一种经改性的蛋白及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种经改性的蛋白及其制备方法和应用。具体地，所述经改性的蛋白包括：可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有经修饰的赖氨酸残基和/或经修饰的N端氨基。本发明还公开了所述经改性的蛋白的制备方法和应用。所述经改性的蛋白具有更优的亲水/疏水结构比例，进而能更有效地负载所述脂溶性活性成分，因此是一种负载性能优异的脂溶性活性成分纳米载体。所述经改性的蛋白的制备方法具有反应条件温和、反应效率高、工艺简单、产物易分离、无有害化学物残留、无安全问题等特点，可广泛应用于各种蛋白(特别是可食用蛋白)的改性中。
【专利说明】
一种经改性的蛋白及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及食品和材料领域，具体地涉及一种经改性的蛋白及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质化学改性主要是针对蛋白多肽中一些氨基、羟基、羧基以及巯基基团进行 化学改性反应，包括酰化、脱酰胺、磷酸化、糖基化（即美拉德反应）、共价交联、水解及氧化 等反应。目前针对化学改性后蛋白质的研究主要集中在改性对蛋白理化和功能性的影响， 如溶解性、乳化性、吸水性、起泡性、热稳定性及凝胶性等。然而，改性对蛋白质自组装性能 以及用作载运体系中载体材料性质的影响却鲜有研究。此外，由于大多数化学合成方法可 能会对蛋白质本身结构产生破坏，且存在潜在的安全性问题。因此，经改性的蛋白在诸多领 域，特别是食品领域中的应用也存在一定限制。
[0003] 因此，本领域迫切需要开发一种反应条件温和、工艺简单、无安全问题等特点的蛋 白化学改性方法，应用于各种蛋白（特别是可食用蛋白）的改性中。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种具有优异自组装性能和负载脂溶性活性成分性能的 经改性的蛋白及其制备方法。
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种经改性的蛋白或其盐，所述经改性的蛋白包括：
[0006] 可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有经修饰的赖氨酸残基和/或经 修饰的N端氨基；
[0007] 其中所述的"经修饰的"指赖氨酸残基侧链上的ε_氨基或所述蛋白的N端氨基NH2中的氢原子被非极性烷基链取代基修饰，所述非极性烷基链为直链或支链的C12-C30的烷 基。
[0008] 在另一优选例中，所述非极性烷基链共价辄合于所述赖氨酸残基侧链上的ε_氨基 和/或蛋白质的Ν端的氨基。
[0009] 在另一优选例中，所述的可食用蛋白为水溶性蛋白。
[0010]在另一优选例中，所述的水溶性蛋白指在25°C时，在水中的溶解度2 5000mg/L，优 选为6000-10000mg/L。
[0011] 在另一优选例中，所述经改性的蛋白的分子量为75000-375000Da，较佳地为 15000-25000Da〇
[0012] 在另一优选例中，所述可食用蛋白选自下组:酪蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、或其组 合。
[0013] 在另一优选例中，所述可食用蛋白的盐选自下组:钠盐、钙盐、钾盐、或其组合。
[0014] 在另一优选例中，lmol所述可食用蛋白含有8_16mol赖氨酸残基侧链上的ε-氨基， 较佳地10-14mo 1，更佳地12.14mo 1。
[0015] 在另一优选例中，所述非极性烷基链为直链或支链的C14-C26的烷基，较佳地为直 链或支链的C16-C22的烷基。
[0016] 在另一优选例中，所述非极性烷基链为饱和的或不饱和的烷基，优选为饱和的烷 基。
[0017] 在另一优选例中，所述非极性烷基链中烷基为经取代或未经取代的烷基。
[0018] 在另一优选例中，所述取代指所述烷基中的氢原子被选自下组的基团取代:羟基、 CN、羧基、-NH2、或其组合。
[0019] 在另一优选例中，所述经改性的蛋白中，所述非极性烷基链的辄合度为5-15%，且 所述辄合度C的计算公式如下式F1或F2:
[0020] C=(Kl+Nl)/(Kaii+l) X100% (F1)
[0021] 式中，
[0022] K1为可食用蛋白中所述经修饰的赖氨酸残基侧链上的ε-氨基的数目；
[0023] Ν1为可食用蛋白中所述经修饰的Ν端氨基的数目；
[0024] Kaii为可食用蛋白中赖氨酸残基侧链上的ε-氨基的总数；
[0025] C = y/((Miysine+l) ·χ)Χ100% (F2)
[0026] 式中，y是辄合到可食用蛋白中非极性烷基链的摩尔数，Mlysine是每摩尔可食用蛋 白中赖氨酸残基的摩尔数，X是经改性的可食用蛋白的摩尔数。
[0027] 在另一优选例中，所述经改性的蛋白中，所述非极性烷基链的辄合度为5.5-13%， 较佳地为6-12 %，更佳地为6.5-10 %。
[0028] 亦另一优诜例由.所怵经改性的蛋白具有式I所示结构：
[0029]
[0030] 式中，
[0031] R为非极性烷基链取代基
[0032] Pr为可食用蛋白；
[0033] 其中，一个Pr上可连接有一个或多个R-C0-NH-基团。
[0034]在另一优选例中，所述经改性的蛋白的疏水性指数大于未经改性的可食用蛋白的 疏水性指数。
[0035]在另一优选例中，所述经改性的蛋白的疏水性指数为20-150,较佳地20-70,更佳 地为20-50。
[0036] 在另一优选例中，所述可食用蛋白（即未经改性的可食用蛋白）的疏水性指数为 10-22〇
[0037] 在另一优选例中，所述疏水性指数是采用ANS荧光检测法测定得到。
[0038] 本发明的第二方面，提供了一种纳米粒子，所述纳米粒子由本发明第一方面所述 的经改性的蛋白或其盐自组装形成，且所述纳米粒子中任选地包含装载于其中的脂溶性活 性成分。
[0039] 在另一优选例中，所述脂溶性活性成分选自下组:黄酮类化合物、ω -3脂肪酸、植 物甾醇、或其组合。
[0040] 在另一优选例中，所述黄酮类化合物选自下组：姜黄素、橙皮苷、黄芩素、或其组 合。
[0041] 在另一优选例中，所述纳米粒子具有选自下组的一个或多个特征：
[0042] 1)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的水分散性好；
[0043] 2)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的粒径为10-1000nm;
[0044] 3)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的多分散指数PDI < 0.25;
[0045] 4)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的ζ电位为-40mV~+40mV。
[0046] 在另一优选例中，所述的"水分散性好"指将0.2-5g(较佳地0.5-3g)所述纳米粒子 与100ml水混合，可形成溶液，且无肉眼可见的团聚物。
[0047] 在另一优选例中，按所述纳米粒子的总重量计，所述脂溶性活性成分的装载量为 l-10wt%，较佳地为2_8wt%，更佳地为3_6wt%。
[0048]在另一优选例中，所述纳米粒子（或冻干再分散后的纳米粒子）的粒径为30- 800nm，较佳地为 50-600nm，更佳地为 100-500nm。
[0049]在另一优选例中，所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子）的多分散指数PDI < 0.4，较佳地< 0.3，更佳地< 0.2。
[0050]在另一优选例中，所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的ζ电位为_35mV~ +35mV〇
[0051]在另一优选例中，所述复合物中被包载的脂溶性活性成分以无定形态分散在所述 载体材料(改性的蛋白或其盐）中。
[0052]本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述经改性的蛋白或其盐的制备 方法，包括步骤：
[0053] 1)提供第一混合液，所述第一混合液包含未经改性的可食用蛋白、N-琥珀酰亚胺 酯和任选的第一溶剂；
[0054] 2)在搅拌条件下，所述第一混合液反应得到第二混合液；
[0055] 3)离心处理步骤2)所得第二混合液，取上清液；
[0056] 4)透析处理步骤3)所得上清液，得到本发明第一方面所述经改性的蛋白。
[0057]在另一优选例中，在步骤4)之后还任选地包括如下步骤：
[0058] 5)冷冻干燥前述步骤所得产物。
[0059] 在另一优选例中，所述第一混合液的pH为7.5-11，较佳地为9-10。
[0060]在另一优选例中，所述N-琥珀酰亚胺酯为直链或支链的C13-C31的脂肪酸与N羟基 琥珀酰亚胺的缩合产物。
[0061]在另一优选例中，所述N-琥珀酰亚胺酯选自下组:N-琥珀酰亚胺-辛酸酯、N-琥珀 酰亚胺-月桂酸酯、N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯、N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯、N-琥珀酰亚胺-硬 脂酸酯、N-琥珀酰亚胺-花生酸酯、或其组合。
[0062] 在另一优选例中，所述第一溶剂选自下组:水、DMS0、DMF或其组合。
[0063]在另一优选例中，所述第一溶剂为(a)水与（b)DMS0和/或DMF的混合溶剂，其中体 积比为 70-99:30-1。
[0064] 在另一优选例中，所述的第一混合液中含有选自下组的缓冲剂:碳酸钠 -碳酸氢 钠、磷酸氢钠-氢氧化钠、或其组合。
[0065] 在另一优选例中，所述第一混合液中，所述未经改性的可食用蛋白和所述N-琥珀 酰亚胺酯的摩尔比为1:1.2-125，较佳地为1:2.4-100，更佳地为1:5-20。
[0066] 在另一优选例中，所述第一混合液中，所述未经改性的可食用蛋白中赖氨酸残基 侧链上的ε -氨基和所述N-琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:0.1 -10，较佳地为1:0.15-8，更佳地 1:0·2_5 〇
[0067] 在另一优选例中，步骤2)所述反应的反应温度为15-40°C。
[0068] 在另一优选例中，步骤2)所述反应的反应时间为0.5_3h。
[0069] 在另一优选例中，步骤3)所述离心处理的速度为5000-20000rpm，较佳地8000- 15000rpm〇
[0070] 在另一优选例中，步骤3)所述离心处理的时间为3-20min。
[0071] 在另一优选例中，步骤4)所述透析处理所用透析袋的截留分子量为3000_5000Da。
[0072] 在另一优选例中，步骤4)所述透析处理的处理时间为10_60h。
[0073] 本发明的第四方面，提供了一种本发明第二方面所述纳米粒子的制备方法，包括 步骤：
[0074] a)提供混合液A，所述混合液A包含本发明第一方面所述的经改性的蛋白、任选的 脂溶性活性成分和任选的第二溶剂；
[0075] b)在搅拌条件下，所述混合液A自组装反应得到包含本发明第二方面所述纳米粒 子的混合液B;
[0076] c)透析处理步骤b)所得混合液B，得到经透析处理的混合液；
[0077] d)任选地离心处理步骤c)所得经透析处理的混合液，取上清液，制得本发明第二 方面所述纳米粒子。
[0078]在另一优选例中，所述第二溶剂选自下组:水、乙醇、丙二醇、或其组合。
[0079]在另一优选例中，步骤b)所述自组装反应的反应时间为10-60min。
[0080] 在另一优选例中，步骤c)所述透析处理所用的透析袋的分子量为10_20kDa。
[0081 ] 在另一优选例中，步骤d)所述离心处理的速度为3000_6000rpm。
[0082] 在另一优选例中，步骤d)所述离心处理的时间为l_30min，较佳地3_15min。
[0083] 本发明的第五方面，提供了一种本发明第一方面所述的经改性的蛋白的用途，用 于选自下组的用途：
[0084] 1)用于装载脂溶性食品活性成分；
[0085] 2)用于装载难溶性药物。
[0086] 本发明的第六方面，提供了一种制品，所述制品包含本发明第一方面所述改性蛋 白或本发明第二方面所述的纳米粒子，或由本发明第一方面所述改性蛋白或本发明第二方 面所述的纳米粒子制成。
[0087] 在另一优选例中，所述制品选自下组:食品添加剂、载体、药物、食物。
[0088]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0089]图1为N-羟基琥珀酰亚胺、辛酸与N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的1H-NMR谱图。
[0090]图2为N-羟基琥珀酰亚胺、辛酸与N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的13C-NMR谱图。
[0091 ]图3为N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的高效液相色谱图。
[0092]图4为N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的离子流图。
[0093]图5为N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的质谱图。
[0094]图6为N-羟基琥珀酰亚胺、月桂酸与N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的1H-NMR谱图。
[0095]图7为N-羟基琥珀酰亚胺、月桂酸与N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的13C_NMR谱图。
[0096]图8为N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的高效液相色谱图。
[0097]图9为N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的离子流图。
[0098]图10为N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的质谱图。
[0099]图11为N-羟基琥珀酰亚胺、肉豆蔻酸与N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的h-NMR谱图。 [0100]图12为N-羟基琥珀酰亚胺、肉豆蔻酸与N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的13C-NMR谱图。
[0101] 图13为N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的高效液相色谱图。
[0102] 图14为N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的离子流图。
[0103] 图15为N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的质谱图。
[0104]图16为N-羟基琥珀酰亚胺、棕榈酸与N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的1H-NMR谱图。
[0105]图17为N-羟基琥珀酰亚胺、棕榈酸与N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的13C-NMR谱图。
[0106] 图18为N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的高效液相色谱图。
[0107] 图19为N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的离子流图。
[0108] 图20为N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的质谱图。
[0109] 图21为具有不同烷基辄合度的烷基-酪蛋白酸钠衍生物的疏水性指数结果。
[0110]图22为姜黄素 (A)、荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子(B)和荷载姜黄素的棕榈烷 基-酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38% ) (C)的水分散图。
[0111]图23为1.05mg荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子(A)和1.05mg荷载姜黄素的棕榈 烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38% )(B)冻干再分别复溶于 0.5ml相同体积的双蒸水中的水分散结果。
[0112]图24A为荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子(磷钨酸染色后）；图24B为荷载姜黄素 的棕榈烷基-酪蛋白酸钠纳米粒子(未染色，棕榈烷基链的辄合度为7.38%)的电镜照片。
[0113] 图25为姜黄素(a)、棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物(b)、姜黄素与棕榈烷基辄 合的酪蛋白酸钠衍生物(烷基链辄合度为7.38%)的物理混合物(c)和荷载姜黄素的棕榈烷 基辄合的酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38% ) (d)的DSC谱图。
【具体实施方式】
[0114] 本发明人经过长期而深入的研究，通过在水溶性可食用蛋白表面改性辄合疏水性 的非极性烷基链，首次制备得到一种具有优异自组装性能和负载脂溶性活性成分性能的经 改性的蛋白。具体地，本发明人通过改性调整所述水溶性可食用蛋白中的亲水性和疏水性 基团的比例，得到一种可与脂溶性活性成分充分作用，进而可有效负载所述脂溶性活性成 分的经改性的蛋白。所述经改性的蛋白的制备方法具有反应条件温和、反应效率高、工艺简 单、产物易分离、无有害化学物残留、无安全问题等特点，可广泛应用于各种蛋白（特别是可 食用蛋白）的改性中。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0115] 经改性的蛋白
[0116] 具体地，本发明提供了一种经改性的蛋白或其盐，所述经改性的蛋白包括：
[0117] 可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有经修饰的赖氨酸残基和/或经 修饰的N端氨基；
[0118] 其中所述的"经修饰的"指赖氨酸残基侧链上的ε-氨基或所述蛋白的N端氨基NH2中的氢原子被非极性烷基链取代基修饰，所述非极性烷基链为直链或支链的C12-C30的烷 基。
[0119] 在另一优选例中，所述非极性烷基链共价辄合于所述赖氨酸残基侧链上的ε-氨基 和/或蛋白质的Ν端的氨基。
[0120] 在另一优选例中，所述的可食用蛋白为水溶性蛋白。
[0121]在另一优选例中，所述的水溶性蛋白指在25°C时，在水中的溶解度2 5000mg/L，优 选为6000-10000mg/L。
[0122] 在另一优选例中，所述经改性的蛋白的分子量为75000_375000Da，较佳地为 15000-25000Da〇
[0123] 在另一优选例中，所述可食用蛋白包括(但并不限于）：酪蛋白、大豆蛋白、乳清蛋 白、或其组合。
[0124] 在另一优选例中，所述可食用蛋白的盐包括(但并不限于）：钠盐、钙盐、钾盐、或其 组合。
[0125] 在另一优选例中，lmol所述可食用蛋白含有8_16mol赖氨酸残基侧链上的ε-氨基， 较佳地10-14mo 1，更佳地12.14mo 1。
[0126] 在另一优选例中，所述非极性烷基链为直链或支链的C14-C26的烷基，较佳地为直 链或支链的C16-C22的烷基。
[0127] 在另一优选例中，所述非极性烷基链为饱和的或不饱和的烷基，优选为饱和的烷 基。
[0128] 在另一优选例中，所述非极性烷基链中烷基为经取代或未经取代的烷基。
[0129] 在另一优选例中，所述取代指所述烷基中的氢原子被选自下组的基团取代:羟基、 CN、羧基、-NH2、或其组合。
[0130] 在本发明中，所述经改性的蛋白中，所述非极性烷基链的辄合度为5-15%，且所述 辄合度C的计算公式如下式F1或F2:
[0131] C=(Kl+Nl)/(Kaii+l) X100% (F1)
[0132] 式中，
[0133] K1为可食用蛋白中所述经修饰的赖氨酸残基侧链上的ε_氨基的数目；
[0134] Ν1为可食用蛋白中所述经修饰的Ν端氨基的数目；
[0135] Kaii为可食用蛋白中赖氨酸残基侧链上的ε-氨基的总数。
[0136] C = y/((Miysine+l) ·χ)Χ100% (F2)
[0137] 式中，y是辄合到可食用蛋白中非极性烷基链的摩尔数，Mlysine是每摩尔可食用蛋 白中赖氨酸的摩尔数，X是经改性的可食用蛋白的摩尔数。
[0138] 在另一优选例中，所述经改性的蛋白中，所述非极性烷基链的辄合度为5.5-13%， 较佳地为6-12 %，更佳地为6.5-10 %。
[0139] 在本发明中，所述经改性的蛋白具有式I所示结构：
[0140]
[0141] 式中，
[0142] R为非极性烷基链取代基 [0143] Pr为可食用蛋白；
[0144] 其中，一个Pr上可连接有一个或多个R-C0-NH-基团。
[0145] 在本发明中，所述经改性的蛋白的疏水性指数大于未经改性的可食用蛋白的疏水 性指数。
[0146] 在另一优选例中，所述经改性的蛋白的疏水性指数为20-150，较佳地20-70，更佳 地为20-50。
[0147] 在另一优选例中，所述可食用蛋白（即未经改性的可食用蛋白）的疏水性指数为 10-22〇
[0148] 在另一优选例中，所述疏水性指数是采用ANS荧光检测法测定得到。
[0149] 典型地，在本发明中，首先将不同碳链链长的脂肪酸与N-羟基琥珀酰亚胺反应，利 用二环己基碳二亚胺(DCC)的缩合作用，合成N-琥珀酰亚胺酯；随后在一定的pH条件下，将 N-琥珀酰亚胺酯与市售的酪蛋白酸钠反应，得到烷基辄合的酪蛋白酸钠。
[0150] 应理解，在本发明中，通过在所述亲水性强的水溶性蛋白表面改性辄合疏水性的 非极性烷基链，从而改变了蛋白结构中亲水性和疏水性基团的比例，进而直接影响蛋白的 自组装性及其用作食品载运体系的可能性。
[0151]研究表明：本发明所得棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠的自组装形成纳米粒子并包载 疏水性姜黄素的能力明显优于未修饰的酪蛋白酸钠，且其包封能力与烷基辄合度的大小有 关。
[0152]经改性的蛋白的制备方法
[0153] 本发明还提供了一种所述经改性的蛋白或其盐的制备方法，包括步骤：
[0154] 1)提供第一混合液，所述第一混合液包含未经改性的可食用蛋白、N-琥珀酰亚胺 酯和任选的第一溶剂；
[0155] 2)在搅拌条件下，所述第一混合液反应得到第二混合液；
[0156] 3)离心处理步骤2)所得第二混合液，取上清液；
[0157] 4)透析处理步骤3)所得上清液，得到所述经改性的蛋白。
[0158] 在另一优选例中，在步骤4)之后还任选地包括如下步骤：
[0159] 5)冷冻干燥前述步骤所得产物。
[0160] 在另一优选例中，所述第一混合液的pH为7.5-11，较佳地为9-10。
[0161 ]在另一优选例中，所述N-琥珀酰亚胺酯为直链或支链的C13-C31的脂肪酸与N羟基 琥珀酰亚胺的缩合产物。
[0162] 在另一优选例中，所述N-琥珀酰亚胺酯包括(但并不限于）：N-琥珀酰亚胺-辛酸 酯、N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯、N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯、N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯、N-琥珀 酰亚胺-硬脂酸酯、N-琥珀酰亚胺-花生酸酯、或其组合。
[0163] 在另一优选例中，所述第一溶剂包括(但并不限于）：水、DMS0、DMF或其组合。
[0164] 在另一优选例中，所述第一溶剂为(a)水与（b)DMS0和/或DMF的混合溶剂，其中体 积比为 70-99:30-1。
[0165] 在另一优选例中，所述的第一混合液中含有包括(但并不限于）下组的缓冲剂:碳 酸钠-碳酸氢钠、磷酸氢钠-氢氧化钠、或其组合。
[0166] 在另一优选例中，所述第一混合液中，所述未经改性的可食用蛋白和所述N-琥珀 酰亚胺酯的摩尔比为1:1.2-125，较佳地为1:2.4-100，更佳地为1:5-20。
[0167] 在另一优选例中，所述第一混合液中，所述未经改性的可食用蛋白中赖氨酸残基 侧链上的ε -氨基和所述N-琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:0.1 -10，较佳地为1:0.15-8，更佳地 1:0·2_5 〇
[0168] 在另一优选例中，步骤2)所述反应的反应温度为15-40°C。
[0169] 在另一优选例中，步骤2)所述反应的反应时间为0.5_3h。
[0170] 在另一优选例中，步骤3)所述离心处理的速度为5000-20000rpm，较佳地8000- 15000rpm〇
[0171 ] 在另一优选例中，步骤3)所述离心处理的时间为3-20min。
[0172] 在另一优选例中，步骤4)所述透析处理所用透析袋的截留分子量为3000_5000Da。
[0173] 在另一优选例中，步骤4)所述透析处理的处理时间为10_60h。
[0174] 在本发明中，通过控制酪蛋白酸钠与N-琥珀酰亚胺酯的用量比，可以控制所得经 改性的蛋白中烷基链辄合度的大小。
[0175] 在上述经改性的蛋白的制备方法中，由于N-琥珀酰亚胺基团只与非质子化的氨基 发生反应，为了确保氨基处于非质子化状态，所述改性反应在pH为7.5-11下进行。
[0176] 在上述经改性的蛋白的制备方法中，所述离心处理的目的在于除去未反应的N-琥 珀酰亚胺酯及其水解产物；所述透析处理的目的在于除去溶解N-琥珀酰亚胺酯的溶剂 (DMS0或DMF)、以及溶解蛋白的缓冲盐。
[0177] 应理解，本发明的改性方法虽然基于酪蛋白酸钠，但本改性方法同样适用于酪蛋 白的其它盐和其它可食用蛋白或相应的盐。
[0178]应理解，本发明的实验结果主要是将非极性烷基链辄合到蛋白中，形成烷基辄合 的酪蛋白酸钠，但是该改性方法同样适用于将其它基团辄合到蛋白中。
[0179] 纳米粒子及其制备方法
[0180] 本发明还提供了一种纳米粒子，所述纳米粒子由所述的经改性的蛋白或其盐自组 装形成，且所述纳米粒子中任选地包含装载于其中的脂溶性活性成分。
[0181] 在另一优选例中，所述脂溶性活性成分包括(但并不限于）：黄酮类化合物、ω-3脂 肪酸、植物留醇、或其组合。
[0182] 在另一优选例中，所述黄酮类化合物包括(但并不限于）：姜黄素、橙皮苷、黄芩素、 或其组合。
[0183] 在本发明中，所述纳米粒子具有选自下组的一个或多个特征：
[0184] 1)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的水分散性好；
[0185] 2)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的粒径为10-1000nm;
[0186] 3)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的多分散指数PDIS 0.25;
[0187] 4)所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的ζ电位为_40mV~+40mV。
[0188] 在另一优选例中，所述的"水分散性好"指将0.2_5g(较佳地0.5_3g)所述纳米粒子 与100ml水混合，可形成溶液，且无肉眼可见的团聚物。
[0189] 在另一优选例中，按所述纳米粒子的总重量计，所述脂溶性活性成分的装载量为 l-10wt%，较佳地为2_8wt%，更佳地为3_6wt%。
[0190] 在另一优选例中，所述纳米粒子（或冻干再分散后的纳米粒子）的粒径为30- 800nm，较佳地为 50-600nm，更佳地为 100-500nm。
[0191] 在另一优选例中，所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子）的多分散指数PDI < 0.4，较佳地< 0.3，更佳地< 0.2。
[0192] 在另一优选例中，所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的ζ电位为-35mV~ +35mV〇
[0193] 在另一优选例中，所述复合物中被包载的脂溶性活性成分以无定形态分散在所述 载体材料(改性的蛋白或其盐）中。
[0194] 本发明还提供了一种所述纳米粒子的制备方法，包括步骤：
[0195] a)提供混合液A，所述混合液A包含所述的经改性的蛋白、任选的脂溶性活性成分 和任选的第二溶剂；
[0196] b)在搅拌条件下，所述混合液A自组装反应得到包含所述纳米粒子的混合液B;
[0197] c)透析处理步骤b)所得混合液B，得到经透析处理的混合液；
[0198] d)任选地离心处理步骤c)所得经透析处理的混合液，取上清液，制得所述纳米粒 子。
[0199] 在另一优选例中，所述第二溶剂包括(但并不限于）：水、乙醇、丙二醇、或其组合。 [0200]在另一优选例中，步骤b)所述自组装反应的反应时间为10-60min。
[0201] 在另一优选例中，步骤c)所述透析处理所用的透析袋的分子量为10_20kDa。
[0202] 在另一优选例中，步骤d)所述离心处理的速度为3000-6000rpm。
[0203] 在另一优选例中，步骤d)所述离心处理的时间为l-30min，较佳地3-15min。
[0204] 在上述制备纳米粒子的方法中，所述透析处理的目的在于去除所得反应混合液中 的所含的脂溶性溶剂;所述离心处理的目的在于去除未被负载的脂溶性活性成分。
[0205] 应用
[0206] 本发明还提供了一种所述的经改性的蛋白的用途，用于选自下组的用途：
[0207] 1)用于装载脂溶性食品活性成分；
[0208] 2)用于装载难溶性药物。
[0209] 本发明还提供了一种制品，所述制品包含所述改性蛋白或所述的纳米粒子，或由 所述改性蛋白或所述的纳米粒子制成。
[0210] 在另一优选例中，所述制品包括(但并不限于）：食品添加剂、载体、药物、食物。
[0211] 与现有技术相比，本发明具有以下主要优点：
[0212] (1)所述经改性的蛋白具有更优的亲水/疏水结构比例，进而能更有效地负载所述 脂溶性活性成分；
[0213] ⑵所述经改性的蛋白具有优异的自组装性和负载脂溶性活性成分的能力；
[0214] (3)所述经改性的蛋白的制备方法具有反应条件温和(不会对蛋白有任何破坏）、 反应效率高、工艺简单、产物易分离、无有害化学物残留等特点，可广泛应用于各种蛋白（特 别是可食用蛋白）的改性中；
[0215] ⑷所述纳米粒子冻干后复溶性良好，负载脂溶性活性成分能力强；
[0216] (5)所述纳米粒子的制备方法简单，且低能耗。
[0217] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0218] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中 所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0219] 通用测试方法 [0220]核磁共振
[0221]用d6-DMS0配置2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺、脂肪酸（辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕 榈酸)与N-琥珀酰亚胺酯溶液，分别进行1H-NMR与13C-NMR测定。
[0222]超高效液相色谱-质谱联用
[0223]用乙腈配置0.1mg/mL的N-琥珀酰亚胺酯溶液，进行超高效液相色谱-质谱测定。
[0224] 色谱条件如下:Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100X2.1mm，1.7ym)，柱温为30 °C，流动相为27%水/乙腈，流速为0.3mL/min，进样量为2yL，Waters Acquity PDA检测器在 205nm处进行检测。
[0225] 质谱条件如下：正离子模式，ESI源;毛细管电压，3. OkV;锥孔电压，10.0 kV;离子源 温度，120°C ;脱溶剂温度，450°C ;脱溶剂气流速，800.0 L/h;锥孔气流速，50.0 L/h;扫描范 围，m/z 200-600;扫描时间，0.2s。
[0226]所得数据用MassLynx 4.1软件进行分析。
[0227] 辄合度测量
[0228] 用D20配置10mg/mL的蛋白样品溶液，进行匪R测定。通过核磁谱图中甲基（0- 0.9ppm，标注为峰A)和亚甲基（1.3ppm，标注为峰B)的积分面积，定量计算出不同烷基-酪蛋 白酸钠衍生物中烷基的辄合度。
[0229] I peak A -(Misoleucine · Nisoleucine+Mleucine · Nleucine+Mvaline · Nvaline+y · Nalkyl-CH3) · X
[0230] Ipeak B = y · Nalkyl-CH2
[0231 ] SD( % ) =y/( (Miysine+1) · x) X 100
[0232] 其中Ipeak A与Ipeak B分别为核磁谱图中甲基和亚甲基的积分面积，x为经改性蛋白 的摩尔数，y为非极性烷基链的摩尔数，Nisolwine，Nl_ine，Nvaiine分别为异亮氨酸(6H)，亮氨 酸(6H)，缬氨酸(6H)与非极性烷基链(3H)中甲基的质子数，分别为非极性烷基链中亚甲基 的质子数，Misoleucine ,Μ?θ?ι。^，Mvaline and Mlysine分别为1摩尔酪蛋白酸钠中异亮氨酸 (11.73)、亮氨酸（18.39)、缬氨酸（14.61)、赖氨酸（12.14)的摩尔数。
[0233] ANS荧光检测法
[0234] ANS荧光探针的荧光量子产率及最大发射波长取决于所处环境的极性。在水溶液 中，荧光探针单独存在时，荧光量子产率很低，当结合到蛋白质等物质的疏水部位上时，荧 光强度将显著提高，从而可用于表征蛋白质的疏水性。
[0235] 分别称取10mg待测蛋白样品，将其溶于lmL磷酸缓冲液中（浓度为0.1mol/L，pH 7.0)，过夜搅拌保证样品充分溶解，然后在20000g下离心15min，得到蛋白上清液作为储备 原液，并利用Bradford法测定储备原液中蛋白的浓度。将蛋白储备液分别稀释10、20、50、 80、100倍，得到一系列稀释的蛋白样品，待用。用上述磷酸缓冲液配置100yg/mL的ANS染液， 并用0.22μπι的滤膜进行过滤。将等体积的ANS染液和一系列稀释的蛋白样品加入96孔板，25 °C下混合孵育lh。孵育结束后，利用酶标仪检测样品的荧光强度值(FI)，激发波长设为 355nm，发射波长设为460nm。将样品的FI值与蛋白浓度做线性回归，得到线性回归方程，线 性方程的斜率即为样品的疏水性指数。
[0236] 粒径、多分散性和ζ电位的测定
[0237] 基于动态光散射技术，采用马尔文粒度仪测定新鲜制得和冻干复溶后的荷载姜黄 素的烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子的水合直径、多分散性分布指数和ζ电位值。
[0238] 实验光源为4.0mW He-Ne激光，激光波长为633nm，测定角度为90°。所有测量温度 设定为25°C，在此温度下介质水的折射率和粘度分别设定为1.590和0.8904cP。每个样品重 复测定3次，取平均值。
[0239] 形貌研究
[0240] 采用透射电镜(??Μ)观察荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子和荷载姜黄素的棕榈 烷基-酪蛋白酸钠纳米粒子的形貌。
[0241 ]常规样品的制备方法如下:将一滴样品滴置于200目碳包覆的铜网上，自然干燥过 夜，然后置于透射电镜下用不同放大倍率观察其形貌。
[0242] 对于部分样品，采用磷钨酸染色后再在透射电镜下观察。染色的具体方法如下:将 样品先滴置于铜网上，自然干燥，然后将样品铜网反扣在一滴磷钨酸染液上，染色2min，待 取出干燥，即可透射电镜下观察。
[0243] DSC 研究
[0244] 采用示差扫描量热法(DSC)分析姜黄素、棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物、姜黄 素与棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物(烷基链辄合度为7.38%)的物理混合物和荷载姜 黄素的棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38%)的热行为。
[0245] 分别精确称量2mg样品放入标准铝盘中，保证良好的传热接触，采用铟用来校正仪 器参数，并用空的铝盘校准基线。测试时加入氮气为保护气体(流速20mL/min)，加热速率为 10°C/min，扫描温度范围为室温-200°C。
[0246] 实施例1N-琥珀酰亚胺酯的合成
[0247]
[0248] N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的合成
[0249] 将3.6克（25mmol)辛酸加入250mL圆底三颈瓶中，用75mL无水1，4_二氧六环溶解， 然后加入2.9克（26mmol)N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)和7.6克（37mmol)二环己基碳二亚胺 (DCC)，在室温下，N2保护下反应4h。反应完毕后，加石油醚促沉，过滤除去白色沉淀N，N-二 环己基脲(DCU)，然后使用旋转蒸发仪将滤液浓缩，得到无色油状粗酯。利用硅胶柱层析法 (洗脱液为12%乙酸乙酯/正己烷)纯化粗酯，真空干燥样品至恒重，得到3.38克无色N-琥珀 酰亚胺-辛酸酯固体。
[0250] N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的合成
[0251] 将5 · 0克（25mmol)月桂酸加入250mL圆底三颈瓶中，用75mL无水1，4-二氧六环溶 解，然后加入2.9克（26mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和7.6克（37mmol)二环己基碳二亚胺 (DCC)，在室温下，N2保护下反应4h。反应完毕后，加石油醚促沉，过滤除去白色沉淀N，N-二 环己基脲(DCU)，然后使用旋转蒸发仪将滤液浓缩，得到无色油状粗酯。利用硅胶柱层析法 (洗脱液为12%乙酸乙酯/正己烷)纯化粗酯，真空干燥样品至恒重，得到3.65克无色N-琥珀 酰亚胺-月桂酸酯固体。
[0252] N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的合成
[0253] 将5.7克（25mmol)肉豆蔻酸加入250mL圆底三颈瓶中，用75mL无水1，4_二氧六环溶 解，然后加入2.9克（26mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和7.6克（37mmol)二环己基碳二亚胺 (DCC)，在室温下，N2保护下反应4h。反应完毕后，加石油醚促沉，过滤除去白色沉淀N，N-二 环己基脲(DCU)，然后使用旋转蒸发仪将滤液浓缩，得到无色油状粗酯。利用硅胶柱层析法 (洗脱液为12%乙酸乙酯/正己烷)纯化粗酯，真空干燥样品至恒重，得到4.31克无色N-琥珀 酰亚胺-肉豆蔻酸酯固体。
[0254] N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的合成
[0255] 将6.4克（25mmol)棕榈酸加入250mL圆底三颈瓶中，用75mL无水1，4_二氧六环溶 解，然后加入2.9克（26mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和7.6克（37mmol)二环己基碳二亚胺 (DCC)，在室温下，N2保护下反应4h。反应完毕后，加石油醚促沉，过滤除去白色沉淀N，N-二 环己基脲(DCU)，然后使用旋转蒸发仪将滤液浓缩，得到无色油状粗酯。利用硅胶柱层析法 (洗脱液为12%乙酸乙酯/正己烷)纯化粗酯，真空干燥样品至恒重，得到4.32克无色N-琥珀 酰亚胺-棕榈酸酯固体。
[0256] 结果
[0257] 分别采用核磁共振仪、超高效液相色谱-质谱仪对合成后的酯进行结构表征，以确 定通过上述方法是否成功合成了 N-琥珀酰亚胺酯。
[0258] 图1为N-羟基琥珀酰亚胺、辛酸与N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的1H-NMR谱图，图2为N-羟 基琥珀酰亚胺、辛酸与N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的13C-NMR谱图，图3为N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的 高效液相色谱图，图4为N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的离子流图，图5为N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的 质谱图。
[0259] 从图1和图2可知:N-羟基琥珀酰亚胺、辛酸与N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的1H-NMR与13c-nmr的峰归属如下：
[0260] N-羟基琥珀酰亚胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0261] 辛酸,0.86 (t，3H) .13C-匪R(d6-DMS0)S174.96,34.12,31.63,29.04-28.83(2 XCH2) ,24.97,22.52, 14.40.
[0262] N-琥珀酰亚胺-辛酸酯：h-NMlK d6-DMS0) δ2 · 81 (s，4H)，2 · 65 (t，2H)，1 · 61 (m，2H)， 1.27(m，8H)，0.86(t，3H) .13C-匪R(d6-DMS0)S170.73(2 XC = 0) ,169.46,31.53,30.65， 28.69-28.38(2 XCH2), 25.90(2 XCH2), 24.76,22.46,14.39.
[0263] 从图3和图4可知:UPLC的谱图中只有一个明显的主峰，此外，我们还提取到了 N-琥 珀酰亚胺-辛酸酯的特征离子[M+Na] +峰，且相应的出峰时间与UPLC图谱中的一致。
[0264] 从图5的质谱图中，我们也可以看到N-琥珀酰亚胺-辛酸酯的[M+Na]+和[M+H]+峰。
[0265] 图6为N-羟基琥珀酰亚胺、月桂酸与N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的1H-NMR谱图，图7为 N-羟基琥珀酰亚胺、月桂酸与N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的13C-NMR谱图，图8为N-琥珀酰亚胺- 月桂酸酯的高效液相色谱图，图9为N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的离子流图，图10为N-琥珀酰 亚胺-月桂酸酯的质谱图。
[0266] 从图6和图7可知:N-羟基琥珀酰亚胺、月桂酸与N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的1H-NMR 与13c-nmr的峰归属如下：
[0267] N-羟基琥珀酰亚胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0268] 月桂酸,2.18(t，2H)，1.48(m，2H)，1.26(m，16H)， 0.86 (t, 3H) ,13C-NMR(d6-DMS0)5174.93,34.12,31.79,29.70-28.90(6 XCH2) ,24.97, 22.59.14.40.
[0269] N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯 2H) ,1.31 (m,16H) ,0.86( t,3H) ,13C-NMR(d6-DMS0) 5170.23( 2 XC = 0) ,168.96,31.30, 30.17,29.13-28.62(4XCH2),28.52,28.00,25.42(2XCH2),24.28,22.11,13.94.
[0270] 从图8和图9可知:UPLC的谱图中只有一个明显的主峰，此外，我们还提取到了 N-琥 珀酰亚胺-月桂酸酯的特征离子[M+Na] +峰，且相应的出峰时间与UPLC图谱中的一致。
[0271] 从图10的质谱图中，我们也可以看到N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯的[M+Na]+峰。
[0272] 图11为N-羟基琥珀酰亚胺、肉豆蔻酸与N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的匪R谱图， 图12为N-羟基琥珀酰亚胺、肉豆蔻酸与N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的13C-NMR谱图，图13为N- 琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的高效液相色谱图，图14为N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的离子流 图。图15为N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的质谱图。
[0273] 从图11和图12可知：N-羟基琥珀酰亚胺、肉豆蔻酸与N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯 的1H-NMR与13C-NMR的峰归属如下：
[0274] N-羟基琥珀酰亚胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0275] 肉豆蔻酸：1!1-匪1?((16-0150)311.96(8，1!1)，2.18(七，2!1)，1.48(111，2!1)，1.26(111， 20H)，0.85(t，3H).13C-NMR(d6-DMS0)Sl74.92,34.12,31.80,29.68-29.00(8XCH 2) ,24.97， 22.59.14.40.
[0276] N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯：七-匪以d6-DMS0)δ2 · 81 (s，4H)，2 · 65(t，2H)，1 · 59(m， 2H) ,1.29(m,20H) ,0.85( t,3H). 13C-NMR(d6-DMS0)5l70.71(2 XC = 0) ,169.44,31.79, 30.65,29.60-29.15(6XCH2),29.00,28.49,25.90(2XCH2),24.76,22.59,14.42.
[0277] 从图13和图14可知:UPLC的谱图中只有一个明显的主峰，此外，我们还提取到了 N- 琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的特征离子[M+Na] +峰，且相应的出峰时间与UPLC图谱中的一致。
[0278] 从图15的质谱图中，我们也可以看到N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯的[M+Na]+峰。
[0279] 图16为N-羟基琥珀酰亚胺、棕榈酸与N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的1H-NMR谱图，图17 为N-羟基琥珀酰亚胺、棕榈酸与N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的13C-NMR谱图，图18为N-琥珀酰亚 胺-棕榈酸酯的高效液相色谱图，图19为N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的离子流图。图20为N-琥 珀酰亚胺-棕榈酸酯的质谱图。
[0280] 从图16和图17可知:N-羟基琥珀酰亚胺、棕榈酸与N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的1H- NMR与13C-NMR的峰归属如下：
[0281 ] N-羟基琥珀酰亚胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0282] 棕榈酸,2.18(t，2H)，1.47(m，2H)，1.25(m，24H)， 0.85(t，3H).13C-Mffi(d6-DMS0)Sl74.90,34.12,31.81，29.7h28.99(10XCH2)，24.97， 22.60,14.39.
[0283] N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯：4-^^((16-01^0)52.80(8,411),2.65(1211),1.61(111, 2H) ,1.29(m,24H) ,0.85( t,3H). 13C-NMR(d6-DMS0) 5170.74(2 XC = 0) ,169.47,31.78, 30.65,30.01-28.28( 10 XCH2), 25.91 (2 XCH2), 24.76,22.58,14.44.
[0284] 从图18和图19可知:UPLC的谱图中只有一个明显的主峰，此外，我们还提取到了 N- 琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的特征离子[M+Na] +峰，且相应的出峰时间与UPLC图谱中的一致。
[0285] 从图20的质谱图中，我们也可以看到N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯的[M+Na]+峰。
[0286] 实施例2烷基-酪蛋白酸钠衍生物的合成
[0287]
[0288] 用0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.0)配置5mg/mL酪蛋白酸钠溶液，过夜磁力搅拌，制得酪 蛋白酸钠溶液。用DMS0分别溶解N-琥珀酰亚胺-辛酸酯和N-琥珀酰亚胺-月桂酸酯，用DMF分 别溶解N-琥珀酰亚胺-肉豆蔻酸酯和N-琥珀酰亚胺-棕榈酸酯，分别配置浓度为0.084mol/ mL的N-琥珀酰亚胺酯溶液。将酪蛋白酸钠中赖氨酸ε-ΝΗ2与N-琥珀酰亚胺酯按照不同摩尔 比（1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1 :4、1:5)进行投料，以58/滴的滴速，分别将^琥珀酰亚胺酯溶 液滴加到酪蛋白酸钠溶液体系中，25 °C下搅拌lh。反应结束后，将体系在lOOOOrpm离心速度 下离心10min，取上清，再用透析袋(截留分子量3500Da)在双蒸水中透析48h去除DMS0或DMF 与缓冲盐后，冷冻干燥，得到辛烷基-酪蛋白酸钠(C8-NaCas)、月桂烷基-酪蛋白酸钠(C12- NaCas)、肉豆蔻烷基-酪蛋白酸钠(C14-NaCas)和棕榈烷基-酪蛋白酸钠(C16_NaCas)样品， 并保存于4°C待用。
[0289] 结果
[0290] 计算不同投料比下合成得到的烷基-酪蛋白酸钠衍生物中烷基链的辄合度，结果 如表1所示。
[0291] 表1
[0292]
[0293] 从表1可以看出，随着酪蛋白酸钠中赖氨酸残基ε-ΝΗ2/Ν_琥珀酰亚胺酯摩尔投料 比的提尚，烷基辄合度整体呈现不断增加的趋势，可是当投料比从1:4提尚至1:5时，烷基辄 合度值变化不大。
[0294] 此外，我们还发现烷基链长对于烷基辄合度有明显影响。在相同投料比情况下，短 烷基链明显更容易辄合到蛋白分子中，相应的烷基辄合度值也更大。这可能是由于烷基链 越短，相应的空间位阻也较小，越容易进攻蛋白赖氨酸残基中的氨基的原因。
[0295] 采用ANS荧光检测法测定未修饰的酪蛋白酸钠 (NaCas)和改性的酪蛋白酸钠衍生 物的疏水性指数(surface hydrophobicity index)。
[0296] 图21为具有不同烷基辄合度的烷基-酪蛋白酸钠衍生物的疏水性指数结果。
[0297] 表2为未修饰的酪蛋白酸钠(NaCas)和不同投料比下合成得到的烷基-酪蛋白酸钠 衍生物的疏水性指数结果。
[0298] 表 2
[0299]
[?-υ」 从团ζι珀甘衣zb」以有m日权丁木修τ巾tw酣茧η阪土佰双，阮番-酣茧 白酸钠衍生物的疏水性指数均有提高，而且随着烷基辄合度的提高，烷基-酪蛋白酸钠衍生 物的疏水性指数也呈统计学意义上的增大。
[0301] 实施例3纳米粒子的制备
[0302]用双蒸水分别配置2mg/mL酪蛋白酸钠和棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物(烷基 链辄合度为7.38%)溶液。用100%乙醇溶解姜黄素，配置11^/1^的姜黄素醇溶液。将0.2 1^ 上述姜黄素醇溶液滴加至2mL蛋白溶液中，磁力搅拌30min后，装入透析袋（截留分子量 15000Da)，置于双蒸水中透析过夜去除乙醇。观察透析后袋中样品的状态，并在4500rpm下 离心5min，取上清液，制得荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子和荷载姜黄素的酪蛋白酸钠 衍生物纳米粒子。
[0303] 结果 [0304]水分散结果
[0305]在搅拌条件下，将0.25mg姜黄素、5. lmg荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子或荷载 姜黄素的棕榈烷基-酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38%)分别溶于5ml水 中，搅拌2h。
[0306]图22为搅拌后所得姜黄素 (A)、荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子(B)和荷载姜黄 素的棕榈烷基-酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38% ) (C)的水分散图。 [0307]从图22可以看出，将姜黄素加入水中后，大多数的姜黄素都沉于瓶底(如A所示）， 这主要是由于姜黄素水溶解性很差导致的；而酪蛋白酸钠 (NaCas)和棕榈烷基-酪蛋白酸钠 衍生物(C16-NaCas，以辄合度为7.38%的样品为例)纳米粒子则均可有效地包封姜黄素，形 成均一的黄色纳米粒体系(如B和C所示）。
[0308] 冻干复溶
[0309] 将新鲜制得的荷载姜黄素的棕榈烷基-酪蛋白酸钠纳米粒子（烷基链辄合度为 7.38%)放置于-80°C超低温冰箱中过夜预冻，然后迅速放入冻干机中冻干48h，得到冻干粉 末状样品。将冻干粉末状样品再次复溶到相同体积的双蒸水中，用涡旋振荡仪振荡2min后 室温静置、观察体系的状态，并用数码相机拍照。
[0310] 冻干复溶后的水分散结果
[0311] 图23为0.51mg荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子(A)和0.51mg荷载姜黄素的棕榈 烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38% ) (B)分别冻干再分别复溶 于0.5ml相同体积的双蒸水中的水分散结果。
[0312] 从图23可以看出，荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子的复溶性不太好，管底和管 壁上均出现了明显的黄色聚集体，而荷载姜黄素的棕榈烷基-酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子 却能在水中复溶的很好，形成均一的黄色体系，肉眼未见明显的聚集体。荷载姜黄素的酪蛋 白酸钠纳米粒子复溶性不好的原因可能是由于酪蛋白酸钠分子结构中亲水基团较多，其与 疏水性姜黄素的疏水作用不够强导致的。
[0313] 水合直径、多分散性指数和ζ-电位值结果
[0314] 表3为新鲜制得和冻干复溶后的荷载姜黄素的烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物纳米 粒子的水合直径、多分散性指数和ζ_电位值结果。
[0315] 表3
[0316]
[0317] 从表3可以看出：荷载姜黄素的NaCas纳米粒子的粒径大小为210.73nm，粒径分布 呈单分散分布(PDI = 0.13)，纳米粒子表面电位为-30.56mV。与之相比，荷载姜黄素的C16- NaCas纳米粒子粒径值却稍有增大，且随着棕榈烷基辄合度的增加，粒径值不断增加，从 234· 20nm(C16-NaCas-5 · 94% )增加至274· 57nm(C16-NaCas-l 1 · 84% )，粒径分布未发生很 大的改变，仍呈单分散分布(PDI 2 0.25)。粒径增大的现象可能是由于烷基链的辄合度增大 使蛋白纳米粒子的疏水核增大导致的，而且粒径增大趋势与烷基链辄合度增大的趋势相 关。C16_NaCas纳米粒的ζ-电位值也在_30mV左右，并未与NaCas纳米粒子有较大差异。
[0318] 同时，从表3还可以看出：荷载姜黄素的三种C16_NaCas纳米粒的粒径值分别为 227 · 36nm(C16-NaCas-5 · 94% )、289 · 86nm(C16-NaCas-7 · 38% )和346.40腦（(：16-他〇&8- 11 · 84% )，相应的粒径分布值分别为0 · 18(C16-NaCas-5 · 94% )、0 · 23(C16-NaCas-7 · 38% ) 和0 · 45(C16-NaCas-l 1 · 84% )，相应的ζ-电位值分别为-28.7〇11^((：16-他〇&8-5.94%)、- 25 · 90mV(C16-NaCas-7 · 38% )和-24· 36mV(C16-NaCas-l 1 · 84% )。
[0319] 对比复溶前纳米粒子相应的数据，可以看出：复溶后棕榈烷基取代度为11.84%的 蛋白纳米粒子的粒径大小和分散性指数均有较大的增加，这可能是由于较多疏水烷基辄合 到蛋白结构中，降低了蛋白形成纳米粒子的水分散性。
[0320]形貌学结果
[0321]图24A为荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子(磷钨酸染色后）的电镜照片；图24B为 荷载姜黄素的棕榈烷基-酪蛋白酸钠纳米粒子(未染色，棕榈烷基链的辄合度为7.38 % )的 电镜照片。
[0322]当按照常规样品制备方法制样后，电镜下观察上述两种样品后发现：电镜下不能 很好地观察到荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子，电镜视野下仅观察到一层蛋白膜;而对 于荷载姜黄素的棕榈烷基-酪蛋白酸钠纳米粒子，电镜下却能较方便地观察到分散性较好、 具有球形形貌的蛋白纳米粒子，且纳米粒的粒径大小与表3中马尔文粒度仪测得的粒径大 小相当（如B所示）。这可能是由于酪蛋白酸钠具有较好水溶性，易成膜，而其形成的纳米粒 子与铜网表面蛋白膜的衬度不够，因此无法直接观察到纳米粒子的形貌。随后，我们采用负 染色技术，用磷钨酸染色样品，然后进行观察，这次我们观察到了荷载姜黄素的酪蛋白酸钠 纳米粒子(如A所示），在荷载姜黄素的酪蛋白酸钠纳米粒子所形成的蛋白膜上隐约可见球 形的纳米粒子，但纳米粒子表面不太光滑，与膜有些相容。
[0323]对比例1姜黄素与棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物(烷基链辄合度为7.38%)的 物理混合物
[0324] 同实施例3中姜黄素与棕榈烷基-酪蛋白酸钠衍生物的混合质量比，制备姜黄素与 棕榈烷基-酪蛋白酸钠衍生物(烷基链辄合度为7.38 % )的干粉物理混合物。
[0325] 图25为姜黄素(a)、棕榈烷基辄合的酪蛋白酸钠衍生物(b)、姜黄素与棕榈烷基辄 合的酪蛋白酸钠衍生物(烷基链辄合度为7.38%)的物理混合物(c)和荷载姜黄素的棕榈烷 基辄合的酪蛋白酸钠衍生物纳米粒子(烷基链辄合度为7.38% ) (d)的DSC谱图。
[0326] 从图25可以看出：简单的物理混合并不会改变姜黄素晶体的存在状态，而荷载到 蛋白纳米粒中的姜黄素却是以无定形状态存在的。
[0327] 实施例4纳米粒子的制备
[0328] 同实施例3,区别在于:所述纳米粒子中荷载的脂溶性活性成分为橙皮苷。
[0329] 结果
[0330] 得到类似于实施例3中的结果。相比未改性的酪蛋白酸钠，棕榈烷基-酪蛋白酸钠 衍生物具有更优的复载脂溶性橙皮苷的能力。
[0331]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种经改性的蛋白或其盐，其特征在于，所述经改性的蛋白包括： 可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有经修饰的赖氨酸残基和/或经修饰 的N端氨基； 其中所述的"经修饰的"指赖氨酸残基侧链上的ε-氨基或所述蛋白的N端氨基N此中的氨 原子被非极性烷基链取代基修饰，所述非极性烷基链为直链或支链的C12-C30的烷基。2. 如权利要求1所述的经改性的蛋白，其特征在于，所述经改性的蛋白中，所述非极性 烷基链的辆合度为5-15%，且所述辆合度C的计算公式如下式F1或F2: C=化 l+Nl)/(Kaii+l)X100% 化 1) 式中， K1为可食用蛋白中所述经修饰的赖氨酸残基侧链上的ε-氨基的数目； Ν1为可食用蛋白中所述经修饰的Ν端氨基的数目； Kail为可食用蛋白中赖氨酸残基侧链上的ε-氨基的总数； C = y/((Miysine+l) · x)X100% (F2) 式中，y是辆合到可食用蛋白中非极性烷基链的摩尔数，Mlysine是每摩尔可食用蛋白中 赖氨酸残基的摩尔数，X是经改性的可食用蛋白的摩尔数。3. 如权利要求1所述的经改性的蛋白，其特征在于，所述经改性的蛋白具有式I所示结 构：式中， R为非极性烷基链取代基 化为可食用蛋白； 其中，一个Pr上可连接有一个或多个R-CO-NH-基团。4. 如权利要求1所述的经改性的蛋白，其特征在于，所述经改性的蛋白的疏水性指数大 于未经改性的可食用蛋白的疏水性指数。5. -种纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子由权利要求1所述的经改性的蛋白或其盐 自组装形成，且所述纳米粒子中任选地包含装载于其中的脂溶性活性成分。6. 如权利要求5所述的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子具有选自下组的一个或多 个特征： 1) 所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的水分散性好； 2) 所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的粒径为lO-lOOOnm; 3) 所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的多分散指数PDI含0.25; 4) 所述纳米粒子(或冻干再分散后的纳米粒子)的ζ电位为-40mV~+40mV。7. -种权利要求1所述经改性的蛋白或其盐的制备方法，其特征在于，包括步骤： 1) 提供第一混合液，所述第一混合液包含未经改性的可食用蛋白、N-班巧酷亚胺醋和 任选的第一溶剂； 2) 在揽拌条件下，所述第一混合液反应得到第二混合液； 3) 离屯、处理步骤2)所得第二混合液，取上清液； 4)透析处理步骤3)所得上清液，得到权利要求1所述经改性的蛋白。8. -种权利要求5所述纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括步骤： a) 提供混合液A，所述混合液A包含权利要求1所述的经改性的蛋白、任选的脂溶性活性 成分和任选的第二溶剂； b) 在揽拌条件下，所述混合液A自组装反应得到包含权利要求5所述纳米粒子的混合液 B； C)透析处理步骤b)所得混合液B，得到经透析处理的混合液； d)任选地离屯、处理步骤C)所得经透析处理的混合液，取上清液，制得权利要求5所述纳 米粒子。9. 一种权利要求1所述的经改性的蛋白的用途，其特征在于，用于选自下组的用途： 1) 用于装载脂溶性食品活性成分； 2) 用于装载难溶性药物。10. -种制品，其特征在于，所述制品包含权利要求1所述改性蛋白或权利要求5所述的 纳米粒子，或由权利要求1所述改性蛋白或权利要求5所述的纳米粒子制成。
【文档编号】A23L33/19GK105837677SQ201610237860
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】张亚琼, 姚芳懿
【申请人】上海交通大学