抗逆相关蛋白RtHKT1及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了抗逆相关蛋白RtHKT1及其编码基因与应用。本发明所提供的抗逆相关蛋白RtHKT1，为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，蛋白质RtHKT1可使酵母的抗逆性增强和/或钠吸收量增加和/或钾吸收量增加和/或转运钠离子能力增加和/或转运钾离子能力增加和/或钠钾离子比减小和/或耐低钾性增强，对培育抗逆优良的作物具有重要的理论意义和实用价值。
【专利说明】
抗逆相关蛋白RtHKTI及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗逆相关蛋白RtHKTI及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 土壤盐碱化已成为影响农业生产的严重问题，利用基因工程手段改良作物的耐盐 碱能力，提高农作物和经济作物对逆境的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题和重 大问题。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度对植物响应盐碱等逆 境胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子生物学的发展，人们能 够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对盐胁迫的耐逆性机理，为利 用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采 用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，基因工程手段开 辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因 素。
[0003] 珍稀泌盐植物长叶红砂（Reaumur i a t r i gy na Max im .)隶属于柽柳科 (丁311^1'；^3〇636)琵琶柴属(1^3111]1111^3 1^1111.)，又名黄花红砂、黄花琵琶柴，为古地中海子 遗植物，被学术界称为"活化石"，为亚洲中部亚区东阿拉善-西鄂尔多斯特有种，被列为内 蒙古自治区珍稀濒危物种，是荒漠草原和干草原地区的重要生态屏障和良好草场，对盐渍 荒漠环境具有极强适应性，在改良盐碱地、防风固沙等方面发挥重要作用。该植物作为一种 特有的泌盐盐生植物，其盐腺分泌离子具有明显的选择性，且具有极强的耐盐性。因此对该 植物的耐盐分子机理研究，发现特有耐盐调控因子，并系统挖掘耐盐相关基因用于培育抗 逆优良作物具有重要的理论意义和实用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何提高抗逆性。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了 一种蛋白质。
[0000]本发明所提供的蛋白质，名称为蛋白质RtHKTI，来源于长叶红砂（Reaumuria trigyna Maxim.)。所述蛋白质RtHKTI可为如下al)或a2)或a3):
[0007] al)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质；
[0008] a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0009] a3)将al)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0010]其中，序列表中序列2由619个氨基酸残基组成。
[0011] 为了使a 1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或 羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0012] 表1标签的序列
[0013]
[0014] 上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为 不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0016] 上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5'末端起第64至1923 位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的 错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0017] 编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0018]所述编码蛋白质RtHKTl的核酸分子，具体可为如下(bl)或(b2)或(b3)或(b4)所示 的DNA分子：
[0019] (bl)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] (b2)编码区如序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子；
[0021] (b3)与(bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述蛋 白质RtHKTl的DNA分子；
[0022] (b4)在严格条件下与（bl)或（b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质 RtHKTl 的 DNA 分子。
[0023] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0024]其中，序列表中序列1由1941个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表 中序列2所示的氨基酸序列。
[0025] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码所述蛋白质RtHKTl的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有 与本发明分离得到的所述蛋白质RtHKTl的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要 编码所述蛋白质RtHKTl，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0026] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高， 或80 %或更高，或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性 可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以 用百分比（％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0027]含有编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基 因细胞系也属于本发明的保护范围。
[0028]所述含有编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克 隆位点插入序列表的序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子得到的重组质粒。 [0029] 所述表达载体具体可为载体pYES2.0/ΝΤ。
[0030]所述含有编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子的重组载体具体可为在载体 PYES2 . Ο/NT的ΚρηI识别位点和XbaI识别位点之间插入序列表的序列1自5 '末端起第64至 1923位所示的DNA分子得到的重组质粒pYES2. Ο-RtHKTl。
[0031]所述含有编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子的重组微生物可为将上述任一所述 含有编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
[0032]所述含有编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子的重组微生物具体可为将所述重组 质粒PYES2. Ο-RtHKTl导入出发微生物得到的重组菌。
[0033]所述出发微生物可为酵母。
[0034] 所述酵母具体可为酵母突变体AXT3。
[0035]所述转基因细胞系不包括繁殖材料。
[0036]所述蛋白质RtHKTl、编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子或含有编码所述蛋白质 RtHKTl的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在dl)和/或d2)和/或 d3)和/或d4)和/或d5)中的应用也属于本发明的保护范围；
[0037] dl)调控抗逆性；
[0038] d2)调控钠吸收量和/或钾吸收量；
[0039] d3)转运钠离子和/或钾离子；
[0040] d4)调控钠钾离子比；
[0041 ] d5)调控耐低钾性。
[0042] 所述dl)中，所述调控抗逆性可为dla)或dlb):
[0043] dla)调控植物的抗逆性；
[0044] dlb)调控酵母的抗逆性。
[0045] 所述d2)中，所述调控钠吸收量和/或钾吸收量可为d2a)或d2b):
[0046] d2a)调控植物的钠吸收量和/或钾吸收量；
[0047] d2b)调控酵母的钠吸收量和/或钾吸收量。
[0048] 所述d3)中，所述转运钠离子和/或钾离子可为d3a)或d3b):
[0049] d3a)转运植物的钠离子和/或钾离子；
[0050] d3b)转运酵母的钠离子和/或钾离子。
[0051 ] 所述d4)中，所述调控钠钾离子比可为d4a)或d4b):
[0052] d4a)调控植物的钠钾离子比；
[0053] d4b)调控酵母的钠钾离子比。
[0054] 所述d5)中，所述调控耐低钾性可为d5a)或d5b):
[0055] d5a)调控植物的耐低钾性；
[0056] d5b)调控酵母的耐低钾性。
[0057] 上述应用中，所述酵母具体可为酵母突变体AXT3。
[0058]所述蛋白质RtHKTl、编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子或含有编码所述蛋白质 RtHKTl的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗逆性增强 和/或钠吸收量增加和/或钾吸收量增加和/或转运钠离子能力增加和/或转运钾离子能力 增加和/或钠钾离子比减小和/或耐低钾性增强的转基因酵母中的应用也属于本发明的保 护范围。
[0059] 上述应用中，所述抗逆性可为抗盐性。
[0060] 上述应用中，所述耐低钾性指的是在低钾环境中的抗性增强，所述低钾环境具体 为ImM K+以下的生长环境(如100μΜ K+的生长环境或ImM K+的生长环境）。
[0061 ]上述应用中，所述钠吸收量可为细胞质的钠吸收量和/或液泡的钠吸收量和/或总 钠吸收量。所述钾吸收量可为细胞质的钾吸收量和/或液泡的钾吸收量和/或总钾吸收量。 所述钠钾离子比可为细胞质的钠钾离子比和/或液泡的钠钾离子比和/或总钠钾离子比。
[0062] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因酵母的方法。
[0063] 本发明所提供的培育转基因酵母的方法，可包括向受体酵母中导入编码所述蛋白 质RtHKTl的核酸分子，得到转基因酵母的步骤;与所述受体酵母相比，所述转基因酵母的抗 逆性增强和/或钠吸收量增加和/或钾吸收量增加和/或转运钠离子能力增加和/或转运钾 离子能力增加和/或钠钾离子比减小和/或耐低钾性增强。
[0064]上述方法中，所述编码所述蛋白质RtHKTl的核酸分子可为如下(bl)或(b2)或(b3) 或(b4)所示的DNA分子：
[0065] (bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0066] (b2)编码区如序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子；
[0067] (b3)与(bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述蛋 白质RtHKTl的DNA分子；
[0068] (b4)在严格条件下与（bl)或（b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质 RtHKTl 的 DNA 分子。
[0069] 上述方法中，所述受体酵母可为酵母突变体AXT3。
[0070] 上述方法中，所述抗逆性可为抗盐性。
[0071] 上述方法中，所述耐低钾性指的是在低钾环境中的抗性增强，所述低钾环境具体 为ImM K+以下的生长环境(如100μΜ K+的生长环境或ImM K+的生长环境）。
[0072] 上述方法中，所述钠吸收量可为细胞质的钠吸收量和/或液泡的钠吸收量和/或总 钠吸收量。所述钾吸收量可为细胞质的钾吸收量和/或液泡的钾吸收量和/或总钾吸收量。 所述钠钾离子比可为细胞质的钠钾离子比和/或液泡的钠钾离子比和/或总钠钾离子比。 [0073]实验证明，本发明所提供的蛋白质RtHKTl可使酵母的抗逆性增强和/或钠吸收量 增加和/或钾吸收量增加和/或转运钠离子能力增加和/或转运钾离子能力增加和/或钠钾 离子比减小和/或耐低钾性增强。因此，本发明所提供的蛋白质RtHKTl对培育抗逆优良的作 物具有重要的理论意义和实用价值。
【附图说明】
[0074] 图1为重组质粒pUC18-RtHKTl:GFP的元件示意图。
[0075]图2为RtHKTl基因亚细胞定位分析结果。
[0076]图3为RtHKTl基因的表达模式。
[0077] 图4为RtHKTl基因的表达模式。
[0078] 图5为重组质粒pYES2. Ο-RtHKTl的元件示意图。
[0079]图6转RtHKTl基因酵母的抗逆性鉴定。
[0080]图7转RtHKTl基因酵母的抗逆性鉴定。
[0081 ]图8转RtHKTl基因酵母的钠离子和钾离子的含量测定结果。
【具体实施方式】
[0082]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0083]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0084] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0085] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0086] 载体pUC18_35Sp_GFP记载于如下文献中：Chiu W，Niwa Y，Zeng W，Hirano T， KobayashiH,Sheen J.Engineered GFP as a vital reporter in plants[J].Current Biology Cb,1996,6(3):325-330.
[0087] 载体pYES2.0/NT(Mishra S，Alavilli H，Lee B，et al .Cloning and functional characterization of a vacuolar Na./H+antiporter gene from mungbean(VrNHXl)and its ectopic expression enhanced salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J] ? PloS 〇1^，2014,9(10):6106678.)为11^1钍(^611公司产品。
[0088] 酵母突变体AXT3记载于如下文献中：李平.大车前（Plantago major L. "Giant Turkish.")体外优化再生体系的建立及Na+/H+逆向转运蛋白基因 SeNHXl和TtNHXl的功能鉴 定[D].中国科学院植物研究所硕士学位论文，2005.
[0089] RNA Plant Plus Regen Kit为TaKaRa公司产品。M-MLV reverse transcriptase Kit为Invitrogen公司产品。pEASY-Tl载体为北京全式金生物技术有限公司产品，产品目录 号为CT101-0UTranstartR Green qPCR SuperMix为北京全式金生物技术有限公司产品目 录号为AQ141-02的试剂盒中的组件。单链鲑鱼精DNA为阿拉丁公司产品，产品编号为 D119875。
[0090] 光暗交替培养即光培养和暗培养交替，光暗交替培养的周期具体可为：16小时光 照培养/8小时黑暗培养。
[0091] Drop-Out液体培养基:将酵母氮源6.67g、右旋葡萄糖20g和氨基酸混合物1.03g溶 于1L蒸馏水，调节pH值为5.8,121°C灭菌15min。酵母氮源为Solarbio公司产品，产品目录号 为Y8040。氨基酸混合物的组成如表2所示。
[0092] 表2 10150mg的氨基酸混合物的组分
[0093]
[0094]
[0095] Urop-Uut回怀?首乔S:NL)rop-Uuty仪怀?首养基加入琼脂粉，至其浓度为15g/L，得 到的培养基。
[0096] Yro液体培养基:将酵母提取物10g、胰蛋白胨20g和右旋葡萄糖20g溶于1L蒸馏水， 调节pH值为5.7，121°C灭菌15min。
[0097] MS液体培养基:将MS母液粉4.33g、蔗糖20g和吗啉乙磺酸0.5g溶于1L蒸馏水，调节 pH值为5 · 75，121 °C灭菌ISmiruMS母液粉为PhytoTechnology Laboratories公司产品，产品 目录号为M524。
[0098] MS固体培养基：向MS液体培养基加入琼脂粉，至其浓度为6.5g/L，得到的培养基。
[0099] 缺钾的MS液体培养基：将NH4NO3 1650mg、MgS〇4 · 7H20 370mg、NH4H2P〇4 143.75mg、 CaCl2*2H2〇 440mg、MnS〇4*4H20 22.30mg、ZnS〇4*7H20 8.60mg、H3B03 6.20mg、NaI 0.75mg、Na2Mo〇4 · 2H20 0.25mg、CuS〇4 · 5H20 0.025mg、CoCl2 · 6H2O 0.025mg、FeS〇4 · 7H20 27·85mg、Na2EDTA37·25mg、肌醇100·00mg、VBl0·4mg、VB6 0·5mg、烟酸0·5mg、甘氨酸2·0mg 和鹿糖30g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8。
[0100] 实施例1、高亲和性钾离子转运蛋白RtHKTi的编码基因的克隆
[0101] 本发明的
【申请人】从长叶红砂(Reaumuria trigyna Maxim.)中克隆出高亲和性钾 离子转运蛋白RtHKTi的编码基因，即RtHKTi基因。
[0102] 一、RtHKTi基因的cDNA全长序列的克隆
[0103] 1、采用RNA Plant Plus Regen Kit提取生长至40天的长叶红砂幼苗的总RNA，然 后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反转录出第一链cDNA。
[0104] 2、人工合成引物RtHKTl-2F: 5 ' -ACTTCTTAGTCTGTACATTTGGT-3 '（序列表中序列 1 自 5 ' 末端起第 1 至23位)和引物RtHKT 1-2R: 5 ' -CCACTGGCACGTGAACAATTAG-3 '（序列表中序列 1 自5'末端起第1920至1941位的反向互补序列）。
[0105] 3、完成步骤1和2后，以步骤1提取的cDNA为模板，以步骤2合成的引物RtHKTl-2F和 弓丨物RtHKT 1-2R为引物进行PCR扩增，得到约1941 bp的双链DNA分子。
[0106] 4、将步骤3中得到双链DNA分子连接至pEASY-Tl载体，得到重组质粒甲。
[0107] 根据测序结果，重组质粒甲含有序列表中的序列1所示的DNA分子，表达序列表中 序列2所示的高亲和性钾离子转运蛋白RtHKTl (以下简称蛋白质RtHKTl或RtHKTl蛋白）。
[0108] 二、RtHKTl基因的克隆
[0109] 1、同步骤一中1。
[0110] 2、人丁合成引物RtHKTl-F:5'-CGCGGATCCATGCATAT(iCTGATC-3'（双下创线为序列 表中序列 1 自 5 ' 末端起第64 至 78位)和引物RtHKT 1-R: 5 ' -GCGGAGCTCTTAGGACAGTTCCCAAG- 3'（双下划线为序列表中序列1自5'末端起第1907至1923位的反向互补序列）。
[0111] 3、完成步骤1和2后，以步骤1提取的cDNA为模板，以步骤2合成的引物RtHKTl-F和 引物RtHKT 1-R为引物进行PCR扩增，得到约1874bp的双链DNA分子。
[0112] 4、将步骤3中得到双链DNA分子连接至pEASY-Tl载体，得到重组质粒乙。
[0113]根据测序结果，重组质粒乙含有序列表中的序列1自5'末端起第64至1923位所示 的DNA分子(即RtHKTl基因），表达序列表中序列2所示的蛋白质RtHKTl。
[0114] 实施例2、RtHKTl蛋白的亚细胞定位
[0115] -、重组质粒 pUC18_RtHKTl:GFP 的构建
[0116] 1、同实施例1步骤一中1。
[0117] 2、人工合成引物肚邢11，(；〇1-?:5'-(^八丁66六丁(^六丁八1观1^冗八171似-3'（单下 划线为限制性内切酶Ncol的识别序列，双下划线为序列表中序列1自5'末端起第64至84位） 和引物RtHKT 1 -NcoI-R: 5 ' -CCCATGGGGACAGTTCCCAAGCTTT-3 '（单下划线为限制性内切酶 Ncol的识别序列，双下划线为序列表中序列1自5'末端起第1903至1920位的反向互补序 列)。
[0118] 3、完成步骤1和2后，以步骤1提取的cDNA为模板，以步骤2合成的引物RtHKTl-Nco I-F和引物RtHKT 1 -Nco I-R为引物进行PCR扩增，得到约1871 bp的双链DNA分子;然后进行纯 化、回收，得到DNA片段。
[0119] 4、用限制性内切酶Ncol单酶切步骤3得到的DNA片段，然后回收酶切产物。
[0120] 5、用限制性内切酶此〇1单酶切载体?1](：18-353?-6??，回收约3.91〇3的载体骨架。
[0121] 6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pUC18-RtHKTl: GFP。重组质粒pUC18-RtHKTl:GFP的元件示意图如图1所示，其中35Sp为CaMV 35S启动子， RtHKTl为不含终止子的RtHKTl基因，NOSt为胭脂碱合酶终止子，GFP为绿色荧光蛋白的编码 基因。
[0122] 根据测序结果，对重组质粒pUC18-RtHKTl:GFP进行结构描述如下：向载体pUC18- 35 Sp-GFP的限制性内切酶Nco I的识别位点之间插入序列表的序列1自5 '末端起第64至19 20 位所示的DNA分子。
[0123] 二、RtHKTl蛋白的亚细胞定位
[0124] 1、采用基因枪介导的遗传转化方法(Zheng L L，Gao Z，Wang J，et al .Molecular cloning and functional characterization of a novel CBL-interacting protein kinase NtCIPK2in the halophyte Nitrariatangutorum[J].Genetics and Molecular Research，2014，13(3) :4716-4728.),将重组质粒pUC18-RtHKTl:GFP转化洋葱的内表皮细 胞。
[0125] 2、取转化后的洋葱，置于MS固体培养基，室温暗培养24h。
[0126] 3、完成步骤2后，用镊子撕下所述洋葱的内表皮细胞，置于载玻片上，在激光共聚 焦显微镜下观察。
[0127] 按照上述方法，将重组质粒pUC18-RtHKTl:GFP替换为载体pUC18-35Sp-GFP，其它 步骤均不变，在共聚焦显微镜下观察，作为对照。
[0128] 实验结果见图2 (A和D为蓝光，B和E为明场，C和F为蓝光和明场的叠加，A、B和C为载 体pUC18-35Sp-GFP，D、E和F为重组质粒pUC18-RtHKTl:GFP)。结果表明，RtHKTl蛋白定位在 细胞膜上。
[0129] 实施例3、RtHKTl基因在不同逆境胁迫下的表达模式
[0130] 一、不同浓度NaCl处理下RtHKTl基因的表达模式
[0131] 实验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0132] 1、取长叶红砂种子，用10% (质量百分比）次氯酸钠水溶液浸泡10min以进行表面 灭菌，然后播种于MS固体培养基并置于温度为22°C、湿度为70%的条件下，光暗交替培养30 天。
[0133] 2、完成步骤1后，取长势基本一致的长叶红砂幼苗，置于MS液体培养基中，22°C光 暗交替培养7天。
[0134] 3、取完成步骤2的长叶红砂幼苗，置于MS液体培养基中处理2h(每次处理5株），然 后采用RNA Plant Plus Regen Kit分别提取每株长叶红砂幼苗总RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反转录出第一链cDNA，命名为正常处理的cDNA，正常处理的 cDNA中DNA的浓度为50ng/yL。
[0135] 按照上述步骤3,将"MS液体培养基"替换为"含100mMNaCl的MS液体培养基"、"含 200mMNaCl的MS液体培养基"、"含300mMNaCl的MS液体培养基"或"含400mMNaCl的MS液体培 养基"，其它步骤均不变，依次得到100mMNaCl处理的cDNA、200mMNaCl处理的cDNA、 300mMNaCl 处理的 cDNA 和400mMNaCl 处理的 cDNA。
[0136] 4、通过实时荧光定量PCR检测步骤3得到的各cDNA中RtHKTl基因的相对表达量（以 β-Actin基因为内参基因，β-Actin基因记载与如下文献中：董禄禄，秦晓春，党振华.长叶红 砂液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特性[J].西北植物学报，2015，35( 11) "2164-2170.)，然后取平均值，得到平均相对表达量。鉴定RtHKTl基因的引物为5'- TTACGGTCCTGATGCTGTTAGGT-3'和5'-ATGGTTTGTGGTCGGCTTG-3'。鉴定β-Actin基因的引物为 5 '-GGAATCCACGAGACCACCTACA-3 ' 和
[0137] 5 '-GATTGATCCTCCGATCCAGACA-3 '。
[0138] 反应体系（20yL): 10yL TranstartR Green qPCR SuperMix、8·2yL ddH2〇、lyL步 骤3得到的cDNA(作为模板），0.4yL上游引物(含0.2μΜ引物）和0.4Λ下游引物（含0.2μΜ引 物）。反应程序:95 °C预变性30s; 94°C变性5s，58 °C退火15s，72 °C延伸10s，48个循环。溶解曲 线从65~95°C。实验结果用2-Δ Δ Ct法进行分析，利用SPSS19.0软件进行数据统计及绘图。
[0139] 与正常处理的cDNA中的RtHKTl基因的平均相对表达量相比，lOOmM NaCl处理的 cDNA、200mM NaCl处理的cDNA、300mM NaCl处理的cDNA和400mM NaCl处理的cDNA中的 RtHKTl基因的平均相对表达量见图3中A。结果表明，RtHKTl基因的相对表达量受NaCl胁迫 的诱导，在不同浓度NaCl胁迫下，RtHKTl基因均显著下调表达，可能通过抑制RtHKTl介导的 Na+吸收来降低根部Na+浓度。
[0140] 二、NaC 1处理不同时间下RtHKT 1基因的表达模式
[0141] 实验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0142] 1、同步骤一中1。
[0143] 2、同步骤一中2。
[0144] 3、模板的获得
[0145] (1)取完成步骤2的长叶红砂幼苗5株，采用RNA Plant Plus Regen Kit分别提取 每株长叶红砂幼苗总RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反转录出第一链 cDNA，命名为对照处理的cDNA，对照处理的cDNA中DNA的浓度为50ng/yL。
[0146] (2)取完成步骤2的长叶红砂幼苗，置于含200mMNaCl的MS液体培养基中处理lh (每 次处理5株），采用RNA Plant Plus Regen Kit分别提取每株长叶红砂幼苗总RNA，然后利用 M-MLV reverse transcriptase Kit反转录出第一链cDNA，命名为cDNAl，cDNAl中DNA的浓 度为 50ng/yL。
[0147] 按照上述步骤（2)，将"处理lh"替换为"处理3h" "处理6h"和"处理12h"或"处理 24h"，其它步骤均不变，依次得到cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5。
[0148] 4、同步骤一中4。
[0149] 对照处理的cDNA、cDNAl、cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5中的RtHKTl基因的相对表达 量见图3中B，结果表明，在200mM NaCl胁迫条件下，随着胁迫时间的延长，RtHKTl基因的平 均相对表达量迅速增加，到处理1小时达到最大值，RtHKTl基因之后的平均相对表达量逐渐 降低。
[0150] 三、不同浓度KC1处理下RtHKTl基因的表达模式
[0151] 实验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0152] 1、同步骤一中1。
[0153] 2、同步骤一中2。
[0154] 3、取完成步骤2的长叶红砂幼苗，置于MS液体培养基中处理24h(每次处理5株），然 后采用RNA Plant Plus Regen Kit分别提取每株长叶红砂幼苗总RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反转录出第一链cDNA，命名为正常处理的cDNA，即control。
[0155] 按照上述步骤3，将"MS液体培养基"替换为"缺钾的MS液体培养基"、"含0.1 mM KC1 的MS液体培养基"、"含10mM KC1的MS液体培养基"、"含25mM KC1的MS液体培养基"、"含50mM KC1的MS液体培养基"、"含lOOmM KC1的MS液体培养基"、"含200mM KC1的MS液体培养基"或 "含300mM KC1的MS液体培养基"，其它步骤均不变，依次得到OmM KC1处理的cDNA、0.1mM KC1 处理的cDNA、10mM KC1 处理的cDNA、25mM KC1 处理的cDNA、50mM KC1 处理的cDNA、lOOmM KC1 处理的cDNA、200mM KC1 处理的cDNA和300mM KC1 处理的cDNA。
[0156] 4、同步骤一中4。
[0157] 正常处理的cDNA、0mM KC1处理的cDNA、0.1 mM KC1处理的cDNA、10mMKCl处理的 cDNA、25mMKCl 处理的 cDNA、50mMKCl 处理的 cDNA、100mMKCl 处理的 cDNA、200mMKCl 处理的 cDNA和300mMKCl处理的cDNA中的RtHKTl基因的相对表达量见图4中A，结果表明，缺钾胁迫 (OmM KC1处理)和低钾处理(O.l-lOmM KC1处理)能显著诱导RtHKTl基因的表达，随着KC1浓 度的增加，RtHKTl基因的相对表达量显著增加，在10mM KC1处理时其相对表达量达到最高； 高钾处理(25-300mM KC1处理)时，在25mM KC1处理时表达量最低，继续增加 KC1浓度其表达 量开始趋于稳定。以上结果表明，在K+含量极低的生长环境下仍能有效摄入K+，即RtHKTl基 因对于K+具有高度亲和性，属于高亲和性钾离子转运蛋白。
[0158] 四、KC1处理不同时间下RtHKTl基因的表达模式
[0159] 实验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0160] 1、同步骤一中1。
[0161] 2、同步骤一中2。
[0162] 3、模板的获得
[0163] (1)取完成步骤2的长叶红砂幼苗5株，采用RNA Plant Plus Regen Kit分别提取 每株长叶红砂幼苗总RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反转录出第一链 cDNA，命名为对照处理的cDNA，对照处理的cDNA中DNA的浓度为50ng/yL。
[0164] (2)取完成步骤2的长叶红砂幼苗，置于含lOmMKCl的MS液体培养基中处理lh (每次 处理5株），采用RNA Plant Plus Regen Kit分别提取每株长叶红砂幼苗总RNA，然后利用M- MLV reverse transcriptase Kit反转录出第一链cDNA，命名为cDNAl，cDNAl中DNA的浓度 为50ng/yL。
[0165] 按照上述步骤（2)，将"处理lh"替换为"处理3h" "处理6h"和"处理12h"或"处理 24h"，其它步骤均不变，依次得到cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5。
[0166] 4、同步骤一中4。
[0167] 对照处理的cDNA、cDNAl、cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5中的RtHKTl基因的相对表达 量见图4中B。结果表明，在1 OmMKC 1胁迫条件下，随着胁迫时间的延长，RtHKT 1基因的相对表 达量迅速增加，到处理lh达到最大值，处理3~12h之间RtHKTl基因的相对表达量逐渐降低， 12h之后RtHKTl基因的相对表达量又显著增加，说明该基因在低钾环境下，可能参与K+的快 速吸收，短期的表达量提高为植物适应长期胁迫提供信号。
[0168] 实施例4、转RtHKTl基因酵母的获得
[0169] 一、重组质粒 pYES2 · Ο-RtHKTl 的构建
[0170] 1、同实施例1步骤一中1。
[0171] 2、人工合成引物肚服11-1^111-卩:5' -CGGGGTACCAT€CATATG(iTCATGAT-3 '（单下划 线为限制性内切酶ΚρηΙ的识别序列，双下划线为序列表中序列1自5'末端起第64至80位)和 引物RtHKT 1 -XbaI-R: 5 ' -GCTCTAGATTAGGACAGTTCCC-3 '（单下划线为限制性内切酶XbaI 的 识别序列，双下划线为序列表中序列1自5'末端起第1910至1923位的反向互补序列）。
[0172] 3、完成步骤1和2后，以步骤1提取的cDNA为模板，以步骤2合成的引物RtHKTl-Kpn I-F和引物RtHKT 1 -Xba I-R为引物进行PCR扩增，得到约1874bp的双链DNA分子。
[0173] 4、用限制性内切酶ΚρηΙ和Xbal双酶切步骤3得到的双链DNA分子，然后回收酶切产 物。
[0174] 5、用限制性内切酶ΚρηΙ和Xbal双酶切载体pYES2.0/ΝΤ，回收约6. Okb的载体骨架。
[0175] 6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pYES2.0-RtHKTl。 重组质粒PYES2.0-RtHKTl的元件示意图如图5所示。
[0176] 根据测序结果，对重组质粒pYES2.0-RtHKTl进行结构描述如下：向载体pYES2.0/ NT的限制性内切酶ΚρηΙ的识别序列和Xbal的识别序列之间插入序列表的序列1自5'末端起 第64至1923位所示的DNA分子。
[0177] 二、转RtHKTl基因酵母的获得
[0178] (1)取酵母突变体AXT3的单菌落，接种于100mL YH)液体培养基，然后30°C、200rpm 培养至菌液的〇D6QQnm值在0.4~0.6之间。
[0179] (2)完成步骤(1)后，取所述菌液，4000rpm离心10min，收集沉淀1。
[0180] (3)完成步骤(2)后，取所述沉淀1，先用lmL无菌水洗涤1次，再用lmL 0.1M乙酸锂 水溶液洗涤1次，最后用lmL 0.1M乙酸锂水溶液重悬，30°C静置培养30min，用EP管分装，每 管250yL。
[0181] (4)完成步骤（3)后，取所述EP管，离心，得到沉淀2。向沉淀2中加入240yL 50% PEG-4000、36yL 1M乙酸锂水溶液、50yg单链鲑鱼精DNA和5yL重组质粒pYES2.0-RtHKTl，然 后用无菌水补充至总体积为3 50yL，得到体系。
[0182] (5)完成步骤（4)后，取所述体系，先涡旋振荡2min，充分混匀，30°C静置培养 30min;然后42 °C热激15min，离心，得到沉淀3。
[0183] (6)完成步骤(5)后，取所述沉淀3,用0. lmL无菌水重悬，然后均勾涂布于Drop-Out 固体培养基上，30°C倒置培养，2~4天。
[0?84] (7)完成步骤(6)后，随机挑选Drop-Out固体培养基上的单菌落，接种于5mL Drop- 〇ut液体培养基，30°C、250rpm培养24h，得到培养菌液，离心，得到沉淀4。
[0185] (8)完成步骤⑴后，取所述沉淀4，加入10yL溶菌酶，祸旋震荡均勾，37°C、250rpm 震荡培养30min。
[0186] (9)完成步骤(8)后，取所述培养菌液，加入20yL的10 % (质量百分比）的SDS水溶 液，涡旋震荡混匀，然后交替置于液氮和沸水浴中，重复冻融3~4次（目的为彻底破碎细胞 壁），然后加无菌水至200yL。
[0187] (10)完成步骤(9)后，取所述培养菌液，加入200yL苯酚:氯仿：异戊醇（体积比为 25:24:1)，祸旋震荡5min，12000rpm离心10min，收集上清1。
[0188] (11)完成步骤（10)后，取所述上清1，加入8yL的10M的醋酸铵水溶液和500yL无水 乙醇，-20°C放置lh，12000rpm离心10min，收集沉淀5,真空干燥后，用20yL无菌水溶解沉淀 5,得到溶解液。
[0189] (12)完成步骤（10)后，以所述溶解液为模版，以步骤一人工合成的引物RtHKTl- Kpnl-F和引物RtHKTl-Xbal-R为引物，得至IjPCR扩增产物;如果所述PCR扩增产物中含有大小 为1874bp的DNA片段，则步骤(7)随机挑选的单菌落为转RtHKTl基因酵母。
[0190]三、转空载体酵母的获得
[0191]按照上述步骤二的方法，将步骤（4)中重组质粒pYES2.0-RtΗKT1替换为载体 pYES2.0/NT，其他步骤均相同，得到转空载体酵母。
[0192] 四、转RtHKTl基因酵母的抗性鉴定
[0193] 1、转RtHKTl基因酵母的耐低钾性
[0194] 实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
[0195] (1)取步骤二获得的转RtHKTl基因酵母的单菌落，接种于5mLDrop-〇ut液体培养 基，30°C培养72h，然后用Drop-Out液体培养基稀释至0D600为0.5，得到菌液1。
[0196] (2)取步骤（1)得到的菌液1，用Drop-Out液体培养基分别稀释10倍、100倍和1000 倍，依次得到菌液2、菌液3和菌液4。
[0197] (3)取步骤（2)得到的5yL菌液（菌液1、菌液2、菌液3或菌液4)，均匀涂布于Drop- Out固体培养基（对照）、含100μΜ KC1的Drop-Out固体培养基、含ImM KC1的Drop-Out固体培 养基、含10mM KC1的Drop-Out固体培养基、含50mM KC1的Drop-Out固体培养基、含200mM KC1的Drop-Out固体培养基或含500mM KC1的Drop-Out固体培养基，30 °C倒置培养2天，观察 不同浓度KC1处理下转RtHKTl基因酵母的生长状态。
[0198] 按照上述步骤，将转RtHKTl基因酵母替换为转空载体酵母，其它步骤均不变，观察 不同浓度KC1处理下转空载体酵母的生长状态。
[0199] 实验结果见图6(RtHKTl为转RtHKTl基因酵母，pYES2为转空载体酵母，K+为KCllO 0为菌液1，101为菌液2，102为菌液3，104为菌液4)。结果如下：在Drop-Out固体培养基上，转 RtHKTl基因酵母和转空载体酵母均能正常生长;在含100μΜ KC1的Drop-Out固体培养基上 或含ImM KC1的Drop-Out固体培养基上(低钾处理条件下），转RtHKTl基因酵母的生长状况 明显好于转空载体酵母，可见RtHKTl基因能够明显恢复酵母突变体AXT3的生长缺陷；在含 10mM KC1的Drop-Out固体培养基、含50mM KC1的Drop-Out固体培养基、含200mM KC1的 Drop-Out固体培养基或含500mM KC1的Drop-Out固体培养基上（高钾处理条件下），转空载 体酵母和转RtHKTl基因酵母的生长均受到一定程度的抑制且浓度越高抑制程度越大，在相 同KC1浓度处理下，转空载体酵母的抑制程度更加明显。结果表明，RtHKTl基因对低钾十分 敏感，受低钾的诱导，转RtHKT 1基因酵母的耐低钾性增强，所述耐低钾性指的是转RtHKT 1基 因酵母在低钾环境中的抗性增强，低钾环境具体为ImM K+以下的生长环境。
[0200] 2、转RtHKTl基因酵母的抗逆性
[0201 ]实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
[0202] (1)同步骤 1中（1)。
[0203] (2)同步骤 1 中（2)。
[0204] (3)取步骤（2)得到的5yL菌液（菌液1、菌液2、菌液3或菌液4)，均匀涂布于Drop- Out固体培养基上（对照）、含lOOmM NaCl的Drop-Out固体培养基、含300mM NaCl的Drop-Out 固体培养基、含500mM NaCl的Drop-Out固体培养基或含700mM NaCl的Drop-Out固体培养基 上，30°C倒置培养2天，观察不同浓度NaCl处理下转RtHKTl基因酵母的生长状态。
[0205]按照上述步骤，将转RtHKTl基因酵母替换为转空载体酵母，其它步骤均不变，观察 不同浓度NaCl处理下转空载体酵母的生长状态。
[0206] 实验结果见图7(RtHKTl为转RtHKTl基因酵母，pYES2为转空载体酵母，Na+为NaCl， 10°为菌液1，101为菌液2，102为菌液3，104为菌液4)。结果如下:转空载体酵母在不同浓度的 NaCl胁迫下生长均受到不同程度的抑制，且胁迫浓度越高，生长抑制越严重，在700mM NaCl 胁迫时几乎不能生长。而转RtHKTl基因酵母在含100~500mM NaCl胁迫下生长状况与在 Drop-Out固体培养基上的生长状态无显著差别。结果表明，转RtHKTl基因酵母的抗盐性增 强，RtHKTl基因在高钠环境能够转运Na+，且能显著减轻Na+对酵母突变体AXT3的毒害。
[0207] 3、转RtHKTl基因酵母在KC1或NaCl胁迫下的离子含量测定
[0208] A、KC1胁迫条件下的离子含量测定
[0209] (1)取酵母(转RtHKTl基因酵母或转空载体酵母或酵母突变体AXT3)单菌落，接种 于5mLDrop-〇ut液体培养基中，30°C震荡培养72h，然后用Drop-Out液体培养基稀释至0D600 为0.5,得到菌液1。
[0210] ⑵取步骤（1)得到的5yL菌液1，接种于50mL含ImM KC1的Drop-Out液体培养基中， 30°C震荡培养72h。
[0211] (3)完成步骤（2)后，参考文献(Mishra S，Alavilli H，Lee B，et al.Cloning and functional characterization of a vacuolar Na+/H+antiporter gene from mungbean (VrNHXl)and its ectopic expression enhanced salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J] .PloS one,2014,9(10) :e 106678.)中的方法测定酵母细胞质中的钠离子及钾 离子含量、酵母液泡中的钠离子及钾离子含量，和酵母的总钠离子及总钾离子含量。
[0212] B、NaCl胁迫条件下的离子含量测定
[0213] 将步骤A中⑵所述"含ImM KC1的Drop-Out液体培养基"替换为"含500mM NaCl的 Drop-Out液体培养基"，其它步骤均不变，得到酵母在NaCl胁迫下的离子含量测定。
[0214] C、正常条件下的的离子含量测定
[0215] 将步骤A中⑵所述"含ImM KC1的Drop-Out液体培养基"替换为"Drop-Out液体培 养基"，其它步骤均不变，得到酵母在正常条件下的离子含量测定。
[0216] 实验结果见图8(YPG为正常条件下，即在Drop-Out液体培养基;YPG+NaCl为NaCl胁 迫条件下，即在含500mM NaCl的Drop-Out液体培养基;YPG+KC1为KC1胁迫条件下，即在含 ImM KC1的Drop-Out液体培养基；pYES-空为转空载体酵母，pYES-RtHKT为转RtHKTl基因酵 母）。结果表明，转空载体酵母和酵母突变体AXT3中，细胞质中的钠离子及钾离子含量、酵母 液泡中的钠离子及钾离子含量，和，酵母的总钠离子及总钾离子含量均无显著差异。在 500mM NaCl胁迫处理下，与转空载体酵母相比，转RtHKTl基因酵母的细胞质中的钠离子及 钾离子含量、液泡中的钠离子及钾离子含量，和酵母的总钠离子及总钾离子含量均显著增 加，但细胞质的钠钾离子比、液泡的钠钾离子比和总钠钾离子比均降低，说明该基因对于高 盐胁迫具有极强的适应性，并且能够降低其细胞体内的Na+/k+比，进而使其具有较强的耐盐 性。在ImM KC1胁迫处理下，与转空载体酵母相比，转RtHKTl基因酵母的细胞质中的钠离子 及钾离子含量、液泡中的钠离子及钾离子含量，和酵母的总钠离子及总钾离子含量均显著 增加，但细胞质的钠钾离子比、液泡的钠钾离子比和总钠钾离子比均降低，说明该基因在低 钾环境下能有效摄入K+，并且能够降低其细胞体内的Na+/k+比，进而使其对低钾环境具有极 强的适应性。
【主权项】
1. 蛋白质，为如下al)或a2)或a3): al)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质； a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； a3)将al)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 得到的具有相同功能的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3. 如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子为如下(bl)或(b2)或(b3) 或(b4)所示的DNA分子： (bl)序列表中序列1所示的DNA分子； (b2)编码区为序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子； (b3)与（bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1 所述蛋白质的DNA分子； (b4)在严格条件下与(bl)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白 质的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。5. (：1)或〇2)的应用： cl)权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所 述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在dl)和/或d2)和/或d3)和/ 或d4)和/或d5)中的应用； dl)调控抗逆性； d2)调控钠吸收量和/或钾吸收量； d3)转运钠离子和/或钾离子； d4)调控钠钾离子比； d5)调控耐低钾性； c2)权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所 述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗逆性增强和/或钠 吸收量增加和/或钾吸收量增加和/或转运钠离子能力增加和/或转运钾离子能力增加和/ 或钠钾离子比减小和/或耐低钾性增强的转基因酵母中的应用。6. -种培育转基因酵母的方法，包括向受体酵母中导入编码权利要求1所述蛋白质的 核酸分子，得到转基因酵母的步骤;与所述受体酵母相比，所述转基因酵母的抗逆性增强 和/或钠吸收量增加和/或钾吸收量增加和/或转运钠离子能力增加和/或转运钾离子能力 增加和/或钠钾离子比减小和/或耐低钾性增强。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于:所述编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子 为如下(bl)或(b2)或(b3)或(b4)所示的DNA分子： (bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； (b2)编码区如序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子； (b3)与（bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1 所述蛋白质的DNA分子； (b4)在严格条件下与(bl)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白 质的DNA分子。8. 如权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述受体酵母为酵母突变体AXT3。9. 如权利要求5所述的应用，或，权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述抗逆性为 抗盐性。10. 如权利要求5所述的应用，或，权利要求6或7所述的方法，其特征在于： 所述钠吸收量为细胞质的钠吸收量和/或液泡的钠吸收量和/或总钠吸收量;所述钾吸 收量为细胞质的钾吸收量和/或液泡的钾吸收量和/或总钾吸收量;所述钠钾离子比为细胞 质的钠钾离子比和/或液泡的钠钾离子比和/或总钠钾离子比。
【文档编号】A01H5/00GK105837672SQ201610413076
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】王迎春, 李宁宁, 郑琳琳, 董碌碌
【申请人】内蒙古大学