获自功能型苹果的黄酮醇调控蛋白MsMYB22及其编码基因和应用
【专利摘要】本发明公开了一种获自功能型苹果的黄酮醇调控蛋白MsMYB22及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，获自苹果，命名为MsMYB22蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物黄酮醇类化合物含量相关的由序列1衍生的蛋白质。编码所述MsMYB22蛋白的基因(MsMYB22基因)也属于本发明的保护范围。本发明发现了MsMYB22蛋白及其功能，可用于培育黄酮醇类化合物含量改变的转基因植物，在植物育种中具有重大应用前景。
【专利说明】
获自功能型苹果的黄酮醇调控蛋白MsMYB22及其编码基因和 应用
技术领域
[00011本发明涉及一种获自功能型苹果的黄酮醇调控蛋白MsMYB22及其编码基因和应 用。
【背景技术】
[0002] "医食同源"是发展方向。苹果耐贮性好，供应周期长，是世界性果品，尤其果实含 有较高比例的、人体比较容易吸收的游离多酚，具有很好的抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管 疾病及保肝等作用，营养保健价值高，有"一天一苹果，医生远离我"（An apple a day keeps the doctor away!)的美誉，世界上相当多的国家都将其列为主要消费果品而大力 推荐。但近几年的调研结果表明，一方面，在过去几十年国内外育成的1000多个苹果品种， 80%是'金帅'等品种的杂交、实生或芽选后代，这种"近亲繁殖"往往带来品种的遗传基础 狭窄及抗逆性减退等问题;另一方面，特色、多抗和多样性果品成为产业发展的重要方向。 [0003] 新疆野苹果及其红肉变型（Malus sieversii f.neidzwetzkyana)是世界栽培苹 果的祖先种，不仅遗传多样性极为丰富，而且富含类黄酮等功能、保健成分，是进行抗逆与 品质育种的珍贵基因库。但因农田开垦等原因，新疆野苹果的遗传多样性正遭到严重破坏， 濒临灭绝;我国是世界上最大的苹果生产和消费国，其中2012年生产苹果3950万吨，主要用 于鲜食，且近70 %是类黄酮含量较低的富士品种。
[0004] 因此，围绕"新疆野苹果资源的科学保护与持续高效利用、栽培品种遗传基础拓 展、苹果产业转型升级与共给侧结构改革和农民持续增收以及人类健康水平提升"，进行联 合攻关与集成示范，本发明的发明人与美国康奈尔大学的教授合作，对新疆野苹果及欧洲 森林苹果等世界范围内的97份苹果资源进行了基因组重测序与生物信息学分析，构建了新 疆红肉苹果与苹果品种杂种一代及回交一、二代分离群体，研究明确了新疆野苹果群体遗 传结构与遗传多样性特征、核心种质构建的技术参数、类黄酮含量等性状的遗传变异特点 及发育机理，提出了"功能型苹果"的概念及"宽行高干、行间生草、给草施肥、肥田养根"的 现代果园管理理念，创建了常规杂交与生物技术有机结合的苹果高效育种技术体系，创制 了一批新品种及优异种质，研发了苹果新品种配套高效栽培技术体系。目前，已授权和申报 发明专利10余项，定植杂种实生苗4万余株，育成新品种（系）16个;发表相关研究论文120 篇，其中SCI论文20余篇，这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水平。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种获自功能型苹果的黄酮醇调控蛋白MsMYB22及其编码基 因和应用。
[0006] 本发明提供的蛋白质，获自苹果，命名为MsMYB22蛋白，是如下(al)或(a2):
[0007] (al)由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物黄酮醇类化合物含量相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0009] 为了使(a)中的MSMYB22蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基 酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1标签的序列 「00111
[0012] 上述(b)中的MSMYB22蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述(b)中的MsMYB22蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5' 端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0013] 编码所述MsMYB22蛋白的基因(MsMYB22基因）也属于本发明的保护范围。
[0014]所述基因为如下（1)或(2)或(3):
[0015] ⑴编码区序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码与植物黄酮醇类化合物含量相 关的蛋白质的DNA分子；
[0017] (3)与（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物黄酮醇类化合物含量 相关的蛋白质的DNA分子。
[0018] 上述严格条件可为用0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)，0.1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA杂 交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0019] 含有所述MSMYB22基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织 或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0020] 可用现有的植物表达载体构建含有MSMYB22基因的重组表达载体。所述植物表达 载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用MsMYB22基因构建重组表 达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启 动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用MsMYB22基因构建重组 表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列 的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合 成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植 物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变 化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转 基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。所述重组 表达载体的出发载体可为pRI 101载体。所述重组表达载体具体可为在pRI 101载体的Xma I 和EcoR頂每切位点之间插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒pRI 101 - MsMYB22〇
[0021] 所述植物组织具体可为植物愈伤组织，更具体可为植物胚性愈伤组织。所述植物 可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。所述蔷薇科植物具 体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为'紫红1号'苹果。
[0022] 本发明还保护所述MsMYB22蛋白的应用，为如下(bl)或(b2):
[0023] (bl)调控植物的黄酮醇类化合物含量；
[0024] (b2)增加植物的黄酮醇类化合物含量。
[0025] 所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。 所述蔷薇科植物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为'紫红1 号'苹果。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如AtMYB12/l 1/111突变体型拟南芥。
[0026]本发明还保护所述MsMYB22基因在培育黄酮醇类化合物含量增加的转基因植物中 的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。所 述蔷薇科植物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为'紫红1号' 苹果。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如AtMYB12/l 1/111突变体型拟南芥。
[0027]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将所述MsMYB22基因导 入出发植物，得到黄酮醇类化合物含量高于所述出发植物的转基因植物。所述双子叶植物 具体可为蔷薇科植物。所述蔷薇科植物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹 果，更具体可为'紫红1号'苹果。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如AtMYB12/ll/lll突 变体型拟南芥。所述MsMYB22基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植 物。所述方法中，具体可将所述MsMYB22基因导入出发植物的愈伤组织，然后将愈伤组织培 育为植株。所述愈伤组织具体可为胚性愈伤组织。携带有所述MsMYB22基因的重组表达载体 可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生 物学方法转化到植物细胞或组织中。
[0028]本发明还保护一种获得转基因植物组织的方法，包括如下步骤:将所述MsMYB22基 因导入出发植物组织，得到黄酮醇类化合物含量高于所述出发植物组织的转基因植物组 织。所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为蔷薇科植物。所 述蔷薇科植物具体可为苹果属植物。所述苹果属植物具体可为苹果，更具体可为'紫红1号' 苹果。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如AtMYB12/l 1/111突变体型拟南芥。所述 MsMYB22基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物组织。所述植物组 织具体可为植物愈伤组织。所述愈伤组织具体可为胚性愈伤组织。
[0029] 本发明还保护所述MsMYB22蛋白或所述所述MsMYB22基因或以上任一所述方法在 植物育种中的应用。所述植物育种的目的为培育黄酮醇类化合物含量增高的植物。
[0030] 以上任一所述黄酮醇类化合物为具有式(I)所示母环的化合物；
[0031]
[0032] 以上任一所述黄酮醇类化合物为式（Π )所示化合物；
[0033]
[0034] 办=!1、0!1或0013;
[0035] R2 = OH ；
[0036] R3 = H 或 OH;
[0037] R4=H或 OH。
[0038] R1=H，R2 = 0H，R3 = H，R4 = 0H 时为山奈酚；
[0039] R1 = OH，R2 = OH，R3 = Η，R4 = OH 时为槲皮素；
[0040] R1 = OH，R2 = OH，R3 = OH，R4 = OH时为杨梅酮；
[0041] ri=h，R2 = 0H，R3 = H，R4 = H 时为芹菜素；
[0042] R1=0H，R2 = 0H，R3 = H，R4 = H 时为木犀草素；
[0043] R1=0-CH3，R2 = 0H，R3 = H，R4 = 0H 时为异鼠李素。
[0044]本发明发现了MsMYB22蛋白及其功能，可用于培育黄酮醇类化合物含量改变的转 基因植物，在植物育种中具有重大应用前景。
【附图说明】
[0045] 图1为实施例3中定性鉴定的结果。
【具体实施方式】
[0046] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0047] pRIlOl 载体（又称"pRIHU-AN DNA"）：Takala 公司，Code No.3262。农杆菌 LBA4404:Tiangen公司，产品目录号：CC2901。农杆菌GV3101:Tiangen公司，产品目录号： GV3101。'紫红1号'苹果：参考文献《'紫红1号'红肉苹果果肉抗氧化性及花色苷分析》。 AtMYB12/l 1/111 突变体型拟南芥:NASC(http: //www · arabidopsis · info/)拟南芥突变体 库，Stock Code:N9815。
[0048] Τι代表不Το代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表不Τι代自交产生的种 子及由它所长成的植株。
[0049] 实施例l、MsMYB22蛋白及其编码基因的发现
[0050] 从"紫红1号"苹果中发现了一个新蛋白，如序列表的序列1所示，将其命名为 MsMYB22蛋白。将编码MsMYB22蛋白的基因命名为MsMYB22基因，其开放阅读框如序列表的序 列2所示。
[0051] GENBANK中，与序列1同源性最高的两个蛋白分别如序列表的序列3所示和序列表 的序列5所示。将序列表的序列3所示的蛋白质命名为蛋白甲，其编码基因命名为基因甲，如 序列表的序列4所不(本实施例的序列4中，k取g，m取a)。将序列表的序列5所不的蛋白质命 名为蛋白乙，其编码基因命名为基因乙，如序列表的序列6所示。
[0052] 实施例2、MsMYB22蛋白的功能鉴定
[0053] 一、构建重组质粒
[0054] 将人工合成的序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pRIlOl载体的Xma I和EcoR 頂每切位点之间，得到重组质粒pRIl〇l_MsMYB22。
[0055] 将人工合成的序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pRI 101载体的Xma I和EcoR 頂每切位点之间，得到重组质粒甲。
[0056] 将人工合成的序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pRI 101载体的Xma I和EcoR 頂每切位点之间，得到重组质粒乙。
[0057]二、转基因组织的获得
[0058] 1、将重组质粒pRI101-MsMYB22导入农杆菌LBA4404,得到重组农杆菌。
[0059] 2、取步骤1得到的重组农杆菌菌体，用30ml MS液体培养基悬浮，得到0D6QQnm = 0.8 的菌悬液，加入30yL乙酰丁香酮，得到侵染液。
[0060] 3、取'紫红1号'苹果的胚性愈伤组织，接种至MS固体培养基上，25°C培养15天。
[0061] 4、完成步骤3后，取愈伤组织，浸没于步骤2得到的侵染液中，160rpm室温振荡15- 20min，然后用灭菌滤纸吸干表面。
[0062] 5、完成步骤4后，取愈伤组织，置于共培养培养基(含lmg/L 6-BA和0.3mg/L NAA的 MS固体培养基)上，25°C黑暗培养36小时。
[0063] 6、完成步骤5后，取愈伤组织，置于筛选培养基(含50mg/L卡那霉素、250mg/L羧卞 青霉素、lmg/L 6-BA和0.3mg/L NAA的MS固体培养基)上，25°C光照培养30-40天。
[0064] 7、完成步骤6后，取可以在筛选培养基上生长的抗性愈伤组织，进行PCR鉴定。
[0065] PCR鉴定所用的引物对如下：
[0066] 35s-F:5 '-GACGCACAATCCCACTATCC-3 '；
[0067] MYB22-R:5 '-AGATAGAAGCCAAGCCAC-3 '；
[0068] 35s-F对应于载体骨架上的35S启动子中的区段，MYB22-R对应于MsMYB22基因中的 区段，靶序列长度约为1500bp。
[0069] 8、将步骤7得到的转MsMYB22基因愈伤组织接种至筛选培养基（含50mg/L卡那霉 素、250mg/L羧卞青霉素、lmg/L 6-BA和0.3mg/L NAA的MS固体培养基)上进行继代培养。
[0070] 三、对照组织的获得
[0071] 将重组质粒甲代替重组质粒PRI101-MSMYB22进行步骤二，得到转基因甲愈伤组 织。
[0072] 将重组质粒乙代替重组质粒pRI101-MsMYB22进行步骤二，得到转基因乙愈伤组 织。
[0073] 将pRIlOl载体代替重组质粒pRI101-MsMYB22进行步骤二，得到转空载体愈伤组 织。
[0074]四、组织的鉴定
[0075] 待测愈伤组织分别为:转MsMYB22基因愈伤组织、转基因甲愈伤组织、转基因乙愈 伤组织、转空载体愈伤组织和哥伦比亚生态型拟南芥愈伤组织。
[0076]按照如下步骤进行操作：
[0077] 1、取lg待测愈伤组织，液氮研磨后转移至10ml预冷的65% (体积百分含量）乙醇水 溶液中，4 °C避光浸提4h，然后12000g离心20min，收集上清液。
[0078] 2、取0.5ml步骤1得到的上清液于试管中，依次加入lmL 5g/100ml NaN02水溶液、 lml 10g/100ml A1(N03)3水溶液和4mL 2mol/L NaOH水溶液，静置 15min。空白对照以80% (体积百分含量)乙醇水溶液代替所述上清液。
[0079] 3、完成步骤2后，在510nm下测定吸光值。
[0080] 以芦丁(rutin,Sigma chemical，ST)为标样，做标准曲线，标准曲线方程如下:y = 0 · 091 x+0 · 004，R2 = 0 · 999 (y:吸光值;X:黄酮醇类化合物的浓度，单位为mg/g。
[0081] 将吸光度带入标准曲线方程，从而计算待测种子中的黄酮醇类化合物含量。
[0082] 进行五次重复试验，每次重复试验中取10份待测愈伤组织的平均值。
[0083]转MsMYB22基因愈伤组织的黄酮醇类化合物含量为1271.73mg/kg。转基因甲愈伤 组织的黄酮醇类化合物含量为726.25mg/kg。转基因乙愈伤组织的黄酮醇类化合物含量为 814.11mg/kg。转空载体愈伤组织的黄酮醇类化合物含量为454.21mg/kg。哥伦比亚生态型 拟南芥愈伤组织的黄酮醇类化合物含量为453.75mg/kg。本段中的"kg"指的均为愈伤组织 鲜重。
[0084] 实施例3、MsMYB22蛋白的功能鉴定
[0085] 一、构建重组质粒
[0086] 将人工合成的序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pRIlOl载体的Xma I和EcoR 頂每切位点之间，得到重组质粒pRIl〇l_MsMYB22。
[0087] 将人工合成的序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pRI 101载体的Xma I和EcoR 頂每切位点之间，得到重组质粒甲。
[0088] 将人工合成的序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pRI 101载体的Xma I和EcoR 頂每切位点之间，得到重组质粒乙。
[0089]二、转基因植株的获得
[0090] 1、将重组质粒pRI101-MsMYB22导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
[0091] 2、取步骤1得到的重组农杆菌菌体，用侵染液(含5g/100ml蔗糖和体积百分含量为 0 · 05%的Silwet L-77的水溶液)悬浮，得到pH5 · 8、0D_r?=0 · 8的菌悬液。
[0092] 3、在温室内进行(培养条件：25°C、16小时光照/8小时黑暗，光照时的光强为120- 150μπι〇1 πΓ?培养AtMYB12/ll/lll突变体型拟南芥，花序抽苔约lcm时将主花序的顶端 剪掉（以诱导侧花序的生成），继续培养至侧花序生长至花蕾期。
[0093] 4、完成步骤3后，取植株，将花序完全浸入步骤2得到的菌悬液中，采用花芽浸泡法 (Clough and Bent,Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journall998，16:735-743·)将重重组 质粒pRI101-MsMYB22导入AtMYB12/ll/lll突变体型拟南芥，收获To代种子。
[0094] 5、将To代种子播种于含lOOmg/l卡那霉素的MS固体培养基平板上，进行筛选，对于 生长状态良好的植株取叶片进行PCR鉴定并收集1^代种子。
[0095] PCR鉴定所用的引物对如下：
[0096] 35s-F:5 '-GACGCACAATCCCACTATCC-3 '；
[0097] MYB22-R:5 '-AGATAGAAGCCAAGCCAC-3 ' 〇
[0098] 35s-F对应于载体骨架上的35S启动子中的区段，MYB22-R对应于MsMYB22基因中的 区段，靶序列长度约为1500bp。
[0099] 6、将1^代种子播种于含lOOmg/l卡那霉素的MS固体培养基平板上，进行筛选，对于 生长状态良好的植株取叶片进行PCR鉴定并收集1~2代种子。PCR鉴定方法同步骤5。
[0100] 7、将^代种子播种于含lOOmg/l卡那霉素的MS固体培养基平板上，进行筛选，对于 生长状态良好的植株取叶片进行PCR鉴定。PCR鉴定方法同步骤5。
[0101] 对于某一1^代植株来说，如果该植株及其自交得到的1~2代植株均为卡那霉素抗性 植株且PCR鉴定为阳性，该植株及其自交后代为一个纯合的转MsMYB22基因株系。
[0102] 三、对照植株的获得
[0103] 将重组质粒甲代替重组质粒PRI101-MSMYB22进行步骤二，得到纯合的转基因甲株 系。
[0104] 将重组质粒乙代替重组质粒PRI101-MSMYB22进行步骤二，得到纯合的转基因乙株 系。
[0105] 将PRI101载体代替重组质粒PRI101-MSMYB22进行步骤二，得到纯合的转空载体株 系。
[0106] 四、植株的鉴定
[0107] 1、定性鉴定(DPBA染色法鉴定黄酮醇的合成）
[0108] DPBA染色法原理:对-二苯氨基苯基硼酸(DTOA)能够与黄酮醇类化合物显色生成 黄色，其颜色与浓度呈正向关系；参考文献：《Flavonoid-specific staining of Arabidopsis thaliana〉〉。
[0109] 待测种子分别为：纯合转MSMYB22基因株系的T2代种子、纯合的转基因甲株系的T2代种子、纯合的转基因乙株系的τ2代种子、纯合转空载体株系的1~2代种子和AtMYB12/ll/lll 突变体拟南芥的种子。
[0110] 按照如下步骤进行操作：
[0111] (1)取待测种子，进行表面消毒后置于3mg/ml达草灭浸湿的滤纸上4°C保存2天。
[0112] (2)完成步骤(1)后将种子转移到24°C光照培养箱，培养5天(种子萌发）。
[0113] (3)完成步骤(2)后，将萌发的幼苗浸没于含0.25g/100ml DPBA和0.00375% (体积 百分含量)Triton X-100的水溶液中，染色1.5小时。
[0114] (4)完成步骤(3)后，在显微镜紫外激发光下观察表型。
[0115] 照片见图1。转MsMYB22基因株系幼苗中有黄色，证明积累了黄酮醇类化合物，而 AtMYB12/ll/lll突变体幼苗中为蓝色，没有黄酮醇类化合物积累。结果表明，MsMYB22蛋白 能调控黄酮醇类化合物的合成。
[0116] 2、定量鉴定
[0117] 待测幼苗分别为：纯合转MsMYB22基因株系的T2代幼苗、纯合的转基因甲株系的T2代幼苗、纯合的转基因乙株系的τ2代幼苗、纯合转空载体株系的1~2代幼苗和AtMYB12/ll/lll 突变体拟南芥的幼苗。待测幼苗为萌发15天后的幼苗。
[0118] 按照如下步骤进行操作：
[0119] 1、取lg待测幼苗，液氮研磨后转移至10ml预冷的65% (体积百分含量）乙醇水溶液 中，4 °C避光浸提4h，然后12000g离心20min，收集上清液。
[0120] 2、取0.5ml步骤1得到的上清液于试管中，依次加入lmL 5g/100ml NaN02水溶液、 lml 10g/100ml Α1(Ν〇3)3水溶液和4mL 2mol/L NaOH水溶液，静置 15min。
[0121] 3、完成步骤2后，在51 Onm下测定吸光值(空白对照以80 %乙醇代替上清液）。
[0122] 以芦丁(rutin,Sigma chemical，ST)为标样，做标准曲线，标准曲线方程如下:y = 0.091 x+0.004，R2 = 0.999 (y:吸光值;X:黄酮醇浓度，单位为mg/g)。
[0123] 将吸光度带入标准曲线方程，从而计算待测幼苗中的黄酮醇类化合物含量。
[0124] 进行五次重复试验，每次重复试验中取10株待测幼苗的平均值。
[0125] 转MsMYB22基因株系的T2代幼苗的黄酮醇类化合物含量为52.362mg/kg。纯合转基 因甲株系的T2代幼苗的黄酮醇类化合物含量为31.528mg/kg。纯合转基因乙株系的T2代幼苗 的黄酮醇类化合物含量为28.415mg/kg。纯合转空载体株系的Τ2代幼苗的黄酮醇类化合物 含量为3.675mg/kg。哥伦比亚生态型拟南芥幼苗的黄酮醇类化合物含量为3.751mg/kg。本 段中的"kg"指的均为幼苗鲜重。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下(al)或(a2): (al)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物黄酮醇类化合物含量相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白质的基因。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因为如下（1)或(2)或(3): (1) 编码区如序列表中序列2所示的DNA分子； (2) 在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码与植物黄酮醇类化合物含量相关的 蛋白质的DNA分子； (3) 与（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物黄酮醇类化合物含量相关 的蛋白质的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组 织或重组菌。5. 权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(bl)或(b2): (bl)调控植物的黄酮醇类化合物含量； (b2)增加植物的黄酮醇类化合物含量。6. 权利要求2或3所述基因在培育黄酮醇类化合物含量增加的转基因植物中的应用。7. -种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将权利要求2或3所述基因导入出发植 物，得到黄酮醇类化合物含量高于所述出发植物的转基因植物。8. -种培育转基因植物组织的方法，包括如下步骤:将权利要求2或3所述基因导入出 发植物组织，得到黄酮醇类化合物含量高于所述出发植物组织的转基因植物组织。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物组织为植物愈伤组织。10. 权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因，或，权利要求7或8或9所述方 法，在植物育种中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK105837671SQ201610301361
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】王楠, 陈学森, 姜生辉, 许海峰, 王意程, 毛志泉, 姜远茂
【申请人】山东农业大学