用于治疗伤口，尤其是慢性伤口的分子靶标的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于治疗伤口，优选慢性伤口的治疗性化合物，包含：–抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂：MAF、MEOX2、SIX2及其与所述基因具有至少50％同一性的同源物，和/或–增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、FOXS1、GLI1、SOX9及其与所述基因具有至少50％同一性的同源物。
【专利说明】
用于治疗伤口，尤其是慢性伤口的分子靶标
技术领域
[0001] 本发明涉及至少一种用于愈合或治疗伤口，尤其是慢性伤口，更优选非愈合性慢 性伤口的分子靶标。进一步的，本发明涉及用于治疗伤口的新型疗法和包含所述用于治疗 伤口的分子靶标的新型基因治疗方法。此外，本发明涉及使用所述疗法或所述基因治疗来 治疗伤口的方法。
【背景技术】
[0002] 自然的伤口愈合分为三个连续阶段;每个阶段的特征是特异性的细胞活性:炎症 阶段、增殖阶段和重塑阶段。
[0003] 第一个阶段称为炎症阶段，在受伤后几分钟开始。血管破裂诱导形成主要由纤维 蛋白和纤维连接蛋白组成的血块。血块部分填充病变，并允许炎症细胞在病变区内迀移。炎 症细胞被募集以清创伤口。血小板释放因子(例如细胞因子和/或生长因子），所述因子诱导 募集涉及伤口愈合的细胞(炎症细胞例如中性白细胞和巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮 细胞）。
[0004] 第二个阶段称为增殖阶段，对应于肉芽组织的发育。成纤维细胞迀移至伤口区、增 殖并通过分泌细胞外基质(ECM)蛋白形成新的临时细胞外基质。然后，血管内皮细胞迀移以 促进病变的血管新生或血管生成。在肉芽组织内，成纤维细胞被激活并分化成由于表达α_ 平滑肌肌动蛋白（与平滑肌细胞中的那些相似)而具有收缩特性的肌成纤维细胞。肌成纤维 细胞在伤口愈合中具有重要作用，因为它们提供伤口收缩。最后，角化细胞从伤口边缘迀 移、增殖并分化以重建表皮。
[0005] 伤口愈合过程的最后一个阶段在伤口闭合后发生。它对应于肉芽组织的重塑。肉 芽组织重组，III型胶原蛋白被I型胶原蛋白替代，因为正常真皮主要由I型胶原蛋白组成。 在该阶段期间，过量的肌成纤维细胞通过细胞凋亡清除。伤口愈合的最后一个阶段较长。受 伤后一年，疤痕重塑，变得没那么红且更薄。
[0006] 然而，该过程不仅复杂而且脆弱，容易中断或失败，导致形成慢性或非愈合性伤口 或形成异常疤痕。可能导致这个的因素包括疾病(例如糖尿病、静脉或动脉疾病）、年龄、感 染或组织定位。
[0007] 慢性或非愈合性伤口
[0008] 慢性伤口是世界性的健康问题，部分是由于缺乏充分的治疗方法。在2010年，全世 界超过7百万人罹患慢性伤口，且预计每年增加至少10%。
[0009] 慢性伤口有时是非愈合性伤口。常见的慢性伤口类型包括但不限于，下肢静脉溃 疡、糖尿病性足溃疡、褥疮溃疡、下肢动脉溃疡、混合病因的那些(静脉和动脉)或病因未知 的那些。我们也可以发现，剂型伤口由于没有正确愈合而变成慢性。
[0010]非愈合性伤口或慢性伤口对于患者、医疗保健专家和医疗保健系统是一个挑战。 它们明显损害几百万人的生活质量，并在生产力损失和医疗保健经济上对社会造成负担。 [0011]伤口愈合是导致组织完整性和功能性恢复的动态途径。当正常的修复过程被干 扰，则发生慢性伤口或非愈合性伤口。通过理解伤口愈合的生物学，医生可以通过选择适合 的治疗来优化伤口愈合。
[0012] 在慢性或非愈合性伤口中，自然的愈合过程被改变，因此愈合延长、不完全，且有 时候伤口从不闭合。当一些因子造成正常炎症和增殖阶段的中断时，慢性伤口出现。通过增 强或操纵涉及伤口愈合的因子，因此可能能够矫正过程，从而降低慢性伤口发生的几率或 加速其随后的修复。
[0013] 成纤维细胞在伤口愈合中的作用
[0014] 伤口愈合的过程涉及成纤维细胞，这涉及几个分化步骤:从静态成纤维细胞到将 转化成肌成纤维细胞的动态成纤维细胞，最后进入细胞凋亡。在慢性或非愈合性伤口中，这 个过程被错误调节，成纤维细胞没有进行肌成纤维细胞的分化，在伤口中发现作为非功能 性成纤维细胞，即假衰老成纤维细胞（Telgenhoff D，Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing.Cell Death Differ 12:695-698)。 本发明的目的是在整个基因组的范围定位需要在这个过程期间被激活或失活的不同基因， 从而促进伤口的愈合过程。
[0015] 人成纤维细胞具有进入称为衰老的生理过程的能力，其允许有限的复制细胞周 期，从而避免丧失遗传信息。它通常在细胞已经进行几轮复制后发生(称为复制衰老，取决 于端粒长度），但也可以响应于环境压力而发生(Muller M(2009)Cellular senescence: molecular mechanisms，in vivo significance,and redox considerations.Antioxid Redox Signal 11: 59-98)。衰老细胞在细胞周期中被抑制，但保持代谢活性(Telgenhoff D,Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing.Cell Death Differ 12:695-698)〇
[0016] 慢性伤口的成纤维细胞失去其某些功能，更具体地，它们失去其部分或全部的复 制功能（Telgenhoff D，Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing.Cell Death Differ 12:695_698)。在伤口中，人成纤维细胞还与APA-1(诱 导基质重塑的蛋白）的上调有关，表明假衰老成纤维细胞表现型不是由端粒损耗引起 (Benanti JAjWilliams DKjRobinson KLjOzer HLjGalloway DA(2002)Induction of extracellular matrix-remodeling genes by the senescence-associated protein APA-1.Mol Cell Biol 22:7385-7397)。因此，慢性伤口中衰老成纤维细胞的出现更具体地 是因为慢性炎症，而不是端粒变短（Telgenhoff D，Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing.Cell Death Differ 12:695-698)〇
[0017] 本发明可以通过以主动促进愈合的方式治疗伤口来改善患者的生活质量。
[0018] 发明简述
[0019] 本发明涉及用于治疗伤口，优选慢性伤口的治疗性化合物，包括：
[0020] -抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因 具有至少50 %同一性的同源物，和/或
[0021] -增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、 JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、FOXSI、GLII、S0X9，优选 FOXSI、EGR2、S0X9、TCF4、STAT4 及其与所 述基因具有至少50%同一性的同源物。
[0022] 本发明还涉及包含如上定义的治疗性化合物和药学上可接受的载体的药物组合 物。
[0023] 在一个方面，本发明涉及制备如上定义的药物组合物的方法，包括将所述治疗性 化合物与药学上或兽医上可接受的载体或介质结合或联合。
[0024] 在另一个方面，本发明涉及用于治疗哺乳动物伤口的方法，其中所述方法包括向 所述伤口施用包含以下的治疗性化合物：
[0025]-抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因 具有至少50 %同一性的同源物，和/或
[0026]-增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、 JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、FOXSI、GLII、S0X9，优选 FOXSI、EGR2、S0X9、TCF4、STAT4 及其与所 述基因具有至少50%同一性的同源物。
[0027] 本发明还涉及用于治疗伤口，优选慢性伤口的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
[0028] (a)至少一种如上定义的治疗性化合物或药物组合物，和
[0029] (b)至少一种用于向所述伤口施用的敷料。
[0030] 还在另一个方面，本发明涉及用于治疗伤口，优选慢性伤口的联合治疗，包括：
[0031] a)抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因 具有至少50%同一性的同源物，和/或增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂:CREB5、 E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、F0XS1、GLI1、S0X9，优选F0XS1、EGR2、 S0X9、TCF4、STAT4及其与所述基因具有至少50 %同一性的同源物，和
[0032] b)至少一种进一步的治疗。
[0033] 本发明还涉及以下试剂在用于治疗伤口，优选慢性伤口的用途:抑制至少一个选 自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因具有至少50%同一性的同源 物，和/或增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂:CREB5、E2FI、EGR2、HICI、IRF7、JUN、 MYC、SRF、STAT4、TCF4、FOXSI、GLII、S0X9，优选 FOXSI、EGR2、S0X9、TCF4、STAT4 及其与所述基 因具有至少50%同一性的同源物，其中所述试剂调控成纤维细胞和肌成纤维细胞的分化 和/或活性。
[0034] 发明详述
[0035] 因此，本发明的一个方面提供用于治疗伤口，优选慢性伤口的治疗性化合物，包 含：
[0036]-抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因 具有至少50 %同一性的同源物，和/或
[0037]-增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、 JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、FOXSI、GLII、S0X9，优选 FOXSI、EGR2、S0X9、TCF4、STAT4 及其与所 述基因具有至少50%同一性的同源物。
[0038] 优选的，所述试剂抑制至少一个选自MAF、ME0X2和SIX2的基因的活性，或其中所述 试剂增强至少一个选自S0X9和GLI1的基因的活性。
[0039] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述治疗性组合物还包含至少：
[0040] (a)_抑制PPARG或与PPARG具有至少50%同一性的同源物的活性的试剂，和/或
[0041] (b)_增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：SMAD3、SMAD4及其与所述基因 具有至少50 %同一性的同源物。
[0042] 实际上，发明人已经发现愈合过程涉及这些基因，且它们的下调或上调有助于治 疗伤口，尤其是慢性伤口。
[0043] 因此，本发明涉及新型基因治疗方法和/或新型蛋白治疗方法。
[0044] 如在本文所用，表述"抑制基因活性的试剂"或"抑制剂"是指能够下调所述基因的 试剂。它包括在基因表达水平起作用的试剂以及在蛋白水平起作用的试剂，无论是通过降 低给定细胞中存在的蛋白的量还是通过抑制蛋白活性。
[0045] 如在本文所用，表述"增强基因活性的试剂"或"增强剂"是指能够上调所述基因的 试剂。它包括在基因表达水平起作用的试剂以及在蛋白水平起作用的试剂，无论是通过增 加给定细胞中存在的蛋白的量还是通过增加蛋白活性。它还包括在信号通路中，在所述基 因或蛋白上游或下游起作用的试剂。
[0046] 在本发明的一个实施方案中，新型治疗包括基因表达的抑制剂或增强剂，所述抑 制剂或增强剂可以是裸露的或是质粒和病毒载体或药物形式的反义DNA或RNA、s i RNA、 shRNA、cDNA、TALENS 或核酶。
[0047]在一个优选的实施方案中，所述治疗性化合物是siRNA，其选自具有SEQ ID NO: 1 至SEQ ID N0:8的序列的siRNA及其混合物。
[0048] 通常，MAF基因的表达可以被具有如SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID N0:2所示的序列的 siRNA抑制。
[0049] SEQ ID N0:1:5'-UUCGAUCUGAUGAAGUUUGAA
[0050] SEQ ID N0:2:5'-CGGCAGGAGAAUGGCAUCAGA
[0051 ] 通常，ME0X2基因的表达可以被具有如SEQ ID N0:3和/或SEQ ID N0:4所示的序列 的siRNA抑制。
[0052] SEQ ID N0:3:5'-AGCAUGCGCACUUAUGAUAUA
[0053] SEQ ID N0:4:5'-CCCGCCCGUCCUGUGCUCCAA
[0054] 通常，PPARG基因的表达可以被具有如SEQ ID N0:5和/或SEQ ID N0:6所示的序列 的siRNA抑制。
[0055] SEQ ID N0:5:5'-UCCGGAGAACAAUCAGAUUGA
[0056] SEQ ID N0:6:5'-GAGGGCGAUCUUGACAGGAAA
[0057] 通常，SIX2基因的表达可以被具有如SEQ ID N0:7和/或SEQ ID N0:8所示的序列 的siRNA抑制。
[0058] SEQ ID N0:7:5'-CAACGAGAACUCCAAUUCUAA
[0059] SEQ ID N0:8:5'-CCCGCUGAAUGGCAGCGGCAA
[0060] 在一个实施方案中，增强基因活性的试剂是cDNA。
[0061 ] 通常，CREB5基因的表达可以通过施用CREB5cDNA增强。
[0062]这对列出的所有其他基因同样比照适用。
[0063]可以用本领域技术人员已知的任何合适形式向待治疗的伤口施用或递送cDNA。它 可以作为裸露DNA递送、施用质粒载体、病毒载体或任何其他合适的手段。
[0064]在另一个实施方案中，新型治疗包含由基因功能编码的蛋白质的抑制剂或增强 剂，所述抑制剂或增强剂可以是可逆或不可逆结合以抑制或增强蛋白功能的结合剂，例如 抗体或已知的或合成的蛋白激动剂或拮抗剂;或在蛋白信号机制上游或下游起作用以抑制 或增强蛋白信号，从而在伤口组织中消除或增强蛋白表达的效果的试剂。
[0065] 所述试剂(抑制剂或增强剂)可以是本领域已知的作用于给定分子靶标的任何试 剂。
[0066] 优选的，所述试剂是小分子。
[0067] 优选的，MAF蛋白的抑制针对其活性。更优选的，MAF蛋白被MAF拮抗剂(例如曲美替 尼)抑制。曲美替尼是由GIaxoSmithKI ine用商品名Mckinist?出售的化学分子。
[0068] 优选的，在另一个实施方案中，GLIl的蛋白的活化针对其活性。更优选的，使用 GLIl拮抗剂，更优选Gant61。所述化合物也称为2,2'_[[二氢-2-(4-吡啶)-1，3(2Η，4Η)_嘧 啶亚基]双（亚甲基）]双[N，N-二甲基苯胺。在另一个实施方案中，优选的，S0X9蛋白的活化 针对其活性。更优选的，使用S0X9拮抗剂，更优选AM580.所述化合物也称为4-[ (5，6，7，8-四 氢_5,5,8,8_四甲基-2-萘乙烯基）甲酰胺基]苯甲酸。
[0069] 通常，PPARG增强剂可选自噻唑烷二酮，例如罗格列酮和吡格列酮（Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord.20050ct;5(5):377-86.Role of PPAR-gamma agonist thiazolidinediones in treatment of pre-diabetic and diabetic individuals:a cardiovascular perspective.Dumasia R1Eagle KA,Kline-Rogers E, May N,Cho L1Mukherjee D)〇
[0070] 通常，PPARG的抑制剂可以是G3335(CAS 36099-95-3) (Chembiochem.2006Jan; 7 (I):74-82. The dipeptide H-Trp-Glu-OH shows highly antagonistic activity against PPARgamma:bioassay with molecular modeling simulation.Ye F,Zhang ZS， Luo HB,Shen JH,Chen KX,Shen X，Jiang HL.)〇
[0071] 本发明的治疗剂用于治疗伤口，更理想地慢性伤口，优选非愈合性伤口。这些伤口 优选哺乳动物伤口，更优选人伤口。优选用本发明治疗的慢性伤口是下肢溃疡、糖尿病足溃 疡、压疮。
[0072] 用于本发明的抗体最理想是单克隆抗体或人源化抗体。
[0073] 在本发明的以上方面和实施方案中，配制治疗剂用于局部应用，但也可以配制用 于口服、皮肤、经皮、透皮、静脉或任何已知的应用。
[0074] 或者，在本发明的以上方面，配制治疗剂用于应用于敷料或浸渍敷料。
[0075] 本发明的治疗剂可与另一种活性剂一起施用。这种活性剂可以是抗生素或抗菌 剂、防腐剂、抗病毒剂、抗真菌剂、止痛剂、抗炎剂、伤口愈合剂、角质分离剂、麻醉剂。这种活 性物质是熟练的医生众所周知的。
[0076] 在本发明的另一个方面，提供用于治疗伤口的药物组合物，包含本发明的治疗剂 和药学上可接受的载体。
[0077] 只要对于待治疗的伤口考虑是合适或推荐的，在药物组合物中也可存在其他活性 物质。
[0078] 载体，如果存在超过一种，则每一种载体必须在与制剂中的其他成分相容方面是 可接受的，且对接受者无害。
[0079] 制剂包括适于局部、口服、直肠、经鼻或任何已知施用的那些，且可通过药学领域 公知的任何方法制备。
[0080]可以通过将本发明的治疗剂与载体结合来制备组合物。通常，通过以下来制备制 剂:将活性剂与液体载体均匀紧密结合，或将活性剂与液体载体或细分固体载体或两者精 确结合，然后如有需要，将产品成型。本发明扩展至用于制备药物组合物的方法，包括将本 发明的治疗剂与药学上可接受的载体或介质联合或结合。
[0081] 对于皮肤的局部应用，可以将常规用途的化合物制成霜剂、软膏、凝胶、啫喱、溶液 或悬浮液等。可以用于组合物的霜剂或软膏制剂是本领域公知的常规制剂。
[0082] 本发明中用于口服施用的制剂可以呈现为:胶囊、各自包含预定量的活性剂的小 袋或片剂;粉末或颗粒;水性液体或非水性液体中的活性剂溶液或悬浮液、或水包油液体乳 液或油包水液体乳液;或药丸等。
[0083] 对于口服施用的组合物(例如片剂或胶囊），术语"可接受的载体"包括介质如常见 赋形剂，例如粘合剂，如糖浆、阿拉伯树胶、凝胶、山梨醇、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮（聚维 酮）、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉;填充剂和 载体，例如玉米淀粉、凝胶、半乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠和 褐藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他硬脂酸盐、硬脂酸甘油硬脂酸、硅油、滑石 蜡、油和硅胶。也可以使用调味剂例如薄荷、冬青油、樱桃香料等。期望添加着色剂以使剂量 形式容易分辨。也可以用本领域公知的方法包衣片剂。
[0084] 另外或可替代的，本发明的进一步方面还包括或可替代的包括用于治疗哺乳动物 伤口，通常慢性伤口的新方法，所述方法包括向所述伤口施用：
[0085]-抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因 具有至少50 %同一性的同源物，和/或
[0086]-增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、 JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、FOXSI、GLII、S0X9，优选 FOXSI、EGR2、S0X9、TCF4、STAT4 及其与所 述基因具有至少50%同一性的同源物。
[0087]本发明还包括用于治疗哺乳动物伤口，通常慢性伤口的新方法，所述方法进一步 包括向所述伤口施用：
[0088]-抑制PPARG或与PPARG具有至少50 %同一性的同源物的活性的试剂，和/或
[0089] -增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂:SMAD3、SMAD4及其与所述基因具有 至少50 %同一性的同源物。
[0090] 根据本发明的进一步方面，提供用于治疗伤口，优选慢性伤口的试剂盒，其中所述 试剂盒包括：
[0091] (a)至少一种如上所述的治疗剂;和
[0092] (b)至少一种用于向所述伤口施用的医疗设备。
[0093]术语"医疗设备"包括器械、装置、移植体、体外试剂或用于诊断、预防或治疗疾病 或其他病症的且在机体内或机体上不通过化学反应实现其目的（使其成为药物）的相似或 相关的物品。当医药产品（也称为药品)通过病理、代谢或免疫手段实现其主要目的，医疗设 备通过其他手段，例如物理、机械或热能手段起作用。
[0094]还根据本发明的进一步方面，提供用于治疗伤口的联合治疗剂，包含ME0X2、MAF、 SIX2 的抑制剂或 CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、S0X9、GLI1、 卩0父51，优选？(^5^61?2、5(^9、11^4、5了4了4基因表达的增强剂和]\^(^2、]\^?、5以2的抑制剂 或CREB5、E2FI、EGR2、HI CI、IRF7、JUN、MYC、SRF、STAT4、TCF4、S0X9、GLII、FOXS1，优选 FOXS1、 EGR2、S0X9、TCF4、STAT4蛋白活性的增强剂。
[0095]本发明还包含用于治疗伤口的联合治疗剂，所述联合治疗剂进一步包含PPARG基 因表达的抑制剂或SMD 3、SMAD4基因表达的增强剂和PPARG抑制剂或SMAD3、SMAD4蛋白活性 的增强剂。
[0096]还根据本发明的进一步方面，提供用于治疗伤口的联合治疗剂，包含ME0X2、MAF、 ?卩八1^、51乂2蛋白或其同源物的抑制剂或〇^85 42?1461?2、!11(：1、11^7、11^、]\^(：、5]\^03、 SMAD4、SRF、STAT4、TCF4、S0X9、GL11、FOXS1，优选FOXSI、EGR2、S0X9、TCF4、STAT4蛋白或其同 源物的增强剂。
[0097]本发明还包含用于治疗伤口的治疗剂，进一步包含PPARG蛋白或其同源物的抑制 剂或SMAD3、SMAD4蛋白或其同源物的增强剂。
[0098]根据本发明的进一步方面，提供ME0X2、MAF、SIX2蛋白或其同源物的抑制剂在制备 用于治疗伤口的药物中的用途。根据本发明的进一步方面，提供ME〇X2、MAF、SIX2蛋白或其 同源物的抑制剂用于治疗伤口的用途。
[0099]本发明进一步提供PPARG蛋白或其同源物的抑制剂在制备用于治疗伤口的药物中 的用途。根据本发明的进一步方面，提供PPARG蛋白或其同源物的抑制剂用于治疗伤口的用 途。
[0100] 如本文所用，术语"同源物"是指与ME0X2、MAF、PPARG、SIX2的氨基酸序列具有至少 50%同源性且保留1^(^2、1^?、？?六1^、31乂2序列的生物活性的氨基酸序列。优选同源物与 腿(^24了31、]\^?、？?41^、31乂2肽序列具有至少75%同源性，以优选的增加顺序，与]\^0父2、 MAF、PPARG、SIX2肽序列具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性。
[0101]根据本发明的进一步方面，提供CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、MYC、SRF、 STAT4、TCF4、S0X9、GLII、FOXS1，优选 FOXSI、EGR2、S0X9、TCF4、STAT4蛋白或其同源物的增强 剂在制备用于治疗伤口的药物中的用途。
[0102] 根据本发明的进一步方面，提供SMAD3、SMAD4蛋白或其同源物的增强剂用于治疗 伤口的用途。
[0103] 如本文所用，术语"同源物"是指与 CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、MYC、SMAD3、 3]\^04、31^、3了4了4、1^?4、3(^9、61^11、？(^31的氨基酸序列具有至少50%同源性且保留 CREB5、E2FI、EGR2、HICI、IRF7、JUN、MYC、SMAD3、SMAD4、SRF、STAT4、TCF4、S0X9、GLII、FOXS1 序列的生物活性的氨基酸序列。优选同源物与CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、MYC、 5嫩03、5]\^04、51^、5了六了4、1^4、5(?9、61^1小(《51肽序列具有至少75%同源性，以优选的增 加顺序，与 CREB5、E 2FI、EGR2、HI CI、IRF7、JUN、MYC、SMAD3、SMAD4、SRF、STAT4、TCF4、S0X9、 GLIl、F0XS1肽序列具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性。
[0104] 本文所述的伤口治疗包括参考人或兽医用途。
[0105] 在本发明随后的权利要求书和之前的说明书中，除非文中由于表达语言或必要含 义需要，单词"包含(comprise)"或变体例如"包含（comprises)"或"包含(comprising)"以 包括的含义使用，即指定所述特征的存在但不排除本发明各种实施方案中进一步特征的存 在或添加。
[0106] 本发明各方面的优选特征可以与其他方面的任何特征一起描述。
[0107] 本发明的其他特征将从以下实施例变得明显。一般而言，本发明扩展至该说明书 (包括所附的权利要求书和附图）中公开的特征的任何新特征或新组合。因此，与本发明的 具体方面、实施方案或实施例一起描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分可以理解为 可应用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
[0108] 并且，除非另有说明，本文所述的任何特征可以用为相同或相似目的的其他特征 代替。
[0109] 根据本发明的基因的全部信息可从N C B I数据库（h t t p : / / WWW. ncbi . nlm. nih. gov/)获得或是本领域技术人员公知的。
【附图说明】
[0110] 附图的图注如下：
[0111] 图la:向正常人真皮成纤维细胞(NHDF)施用的不同治疗的示意图。
[0112] 图Ib:表示不同治疗中用RT-qPCR评估的aSMA mRNA水平的图表。
[0113] 图2a:表示用RT-qPCR评估的aSMA mRNA水平的图表。用模拟siRNA或针对不同mRNA (EGR2、SRF、HICI、STAT4、TCF4、GL11、JUN、IRF7、E2FI、MYC、CREB5、FOXSI、S0X9或 STAT1)的 s i RNA处理NHDF，伴随或不伴随TGFm处理。用TUBB标准化RT-qPCR，将模拟s i RNA处理(T-E-) 的条件设为1。用针对SRF、HIC1或STAT4的siRNA处理NHDF导致大量细胞死亡。（*):无法分 析。
[0114] 图2b:表示如a)所述处理NHDF后，用aSMA阳性细胞评估的分化细胞百分比的图表。 用针对SRF、HIC1或STAT4的siRNA处理NHDF导致大量细胞死亡。（*):无法分析。
[0115] 图2c:表示用RT-qPCR评估的aSMA mRNA水平的图表。用模拟siRNA或针对不同mRNA (卩卩六1^、]\^?、]\^(^2、31乂2、3了41'1或1]3?2)的8丨1?祖处理原发性人真皮成纤维细胞。用1'1^8标 准化RT-qPCR，将模拟s iRNA处理(T-E-)的条件设为1。
[0116] 图2d:表示用RT-qPCR评估的aSMA mRNA水平的图表。用模拟siRNA或针对不同mRNA (?卩八1?、獻？、]\^(?2、5以2、5了41'1或1]5?2)的8丨1?嫩处理顺〇?，伴随〇1?1单独处理或与了6?01联 合处理。用TUBB标准化RT-qPCR，将其标准化至模拟s iRNA处理(T-E-)的条件(设为1但在该 表中未显示）。为帮助分析不同siRNA的作用，添加其中用模拟siRNA和TGFm处理的条件，并 代表正常分化(模拟直方图中的浅灰色条）。
[0117] 图2e:表示用RT-qPCR评估的aSMA mRNA水平的图表。如d)所述处理NHDF，除了用来 自患有慢性伤口的不同患者的不同渗出物进行的渗出物处理(CWF2)。
[0118] 图 3:对EGR2、FOXSI、S0X9、SRF、STAT4、TCF4、MYC、JUN、IRF7、E2FI、CREB5和GLI1， TGFm处理后的短期和长期。对于各因子，图表表示RT-qPCR评估的用TGFP处理的NHDF随时 间增加的mRNA水平。
[0119] 图4:在成纤维细胞分化成肌成纤维细胞中的关键转录因子
[0120] a)解释计算机模拟的网络分析的图表
[0121] b)表示通过生物信息学和网络分析鉴定的不同转录因子的表格。
[0122] 图5:对PPARG、MAF、ME0X2和SIX2，TGFm处理后的短期和长期。对于各因子，图表表 示RT-qPCR评估的用TGF0处理的NHDF随时间增加的mRNA水平。
[0123] 图6:表示用模拟8丨1?熟或针对不同了?1111?熟(5(?9』61?2、1^4或?(《51)的8丨1?熟处理 并伴随 TGF-β 处理 NHDF(供体 A)48h(浅灰色）或 72h(深灰色）后，TCF4(a)、EGR2(b)、S0X9(c)、 5丁八了4((1)、？(^51(6)、？?厶1^(〇、]\^?(8)、]\^(^2(11)和51乂2(丨）1111?祖水平的图表。对于所有图 表，对于各处理时间（48h和72h)，将用模拟siRNA和TGF-β处理(T+E)的条件设为100%。
[0124] 图7:向正常人真皮成纤维细胞(NHDF)施用的具有渗出物(a)或不具有渗出物(b) 的不同药物处理的示意图。
[0125] 图8a:表示用RT-qPCR评估的用曲美替尼处理的NHDF中a SMAmRNA水平的图表。
[0126] 图8b:表示用RT-qPCR评估的在渗出物存在下用曲美替尼处理的NHDF中aSMA、PI16 和ACTClmRNA水平的图表。
[0127] 图9a:表示用RT-qPCR评估的用Am580处理的NHDF中aSMAmRNA水平的图表。
[0128] 图9b:表示用RT-qPCR评估的在渗出物存在下用Am580处理的NHDF中aSMA、PI16和 ACTClmRNA水平的图表。
[0129] 图 10:表示用 RT-qPCR评估的用 Gan 161 处理的 NHDF 中 a SMA、GL11、S0X9 和MAF mRNA 水平的图表。
[0130]表1:为治疗伤口、非愈合性或慢性伤口待上升或下降的基因。
[0131] 表2:各靶基因的siRNA序列。
【具体实施方式】
[0132] 响应病变，成纤维细胞迀移入伤口，在其中它们分化成最后将在重塑阶段期间进 入细胞凋亡的收缩性肌成纤维细胞。可以在环境控制的组织培养条件下离体研究该分化过 程，因此可以解决时间控制的一系列不同基因的表达模式。
[0133] 材料和方法
[0134] 建立慢性伤口的离体模型
[0135] 正常真皮成纤维细胞培养和渗出物收集
[0136] 从Promoce 11购买分离自人外植体的NHDF。在补充有10 % FCS (Invitrogen, 5yg/mL 的胰岛素和 Ing/mL 的 b-FGF(PromoKine))的 DMEM-F12( Invitrogen)中培养 NHDF。
[0137] 为收集渗出物，招募两名患有混合溃疡的患者。对于患者选择，决定排除在伤口病 因中潜在涉及的任何其他同病因子:糖尿病、外周动脉疾病、营养不良。从负压疗法中收集 渗出物。将所有渗出物在1500xg下离心3分钟以除去细胞碎片。将上清液过滤并储存于-80 °(：直到使用。用等分试样来根据BCA方法(Sigma)来测定蛋白浓度。
[0138] 建立慢性伤口的离体模型
[0139] 为实验在48小时期间除去细胞中的胰岛素和b-FGF。然后，将细胞在胶原涂层培养 板上，在补充有10%FCS、10ng/mL的TGF-m(Promocell)的DMEM-F12中培养4天。测试四个点 以鉴别渗出物对成纤维细胞分化的作用：未处理细胞(T-E-)、用TGF-βΙ处理的成纤维细胞 (T+E-)、用渗出物处理的细胞(T-E+)和最后同时用TGF-βΙ和渗出物处理的成纤维细胞(T+E + ) 〇
[0140] 通过分析肌成纤维细胞标志物α平滑肌肌动蛋白（aSMA)的表达来评估成纤维细胞 的分化效率。
[0141] Western 印迹分析
[0142] 通过用裂解液〇1?13、似(：1、即4040了4、頂01'1')刮细胞并在冰上孵育30分钟提取总 蛋白。为除去细胞碎片，将样品于4°C在13000xg下离心10分钟，并储存于-20°C直到使用。根 据BCA方法(Sigma)测定蛋白浓度。在NuPAGE 10 % BI S-Tr is凝胶（Invitrogen)上样等量的 总蛋白（20yg)，在150V通过迀移分离，并在30V转移至硝酸纤维素膜(Whatman)I小时。然后， 染色膜中的aSMA(Abcam)和微管蛋白（Abeam)。随后分别用与辣根过氧化物酶（HRP) (Promega)偶联的第二抗体山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠 IgG孵育。用UptiLight HS WB底物 (Uptima ,Interchim)通过ECL化学发光检测信号。用扫描器将条带数字化，并用软件 (ImageJ 1.43u，64-bit)计算相同印迹强度的所有条带之间的比例。将相对aSMA表达标准 化至各自的微管蛋白值。
[0143] 总RNA样品制备
[0144] 实验4天后，用TRIzol试剂（Invitrogen)裂解经处理的成纤维细胞，并储存于-80 °C。然后用氯仿纯化并用异丙醇沉淀RNA。在NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific )上定量总 RNA。使用Superscript IIIRT(Invitrogen)和RNAse OUT (1]1￥；[1：!'08611)用01丨8(^(11'(111￥；[1：1'08611)将5001^总1?祖逆转录成00嫩。将00嫩储存于-20 cC。
[0145] 定量实时RT-PCR
[0146] 在LightCycler480系统（Roche)上，用Maxima SYBR Green qPCR混合母液 (Fermentas)，用5yL 1: 20稀释的cDNA进行定量实时RT-PCR(RT-qPCR)。用Eurof ins设计α SMA的正向和反向引物(MffG，aSMA正向：CTGTTTTCCCATCCATTGTG(SEQ ID NO: 9)，aSMA反向： CCATGTTCTATCGGGTACTT(SEQ ID NO: 10))，并将 1 ΟΟμΜ储液储存于-20°C。在每个RT-qPCR反 应中使用正向和反向引物对。循环条件如下:初始95°C10分钟，接着是45个循环(95°C 15秒， 58°C30秒，72°C20秒）。用LightCycler 480SWl·5评估TM曲线，测定Cp，并将各扩增反应的 相对浓度近似化。
[0147] siRNA 处理
[0148] a平滑肌肌动蛋白免疫荧光
[0149] 将如前所述处理的在胶原涂层的培养皿中生长的细胞用PBS中的4 %多聚甲醛 (PFA)固定15分钟，并用PBS中的2·5%Triton X-100(Euromedex，2000-B)渗透3分钟。用PBS 中的5%BSA饱和后，染色细胞中的a-SMA(Abcam，ab5694)和DNA(DAPI)。使用CyTM3偶联的抗 兔（GE Healthcare ,PA43004)作为第二抗体。在Nikon ECLIPSE Ti (Nikon)上用油浸物镜 (Plan Fluor 40X/1.300il,Nikon)观察样品。用数码相机(Cool SNAP HQ2,Photometries) 和软件(MetaMorf 7.5.4.0)拍摄数字图像。为评估由不同处理引起的成纤维细胞分化百分 比，用DAPI测定每个视野中细胞的总数，并用α-SMA染色计数肌成纤维细胞(分化的成纤维 细胞）。然后，实现STUDENT(t-)和X 2检测以评估未处理成纤维细胞(T-E-)和经处理的成纤 维细胞之间aSMA的差异表达。
[0150] mRNA表达分析
[0151] 总RNA样品制备和cDNA合成。
[0152] 实验4天后，用TRIzol试剂（Invitrogen(Life Technologies)，15596-018)脱离经 处理的成纤维细胞，并储存于-80 °C。然后用氯仿纯化并用异丙醇沉淀RNA。在NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific)上定量总RNA，并在RNA Nano Chips(Agilent 2100 bioanalyzer ,Agilent ,5067-1511)上评估它们的质量。使用 Superscript III RT (Invitrogen(Life technologies),18080-085)和RNAse 0UT(Invitrogen(Life technologies)，10777-019)用oligot dT(Invitrogen(Life technologies)，18418-020) 将500ng总RNA逆转录成cDNA。将cDNA储存于-20°C。仅将具有良好生物分析谱的样品用于 qPCR分析。
[0153] 网络分析
[0154] 为发现各不同处理后成纤维细胞命运的主要调节因子，发明人进行了基因网络分 析，用T+E-、T+E+和T-E+1的基因谱处理了 mRNA序列深度测序分析T-E-基因谱后测定的基因 表达列表。在这些分析中，并基于互相关联的基因的下降或上升比显著的Log FC具有更重 要的意义这一假设，发明人使用仅基于其P值而不是基于其Log FC值而选择的基因列表。发 明人进行了两种分析:独创的"上游调节因子分析"和DI RE (http://dire.dcode.org/)分 析。给定两种条件之间的具体基因表达谱，独创的"上游调节因子分析"在于选择潜在的上 游调节因子。DIRE分析基于基因之间潜在的共同调节元件的选择，所述基因基于这些元件 在进化期间的保守性。从这些鉴定的元件，DIRE能够为一系列共调苄基因提供主要调节因 子的列表。对于所分析的各个列表，发明人从这两个分析选择在关注的列表中考虑的两种 条件的至少一种中表达（即在两种条件的至少一种中测序数超过20)的转录因子(TF) 13S 后，发明人将两组分析深入比较，决定在"关键调节因子列表"中保留属于两个分析的转录 因子。由于这两个分析的可能偏差，发明人还决定拯救只属于一个分析而不属于另一个，但 在一个列表或另一个中呈现非常有趣的靶基因模式的转录因子。总之，这些基因网络分析 允许提出在一个或另一个成纤维细胞命运中是关键条件因子的TF列表。
[0155] 对于慢性或非愈合性伤口模型，在细胞培养物中添加慢性伤口渗出物(渗出物中 总蛋白为500yg/mL)。如图la)所示进行实验：不处理细胞(T-E-)、仅用TGFP处理(T+E-)、仅 用渗出物处理(T-E+)或用TGF-β和渗出物处理(T+E+) 4天。用之前所述的这些分析来评估分 化水平。慢性伤口渗出物降低a SM (mRNA，图I b)的表达。这表明慢性伤口渗出物明确地抑制 成纤维细胞分化。这与在慢性伤口中存在非功能性成纤维细胞(也叫假衰老成纤维细胞)这 一事实有关。
[0156] 成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的基因表达途径
[0157] 在正常和病理条件下，人原发性成纤维细胞的成纤维细胞分化中涉及的主要分子 靶标的鉴定
[0158] 发明人进行了计算机模拟的基因网络分析来发现之前定义的不同基因表达途径 的假定的上游调节因子。该方法是原创的，因为发明人使用全球基因网络分析来鉴定潜在 关键调节因子，且发明人没有考虑这些因子表达的变化来选择它们。例如，发明人使用DIRE 程序(http://dire, dcode.org/)来鉴定不同基因列表中进化保守的潜在调节元件，这允许 发现能够潜在地结合这些元件并因此调节这些基因组的转录因子。从该分析中选择出23个 转录因子。
[0159] 为优先考虑不同转录因子(TF)的深入研究，发明人在不同成纤维细胞处理后进行 了 TF的时间响应研究。发明人在不同处理后对它们的表达变化进行了短期（30分钟到8小 时)和长期(8小时到96小时)分析。
[0160] 发明人进行了详尽的基于SiRNA的方法，一方面研究这些不同因子在正常的成纤 维细胞分化成肌成纤维细胞的通路中的作用，另一方面研究其在慢性渗出物依赖性的非分 化细胞命运中的作用。
[0161] 如通过分析TGFI3-和siRNA处理的NHDF的aSMA表达所评估，14个在此鉴定的潜在关 键转录因子的siRNA敲除抑制了成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的通路:GLII、HIC1、TCF4、 S0X9、STAT4、MYC、CREB5、IRF7、JUN、E2FI、EGR2、SRF、SMAD3、FOXSI，因为它们的敲除不同程 度上抑制了肌成纤维细胞分化（图2a-b)。非常有趣的是，除了在TGFP处理时表达强烈并快 速上调的S0X9、F0XS1和EGR2,其他因子的mRNA水平在第一天期间或在TGFI3处理后是恒定 的，并在4天的分化中大致不变（图3)。这表明维持它们的表达而不是它们的过表达对于成 纤维细胞分化成肌成纤维细胞是必要的。
[0162] 通过计算机模拟分析鉴定的四个其他的潜在关键转录因子(MAF、SIX2、ME0X2和 PPARG)的siRNA敲除似乎在缺少TGFP时，以与用TGFP处理的模拟转染细胞所得的相同程度 诱导成纤维细胞分化成肌成纤维细胞。甚至更有趣的是，肌成纤维细胞分化的诱导即使在 慢性伤口渗出物存在下也是真实的，并且与仅存在TG邱的模拟转染细胞中所得的分化非常 相似。缺少这些因子时，成纤维细胞似乎能够绕开渗出物主导的作用从而分化成肌成纤维 细胞。发明人还可以发现，除FOXSl之外，所有这些因子在TGFP处理时稍微过强地下调（图 5)，支持它们的下调对于分化可能是必需的。
[0163] 总之，这些结果表明用敲除方法，发明人能够降低成纤维细胞至肌成纤维细胞的 分化或诱导该分化，即使是在慢性伤口的情况下(表1)。
[0164] 计算机模拟的基因网络分析允许鉴定在分化成肌成纤维细胞期间或在慢性伤口 的情况下成纤维细胞命运的潜在关键调节因子。通过敲除方法，发明人发现19个因子对分 化有强烈作用。我们的分析的优势来自在不同基因列表中寻找进化保守的共同DNA元件的 非偏差的方法(通过DIRE程序），并从这里开始鉴定假定的上游转录调节因子，而不是看转 录因子表达水平的差异。通过只看它们的差异表达，发明人很可能遗漏那些细胞命运的调 节因子。
[0165] 通过敲除的方法，我们鉴定了正常成纤维细胞分化成肌成纤维细胞所需的转录因 子(图2)。发明人使用aSM来追踪肌成纤维细胞的分化，因为这是它们最好的离体标志物。
[0166] 发明人还鉴定了似乎起作用但不如以上段落所述的那些强烈的因子，因为它们的 敲除导致aSMA表达持续但微弱的降低。这些因子是1^(：、11^42?1、11^7和0^85。
[0167] 非常有趣的是，发明人表明，某些转录因子的失活导致成纤维细胞分化本身的增 加。某些这些因子的失活甚至能够在慢性伤口的情况下增加成纤维细胞分化为肌成纤维细 胞。
[0168] 甚至在慢性渗出物存在下，PPARG mRNA的敲除导致增加的成纤维细胞分化成肌成 纤维细胞(图2c_d)。
[0169] FOXSl属于通常涉及发育过程例如形态发生和分化的叉头转录因子家族。已经表 明，FOXSl在睾丸血管发育中具有重要作用。此外，FOXSl被描述为早期的感觉神经标志物。 在此，发明人表明，FOXSl的失活在缺少TGFP的情况下增加肌成纤维细胞分化。
[0170] 已经描述ME0X2涉及TGFP通路，因为它在TGFK敲除小鼠中被鉴定为腭裂发育的重 要因子。C2C12成肌细胞实验表明，ME0X2对于骨骼肌发育和分化同样重要。在此，发明人表 明，针对ME0X2的siRNA导致成纤维细胞能够绕开渗出物的作用以能够分化成肌成纤维细 胞。
[0171] 在T细胞中，已经表明MAF通过中和TGF0负责抑制IL22表达。TGF0和MAF在CD4( + )T 细胞中对IL21表达具有拮抗/相反的作用。在同一意义上，在本研究中，发明人表明MAF是在 不存在或存在渗出物的情况下，成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的抑制剂，因为通过siRNA 使其失活导致肌成纤维细胞分化增加（图2c_d)。相反，在软骨细胞分化中，长的MAF形式与 S0X9相互作用并合作以激活下游靶标。这是肌成纤维细胞和软骨细胞分化之间的差异的另 一个实例。
[0172] SIX2已经在肾中涉及维持多能性:在胚胎性肾间质细胞中它能够抑制分化，并且 在肾发育期间，它维持祖细胞池。在此，在真皮成纤维细胞中，SIX2的失活导致绕开渗出物 对TGFP信号的主要作用（图2c-d)。
[0173] 成纤维细胞分化成肌成纤维细胞期间关键转录因子之间的调控的相互作用
[0174] 在S0X9、EGR2或FOXSl敲除后TCF4 mRNA的表达没有变化（图6)，将其置于这些因子 之间的调控相互作用网络的顶端。相反，EGR2的表达在针对TCF4和S0X9的s iRNA处理时被明 显抑制，但在针对FOXSl的处理时保持不变（图6)，将其置于网络中TCF4和S0X9之后但在 FOXSl之前。S0X9 mRNA在TCF4和FOXSl敲除时基本上保持不变。发明人将F0XSHtSS0X^9 下游靶标。相反，EGR2敲除时S0X9上调（图6)。STAT4 mRNA在TCF4、S0X9和EGR2敲除时被下调 (图6)，使其成为这些TF的下游靶标，但在FOXSl siRNA处理时保持不变，使其在FOXSl之前。 与此一致，FOXSl mRNA在TCF4、S0X9和EGR2 siRNA处理时被下调（图6)，使其成为这一连串 的末端。总体上，PPARG、MAF和ME0X2 mRNA在针对TCF4、S0X9、EGR2和FOXSl的siRNA处理时被 下调（图6)，这与其在成纤维细胞分化中作为拮抗剂的作用一致。SIX2 mRNA水平在EGR2和 FOXSl敲除时不变（图6)，但在TCF4和S0X9敲除时被上调，这与这两个TF之间的紧密相互作 用一致，表明分化激动剂S0X9和TCF4与拮抗剂SIX2之间存在信号平衡。
[0175] 能够绕开慢性伤口渗出物作用的转录因子的鉴定在慢性伤口领域非常重要，因为 它提供能够用于治疗慢性伤口例如下肢溃疡的新靶标。在本研究中，通过聚焦成纤维细胞， 并不意味着发明人试图掩饰其他细胞例如中性细胞和巨噬细胞在皮肤愈合过程中的重要 性，而是发明人将生物情况简化以更清楚地描述这个情况。
[0176] 药物对成纤维细胞分化的作用
[0177] 发明人测试了几个浓度的药物以定义至少一个范围的最佳浓度来观察其对细胞 的作用:在不存在和存在TGFP情况下，对于某些药物，发明人期望观察到分化增加或分化抑 制。
[0178] 对于这些测试，发明人评估了存在或不存在渗出物的情况下不同基因的表达:α SMA、PI16(W02013/144348)和ACTC1(分化的标志物，在肌成纤维细胞中相对于成纤维细胞 上调）。
[0179] 曲美替尼
[0180]非常有趣的是，发明人可见，在1_4ηΜ曲美替尼存在下，在未处理的成纤维细胞中 观察到aSM基础水平的增加（图8a)。
[0181] 有趣的是，即使在渗出物存在下，曲美替尼能够增加 aSM肌成纤维细胞标志物，以 及PI16和ACTC1(在分化时表明被上调的另外2个基因）的表达（图％)。曲美替尼可能能够绕 开渗出物对分化的主导负面作用，因此具有重要的治疗兴趣。曲美替尼被描述为MAF拮抗基 因，因此这些结果与其中表明抑制MF表达能够引起分化的siRNA实验完全一致。
[0182] Am580
[0183] 5nM的Am580能够在TGF0存在下增加分化（图9&)<^111580能够增强了6邱对成纤维细 胞的作用，并增加分化，因为随后3个标志物在分化时上调(aSMA、PI16和ACTC1)。此外，在渗 出物存在下，Am580能够消除渗出物对分化的负面作用，如在其中向细胞添加 TGFP、渗出物 和Am580的条件下aSM和？116增加所示，这与不含細580的相同条件相反。
[0184] 已经表明，Am580对S0X9具有激动剂作用;这些结果证实siRNA实验，因为表明S0X9 的抑制(通过siRNA处理)导致分化的完全抑制。在此表明，用Sox9的激动剂处理细胞提供相 反的作用。
[0185] Gant61
[0186] 以4μΜ使用的Gant61能够增加分化，如aSMA的上调所示（图10)。出乎意料的， Gant61能够上调GLIl的表达，然而据报道，Gant61是GLIl抑制剂（Stanton,Benjamin Z.等， 2010.Small-molecule modulators of the Sonic Hedgehog signaling pathway .Molecular bioSysterns · 6( I): 44-54)。此外，Gant61诱导S0X9mRNA增加和MAF mRNA降低D
【主权项】
1. 用于治疗伤口，优选慢性伤口的治疗性化合物，包含： -抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因具有 至少50 %同一性的同源物，和/或 -增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、 1^(：、31^、3了六了4、1^4、？(^1、61^1、3(^9及其与所述基因具有至少50%同一性的同源物。2. 根据权利要求1所述的治疗性化合物，进一步包含： -抑制PPARG或与PPARG具有至少50 %同一性的同源物的活性的试剂，和/或 -增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂:SMAD3、SMAD4及其与所述基因具有至少 50%同一性的同源物。3. 根据权利要求1或2所述的治疗性化合物，其中所述试剂选自裸露的或是质粒和病毒 载体形式的反义DNA或RNA、s iRNA、shRNA、cDNA、TALENS或核酶。4. 根据权利要求1或2所述的治疗性化合物，其中所述试剂是蛋白功能的抑制剂或增强 剂。5. 根据权利要求4所述的治疗性化合物，其中所述试剂选自：可逆或不可逆结合以抑制 蛋白功能的结合剂，例如抗体或合成的拮抗剂，或在蛋白信号机制上游或下游起作用以抑 制蛋白功能的试剂。6. 根据权利要求4或5所述的治疗性化合物，其中所述试剂抑制MAF、MEOX2或SIX2的活 性，或其中所述试剂增强SOX9或GLI1的活性。7. 根据权利要求4、5或6所述的治疗性化合物，其中所述试剂选自MAF的拮抗剂和SOX9 或GLI1的激动剂。8. 根据权利要求4-7任一项所述的治疗性化合物，其中所述试剂选自曲美替尼、AM580 和Gant61。9. 根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中它用于治疗哺乳动物伤口。10. 根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中它用于治疗慢性伤口，例如静 脉溃疡、糖尿病溃疡或压疮。11. 根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中它用于治疗人的伤口。12. 根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中所述治疗性化合物用于局部 应用。13. 根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中所述治疗性化合物应用于医 疗设备或浸渍医疗设备。14. 药物组合物，包含根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物和药学上可接受 的载体。15. 制备根据权利要求13所述的药物组合物的方法，包括将所述治疗性化合物与药学 上或兽医上可接受的载体或介质联合或结合。16. 用于治疗哺乳动物伤口的方法，其中所述方法包括向所述伤口施用包含以下的治 疗性化合物： -抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、MEOX2、SIX2及其与所述基因具有 至少50 %同一性的同源物，和/或 -增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、 1^(：、31^、3了六了4、1^4、？(^1、61^1、3(^9及其与所述基因具有至少50%同一性的同源物。17. 用于治疗伤口，优选慢性伤口的试剂盒，其中所述试剂盒包括： (a) 至少一种根据权利要求1-13任一项所述的治疗性化合物或根据权利要求14所述的 药物组合物，和 (b) 至少一种用于向所述伤口施用的敷料。18. 用于治疗伤口，优选慢性伤口的联合治疗剂，包括： a) _抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、ME0X2、SIX2及其与所述基因具 有至少50 %同一性的同源物，和/或 -增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、 1^(：、31^、3了六了4、1^4、？(^1、61^1、3(^9及其与所述基因具有至少50%同一性的同源物;和 b) 至少一种进一步的治疗剂。19. 以下试剂用于治疗伤口的用途： -抑制至少一个选自以下的基因的活性的试剂:MAF、MEOX2、SIX2及其与所述基因具有 至少50 %同一性的同源物，和/或 -增强至少一个选自以下的基因的活性的试剂：CREB5、E2F1、EGR2、HIC1、IRF7、JUN、 1^(：、31^、3了六了4、1^4、？(^1、61^1、3(^9及其与所述基因具有至少50%同一性的同源物； 其中所述试剂调控成纤维细胞和肌成纤维细胞分化和/或活性。
【文档编号】C07K14/47GK105829338SQ201480043897
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年7月30日
【发明人】C·迪加-达尔扎克, M·努瓦泽, X·迪尔扎克, B·斯皮卢蒂尼埃贝尔
【申请人】优格创新与发展研究, 国家科学研究中心, 狄德罗-巴黎第七大学, 国家医疗保健研究所, 巴黎高等师范学院