一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，属于生物工程技术领域。本发明是将经过4℃低温预处理的种子液，接入含有12%NaCl的发酵培养基中培养96小时，生物量比未经低温预处理的细胞有所提高。本发明方法简单、便于操作，可用于乳酸菌的发酵生产。CGMCC NO.379220100429
【专利说明】
一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，属于生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)属于乳酸菌科中的四联球菌属，广 泛存在于酱油、豆瓣和鱼酱等盐渍食品中。嗜盐四联球菌使这些传统发酵食品的色泽更加 光亮，掩盖食品咸味，促进香味成分的生成，对发酵调味品的风味起着重要作用。但是，在传 统发酵产品中，高盐环境严重抑制了菌体的生长性能和代谢活力，影响了细胞的生理活性， 使产品的品质受到严重影响。因此，提高嗜盐四联球菌在高盐条件下的存活率具有重要意 义。
[0003] 嗜盐四联球菌在食品工业中的应用，所遭遇到的胁迫环境是多重和复杂的。适应 性反应是乳酸菌常见的一种应激保护方式，当细胞处于胁迫环境中时，由一种适应性反应 所诱导的保护作用，可以保护细胞抵御更为恶劣的环境胁迫，这些反应可以用于提高乳酸 菌在胁迫条件下的存活。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种利用低温预处理提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方 法。
[0005] 所述的低温预处理条件为4°C，5_15 h。
[0006] 菌株:嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)CGMCC 3792,实验室从酱油 醪中分离，经形态、生理生化特性试验和16S rDNA测序鉴定，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所；保藏日期为2010年4月29日，保藏编号为CGMCC 3792,并分类命名为嗜盐四联球菌 (Tetragenococcus halophilus)。
[0007] 种子培养方法:种子培养基为5 g/L胰蛋白胨，5 g/L大豆蛋白东，5 g/L牛肉膏， 2.5 g/L酵母膏，0.5 g/L抗坏血酸，0.25 g/L MgS〇4.7H2〇，19 g/?β-甘油磷酸钠，pH为7.0。 取-80°C保藏的乳酸菌甘油管储存液以5% (V/V)的接种量接种于种子培养基中，30°C静置 培养24 h。
[0008] 低温预处理方法:将培养好的种子液以10000 r/min(4°C)离心5 min收集菌体，将 菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行4°C低温预处理5-15 h。
[0009] 高盐发酵培养方法:高盐发酵培养基为5 g/L胰蛋白胨，5 g/L大豆蛋白东，5 g/L 牛肉膏，2.5 8/1酵母膏，〇.5 8/1抗坏血酸，〇.258/11%3〇4.7!12〇，19 8/10-甘油磷酸钠， NaCl浓度调至为12%，pH为7.0。取经过低温预处理的种子液以5%(V/V)的接种量接种于高盐 发酵培养基中，30°C静置培养96 h。
[0010] 生物量的测定:取发酵结束后的菌悬液离心收集菌体，用无菌水洗涤3次后稀释适 当的倍数，摇匀，用TU-1901双束光紫外可见分光光度计，于600 nm处比浊测定0D值的大小。
[0011] 本发明的有益效果:本发明提供的在发酵培养基中接入经过4 °C低温预处理的种 子液，嗜盐四联球菌CGMCC 3792在高盐（12%NaCl)胁迫条件下，比对照组(未经过4°C低温预 处理)具有更好的生长性能。本发明提供一种基于低温预处理提升嗜盐四联球菌盐胁迫抗 性的方法，简单易行，可探索乳酸菌应对外界不同胁迫环境时启动自适应机制的协同作用 方式。
【具体实施方式】
[0012] 实例1:种子液未经过4°C低温预处理(对照组），T.halophilusCGMCC 3792的生长 情况(表1) 取-80 °C保藏的甘油储存液以5%的接种量接种于种子培养基中，30 °C静置培养24h至对 数中后期（以下简称种子液）。将种子液10000 r/min(4°C)离心5 min收集菌体，将菌体重悬 于新鲜的种子培养基中，以5%的接种量接种至高盐发酵培养基中培养96 h，测定OD600值为 2.03〇
[0013] 实例2:种子液经过4°C低温预处理5-15 h(实验组），T.halophilusCGMCC 3792的 生长情况(表1) 将种子液10000 r/min(4°c)离心5 min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中 分别进行4°C低温预处理5 h，10 h和15 h后，以5%的接种量接种至高盐发酵培养基中培养 96 h，测定OD6〇〇值分别为2.26，2.20和2.86，与对照组相比生物量分别提高了 11.3%，8.4%和 40.9%〇
[0014]表1高盐发酵培养基中菌体生物量
〇
【主权项】
1. 一种提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，包含以下步骤： (1) 低温预处理一种乳酸菌种子液； (2) 将所述乳酸菌种子液接入一种高盐发酵培养基中培养。2. 根据权利要求1所述提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，其特征在于:所述乳酸 菌为嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus)CGMCC 3792。3. 根据权利要求1所述提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，其特征在于:所述低温 预处理时间为5小时至15小时。4. 根据权利要求1所述提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，其特征在于:所述乳酸 菌的接种量为5%(V/V)。5. 根据权利要求1所述提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，其特征在于:所述乳酸 菌种子液的制备及低温预处理，包含以下步骤： (1) 种子培养基为:5 g/L胰蛋白胨，5 g/L大豆蛋白东，5 g/L牛肉膏，2.5 g/L酵母膏， 0.5 g/L抗坏血酸，0.25 g/LMgS〇4'7H20，19 g/L β-甘油磷酸钠，pH为7.0; (2) 取-80°C保藏的乳酸菌甘油管储存液，以5% (V/V)的接种量接种所述乳酸菌甘油管 储存液于种子培养基中，30°C静置培养24 h; (3) 将种子液以10000 r/min(4°C)离心5 min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养 基中，于4°C条件下预处理。6. 根据权利要求1所述提高乳酸菌在高盐条件下生物量的方法，其特征在于:所述高盐 发酵培养基制备及培养条件，包含以下步骤： (1) 高盐发酵培养基为:5 g/L胰蛋白胨，5 g/L大豆蛋白东，5 g/L牛肉膏，2.5 g/L酵母 膏，0.5 g/L抗坏血酸，0.25 g/LMgS〇4'7H20，19 g/L β-甘油磷酸钠，NaCl浓度调至12%，pH为 7.0； (2) 培养条件为：以5%(V/V)的接种量接种所述种子培养液于高盐发酵培养基中，30°C 静置培养96 h。
【文档编号】C12R1/01GK105838636SQ201510871124
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月2日
【发明人】吴重德, 何桂强, 黄钧, 周荣清
【申请人】四川大学