用ddH2〇补足体积至10yL。6. 根据权利要求2所述的检测直肠癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在 于，步骤(3)中PCR扩增反应条件为：94°C预变性3〇8,94°(：变性258,55°(：退火258,60°(：延伸 3min，30个循环，最后60°C延伸20min。
【文档编号】C12N15/11GK105821147SQ201610364032
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】陈思翔, 张蓉, 刘宇, 邓银
【申请人】成都中创清科医学检验所有限公司