一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种阶层有序大孔?介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物及其制备方法，包括：聚苯乙烯胶体晶体的合成；阶层有序大孔?介孔硅胶整体柱的合成；制备阶层有序大孔?介孔硅胶整体柱用γ?(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷修饰材料；阶层有序大孔?介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备。所合成的阶层有序大孔?介孔硅胶整体柱具有规则的宏观及微观结构，通透性强，背压低，传质动力学快。合成的牛血清白蛋白印迹聚合物，识别位点位于或接近聚合物表面，方便牛血清白蛋白分子进出印迹空穴，提高对牛血清白蛋白的选择性。阶层有序大孔?介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物对牛血清白蛋白有良好的分离性能，吸附容量可达121.6mg/g。
【专利说明】
一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及硅胶整体柱印迹聚合物，尤其涉及一种阶层有序多孔硅胶整体柱印迹聚合物及其制备方法，属于材料制备和生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]固相萃取(Solid-Phase Extract1n，SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术，主要用于样品的分离与纯化。它操作简单，省时省力，可以更有效的将分析物与干扰组分分离，广泛应用于医药、食品、化工等领域。固相萃取的分离柱通常由可控尺寸的颗粒填充。颗粒直径越小，分离的效率越高，但背压也同时上升。最近，整体柱的概念被引入分离技术中。整体柱结构可以消除颗粒柱间的空隙，从而导致分离过程中更快速的传质动力学。此外，整体柱的通透性增强，背压极低，减少了柱床的阻塞，可以选取更高的床层达到更高的分离性會K。
[0003]整体柱可以分为两类:聚合物整体柱和硅胶整体柱。聚合物整体柱在不同pH下有很好的稳定性，且具有良好的生物相容性。但它在温度和有机溶剂的影响下会收缩或膨胀。硅胶整体柱是由互联大孔的硅骨架构成的多孔棒，在骨架上有大量介孔存在。与聚合物整体柱相比，硅胶整体柱耐有机溶剂，机械强度更强，柱率更高。但硅胶整体柱中孔通常杂乱无序，孔径分布宽，造成传质的不均一性，影响柱效。
[0004]近年来，受自然界普遍存在的阶层有序孔结构(例如:硅藻，腰椎，肺)的启发，大量的研究工作者合成具有不同孔径的阶层有序材料。阶层有序大孔-介孔材料，有吸引人的规则的大孔结构，可以充当通道方便质量传输；同时具有规整的介孔结构，提供高比表面积和高孔体积。因此，阶层有序大孔-介孔材料可以使目标分子更轻松的扩散到整个双峰孔系统，并提供易于接近的结合位点，可以广泛的应用于催化，吸附和生物技术等领域。
[0005]分子印迹技术是近些年新兴的技术，它创建与模板分子形状，大小和空间结构高度一致的吸附位点，制备出的分子印迹聚合物(MIP)具有优异的机械/化学稳定性，低成本及对目标分子的高特异性，广泛应用于色谱分离，固相萃取，传感器等领域。到目前为止，许多小分子印迹聚合物已成功制备，且具有优异的性能。然而，蛋白质印迹聚合物却很少有报道，尤其是大分子蛋白质印迹聚合物。蛋白质的分子尺寸较大且具有复杂的构象，质量传递困难且缺乏选择性。为了解决这一问题，表面印迹技术应运而生。表面印迹过程中，印迹位点位于或接近MIP表面，便于目标分子进出印迹空穴。
[0006]牛血清白蛋白(BSA)是血清白蛋白之一，分子质量为66.5kDa，在生物应用及酶促反应领域应用广泛。它是蛋白质测定中常用的蛋白试剂，测量溶液中一种蛋白质的浓度。此夕卜，牛血清白蛋白与人血清白蛋白(HSA)结构相似，BSA经常作为研究HSA的模型蛋白。所以对BSA的选择性分离至关重要。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是以聚苯乙烯(PS)胶体晶体与聚(I，2_亚乙基二醇)嵌段聚(丙二醇)嵌段聚(I，2_亚乙基二醇)(P123)作为双模板剂，合成阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱(HOM)。然后以HOM为基质材料，采用表面印迹技术合成牛血清白蛋白分子印迹聚合物。合成的阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱印迹聚合物具有良好的宏观和微观结构，对BSA有良好的分离效果。
[0008]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0009]一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物，该阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物由氧化硅骨架和大孔构成，在氧化硅骨架上有均匀分布的介孔;所述大孔孔径为I?1.2μπι，大孔之间形成互相连通的结构，所述介孔孔径为6?7nm;所述印迹聚合物为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白均勾修饰在氧化娃骨架表面。
[0010]—种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤:
[0011]步骤1、聚苯乙烯胶体晶体的合成:聚苯乙烯溶于一定量的水中，聚苯乙烯与水的用量比为0.4?I g: 8mL。将溶液超声20mi η，然后自然沉降一周，小心移除上层液体，25 °C真空干燥48h，得到聚苯乙烯胶体晶体；
[0012]步骤2、阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱(HOM)的合成:一定量的正硅酸四乙酯(TE0S)，7K，盐酸，聚(1，2_亚乙基二醇)嵌段聚(丙二醇)嵌段聚(1，2_亚乙基二醇)(P123)和无水乙醇配制成为前驱体溶液，将聚苯乙烯胶体晶体加入到溶液中，浸渍lh，得到混合液A，其中盐酸浓度为2mol/L;然后将混合液A在30°C浸渍蒸发48h;将合成的块状材料置于管式炉中，在空气中以TC.π?η—1的升温速度缓慢升温，至550°C时恒温6h，得到阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱(HOM);
[0013]步骤3、制备阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱用γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷修饰材料，简称为HOM麵PS: 0.4g步骤2中所得的HOM溶于40mL无水乙醇中，然后取2mLγ_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)加入到混合溶液中，40°C反应12h;反应后将产物用无水乙醇洗涤3次，以洗脱未反应的MPS，50°C真空干燥得到MPS修饰的HOM，简称为HOMOMPS ；
[0014]步骤4、阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物(BSA-MIP)的制备:步骤3得到的HO励MPS分散于磷酸盐缓冲液中，超声lOmin，得到混合液B，将丙烯酰胺(AM)，N，N’_亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，牛血清白蛋白(BSA)加入到混合液B中，得到混合液C，对混合液C在35°C搅拌Ih，通N2，将过硫酸铵(APS)和N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)加入到溶液中，35°C反应24h;反应后，用去离子水反复洗涤5次以去除未反应的AM、APS和BSA，在25°C真空干燥;然后用500?I OOOmL含I OOmg/!的十二烷基硫酸钠(SDS)的乙酸:水溶液洗去BSA模板分子，并用去离子水洗至中性，25°C真空干燥即得阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物(BSA-MIP)。
[0015]步骤2中，制备混合液A时，所用的正硅酸四乙酯，水，盐酸，聚(I，2_亚乙基二醇)嵌段聚(丙二醇)嵌段聚(I，2_亚乙基二醇)，无水乙醇和聚苯乙烯胶体晶体的质量比为1.5?2.5g:0.9g:0.I?0.8g:1.0g:15g:0.4?Ig0
[0016]步骤4中，制备混合液B时，H0M0MPS的浓度为2.5?5mg/mL;制备混合液C时，所用的H0M0MPS，丙烯酰胺，N，N’_亚甲基双丙烯酰胺，牛血清白蛋白，过硫酸铵，N，N，N，N-四甲基乙二胺的用量比为0.05?0.1g: 35.5?71.0mg: 77mg: 10?20mg:8?10mg:1OyL0
[0017]步骤4中，所述的含10mg/!的十二烷基硫酸钠(SDS)的乙酸:水溶液中，乙酸与水的体积比为1:9。
[0018]步骤2中，所述的TE0S，其作用为硅源。
[0019]步骤2中，所述的P123，其作用为介孔模板剂。
[0020]步骤2中，所述的聚苯乙烯胶体晶体，其作用为大孔模板剂。
[0021]步骤4中，所述的磷酸盐缓冲液浓度为2011111101/1，？!1为7.0?8.0。
[0022]步骤4中，所述的H0M0MPS，其作用为基质材料。
[0023]步骤4中，所述的AM，其作用为功能单体。
[0024]步骤4中，所述的MBA，其作用为交联剂。
[0025]步骤4中，所述的BSA，其作用为模板分子。
[0026]步骤4中，所述的APS和TEMED，其作用为引发剂。
[0027]本发明的技术优点:
[0028](I)本发明合成的阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱具有规则的宏观及微观结构，通透性强，背压低，传质动力学快。
[0029](2)采用表面印迹技术合成牛血清白蛋白印迹聚合物，识别位点位于或接近聚合物表面，方便牛血清白蛋白分子进出印迹空穴，提高对牛血清白蛋白的选择性。
[0030](3)阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物对牛血清白蛋白有良好的分离性能，吸附容量可达121.6mg/go
【附图说明】
[0031]图1为实施例1中聚苯乙烯胶体晶体(曲线a)，浸渍前驱体溶液后的聚苯乙烯胶体晶体(曲线b)，HOM(曲线c)和BSA-MIP(曲线d)的红外谱图。
[0032]图2为实施例1中HOM的大孔(图a)，介孔(图b)结构和BSA-MIP(图c)的透射电镜图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
[0034]实施例1:
[0035](l)0.4g聚苯乙烯溶于8mL水中，将溶液超声20min，自然沉降一周，小心移除上层液体，25 °C真空干燥48h，得到聚苯乙烯胶体晶体。
[0036](2)2g TE0S，0.9g水，0.8g盐酸，1.0g P123和15g无水乙醇配制成为前驱体溶液，将0.4g聚苯乙烯胶体晶体加入到溶液中，浸渍lh，其中盐酸浓度为2mol/L。然后在30°C浸渍蒸发48h。将合成的块状材料置于管式炉中，在空气中以1°C.min—1的升温速度缓慢升温，至550°C时恒温6h，得到阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱(Η0Μ)。
[0037](3)0.4g步骤(2)中所得的HOM溶于40mL无水乙醇中。然后取2mL MPS加入到混合溶液中，400C反应12h。反应后将产物用无水乙醇洗涤3次，以洗脱未反应的MPS，50°C真空干燥得到MPS修饰的HOM(HOMOMPS)。
[0038](4)0.05g步骤(3)得到的H0M0MPS溶于20mL pH 7.0 20mmol/L磷酸盐缓冲液中，超声lOmin，将35.5mg AM，77mg MBA，20mg BSA加入到溶液中，35°C搅拌lh，通N2J^lOmg APS和1yL TEMED加入到溶液中，35°C反应24h反应后，用去离子水反复洗涤5次以去除未反应的AM、APS和BSA，在25°C真空干燥。然后用100mL含10mg/!的十二烷基硫酸钠(SDS)的乙酸:水(V:V，1:9)溶液洗去BSA模板分子，并用去离子水洗至中性，25°C真空干燥即得阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物(BSA-MIP)。
[0039]图1为本实施例中聚苯乙烯胶体晶体(曲线a)，浸渍前驱体溶液后的聚苯乙烯胶体晶体(曲线b)，H0M(曲线c)和BSA-MIP(曲线d)的红外谱图。从图中可以看出经过煅烧后，已看不出聚苯乙烯的峰，说明聚苯乙烯胶体晶体模板已完全去除。聚合反应后，在1730cm—1处有一个新的尖峰出现，此为羧基的特征峰，表明印迹聚合物已成功附着。
[0040]图2为本实施例中HOM的大孔(图a)，介孔(图b)结构和BSA-MIP(图c)的透射电镜图。由图可见，该阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物由氧化硅骨架和大孔构成，在氧化硅骨架上有均匀分布的介孔，阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱具有规则的互相联通的大孔结构，孔直径为I?1.2μπι。在骨架上又有均一的介孔结构，孔径为6-7nm。通过对比图c与图b，可看出来，聚合反应后，在整体柱的表面形成了一层牛血清白蛋白印迹聚合物层。
[0041 ] 实施例2:
[0042](1)0.8g聚苯乙烯溶于8mL水中，将溶液超声20min，自然沉降一周，小心移除上层液体，25 °C真空干燥48h，得到聚苯乙烯胶体晶体。
[0043](2)1.5g TE0S，0.9g水，0.lg盐酸，l.0g P123和15g无水乙醇配制成为前驱体溶液，将0.6g聚苯乙烯胶体晶体加入到溶液中，浸渍Ih，其中盐酸浓度为2mol/L。然后在30°C浸渍蒸发48h。将合成的块状材料置于管式炉中，在空气中以TC.min—1的升温速度缓慢升温，至550°C时恒温6h，得到阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱(Η0Μ)。
[0044](3)0.4g步骤(2)中所得的HOM溶于40mL无水乙醇中。然后取2mL MPS加入到混合溶液中，400C反应12h。反应后将产物用无水乙醇洗涤3次，以洗脱未反应的MPS，50°C真空干燥得到MPS修饰的HOM(HOMOMPS)。
[0045](4)0.08g步骤(3)得到的H0M0MPS溶于20mL pH 7.5 20mmol/L磷酸盐缓冲液中，超|^10mind#71.0mg AM，77mg MBA，1mg BSA加入到溶液中，35°C搅拌Ih，通N2，将8mg APS和1yL TEMED加入到溶液中，35°C反应24h反应后，用去离子水反复洗涤5次以去除未反应的AM、APS和BSA，在25°C真空干燥。然后用750mL含10mg/!的十二烷基硫酸钠(SDS)的乙酸:水(V:V，1:9)溶液洗去BSA模板分子，并用去离子水洗至中性，25°C真空干燥即得阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物(BSA-MIP)。
[0046]实施例3:
[0047](I) 1.0g聚苯乙烯溶于8mL水中，将溶液超声20min，自然沉降一周，小心移除上层液体，25 °C真空干燥48h，得到聚苯乙烯胶体晶体。
[0048](2)2.5g TE0S，0.9g水，0.4g盐酸，l.0g P123和15g无水乙醇配制成为前驱体溶液，将1.(^聚苯乙烯胶体晶体加入到溶液中，浸渍111，其中盐酸浓度为211101/1。然后在301€浸渍蒸发48h。将合成的块状材料置于管式炉中，在空气中以TC.min—1的升温速度缓慢升温，至550°C时恒温6h，得到阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱(Η0Μ)。
[0049](3)0.4g步骤(2)中所得的HOM溶于40mL无水乙醇中。然后取2mL MPS加入到混合溶液中，400C反应12h。反应后将产物用无水乙醇洗涤3次，以洗脱未反应的MPS，50°C真空干燥得到MPS修饰的HOM(HOMOMPS)。
[0050] (4)0.1Og步骤(3)得到的H0M0MPS溶于20mL pH 8.0 20mmol/L磷酸盐缓冲液中，超声1min，将50.0mg AM，77mg MBA，15mg BSA加入到溶液中，35°C搅拌Ih，通N2，将9mg APS和1yL TEMED加入到溶液中，35°C反应24h反应后，用去离子水反复洗涤5次以去除未反应的AM、APS和BSA，在25°C真空干燥。然后用500mL含10mg/!的十二烷基硫酸钠(SDS)的乙酸:水(V:V，1:9)溶液洗去BSA模板分子，并用去离子水洗至中性，25°C真空干燥即得阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物(BSA-MIP)。
【主权项】
1.一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物，其特征在于，一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物，该阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物由氧化硅骨架和大孔构成，在氧化硅骨架上有均匀分布的介孔；所述大孔孔径为I?1.2μπι，大孔之间形成互相连通的结构，所述介孔孔径为6?7nm;所述印迹聚合物为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白均匀修饰在氧化硅骨架表面。2.—种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1、聚苯乙烯胶体晶体的合成； 步骤2、阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱的合成:一定量的正硅酸四乙酯，水，盐酸，聚(I，2_亚乙基二醇)嵌段聚(丙二醇)嵌段聚(I，2_亚乙基二醇)和无水乙醇配制成为前驱体溶液，将聚苯乙烯胶体晶体加入到溶液中，浸渍lh，得到混合液A，其中盐酸浓度为2mol/L;然后将混合液A在30°C浸渍蒸发48h;将合成的块状材料置于管式炉中，在空气中以1°C.min—1的升温速度缓慢升温，至550 °C时恒温6h，得到阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱； 步骤3、制备阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱用γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷修饰材料，简称为HOMOMPS ； 步骤4、阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物(BSA-MIP)的制备:步骤3得到的H0M0MPS分散于磷酸盐缓冲液中，超声1min，得到混合液B，将丙烯酰胺，N，N ’ -亚甲基双丙烯酰胺，牛血清白蛋白加入到混合液B中，得到混合液C，对混合液C在35°C搅拌lh，通N2,将过硫酸铵和N，N，N，N-四甲基乙二胺加入到溶液中，35°C反应24h;反应后，用去离子水反复洗涤5次以去除未反应的AM、APS和BSA，在25°C真空干燥；然后用500?100mL含100mg/L的十二烷基硫酸钠的乙酸:水溶液洗去BSA模板分子，并用去离子水洗至中性，25 °C真空干燥即得阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物。3.根据权利要求2所述的一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤2中，制备混合液A时，所用的正硅酸四乙酯，水，盐酸，聚(I，2_亚乙基二醇)嵌段聚(丙二醇)嵌段聚(I，2_亚乙基二醇)，无水乙醇和聚苯乙烯胶体晶体的质量比为1.5?2.5g:0.9g:0.1?0.8g: 1.0g: 15g:0.4?lg。4.根据权利要求2所述的一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤4中，制备混合液B时，H0M0MPS的浓度为2.5?5mg/mL;制备混合液C时，所用的H0M0MPS，丙烯酰胺，N，N 亚甲基双丙烯酰胺，牛血清白蛋白，过硫酸铵，N, N，N, N-四甲基乙二胺的用量比为0.05?0.1Og: 35.5 ?71.0mg: 77mg: 10 ?20mg: 8?1mg:1OyL05.根据权利要求2所述的一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述的含100mg/L的十二烷基硫酸钠的乙酸:水溶液中，乙酸与水的体积比为1:9。6.根据权利要求2所述的一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤4中所述的磷酸盐缓冲液浓度为20mmol/L，pH为7.0?8.0。7.根据权利要求2所述的一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤I中聚苯乙烯胶体晶体的合成方法为:聚苯乙烯溶于一定量的水中，聚苯乙烯与水的用量比为0.4?lg:8mL。将溶液超声20min，然后自然沉降一周，小心移除上层液体，25°C真空干燥48h，得到聚苯乙烯胶体晶体。8.根据权利要求2所述的一种阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱牛血清白蛋白印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤3中制备阶层有序大孔-介孔硅胶整体柱用γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷修饰材料的方法为:0.4g步骤2中所得的HOM溶于40mL无水乙醇中，然后取2mLy-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)加入到混合溶液中，40°C反应12h;反应后将产物用无水乙醇洗涤3次，以洗脱未反应的MPS，50°C真空干燥得到MPS修饰的Η0Μ，简称为H0M0MPS。
【文档编号】C08F222/38GK105837748SQ201610192313
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】刘燕, 刘方方, 倪良, 孟敏佳, 钟国星
【申请人】江苏大学