一种催化效率提高的n-乙酰谷氨酸激酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种催化效率提高的N?乙酰谷氨酸激酶突变体，属于生物工程领域。将来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA5?5)的N?乙酰谷氨酸激酶的基因进行定点突变，使其编码的氨基酸序列在第74位由异亮氨酸I突变为缬氨酸V。本发明所述的N?乙酰谷氨酸激酶突变体的催化效率(Kcat/Km)由野生型的513mM?1min?1提高到843mM?1min?1，是突变之前的1.64倍，并且此突变体的热稳定性也有所提高。本发明所得N?乙酰谷氨酸激酶突变体更有利于精氨酸的生产需求，为高效合成L?精氨酸奠定了基础。
【专利说明】
-种催化效率提高的N-乙醜谷氨酸激酶突变体
技术领域
[0001] 本发明设及一种催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突变体，属于生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] k精氨酸是一种碱性半必须氨基酸，它具有多种生理功能。它是合成胞浆蛋白和 核蛋白的必需氨基酸;作为唯一的氨来源参与肌酸的合成;作为尿素循环的重要中间体，在 肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力 的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及 肌下胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酷胺的合成。 因此，k精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。
[0003] N-乙酷谷氨酸激酶(N-acetyl glutamate kinase)简称熱61(，是心精氨酸合成途 径的第二个酶和关键限速酶，同时它受终产物k精氨酸的反馈抑制。在ATP的作用下，它催 化N-乙酷谷氨酸的A-COO-憐酸化从而生成心精氨酸合成的中间体N-乙酷谷氨酸憐酸。
[0004] k精氨酸生产方法有水解法和发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本 高等问题，并且存在严重的污染而不适合大规模的生产。因此，实现发酵法生产心精氨酸成 为国内外氨基酸工业的一个十分迫切的问题。目前，用来产心精氨酸的微生物菌株主要是 谷氨酸棒杆菌与纯齿棒杆菌，为提高精氨酸产量，研究者们利用DNA重组技术结合代谢工程 技术调控合成精氨酸的代谢途径，运使得精氨酸的产量大有提高。为进一步提高生产量研 究者渐渐开始将研究重点转向心精氨酸限速酶一一N-乙酷谷氨酸激酶(NAGK)，通过克隆N-乙酷谷氨酸激酶基因并导入其它菌株来表达，W及运用定点突变技术获得解除精氨酸对其 的反馈抑制，从而来提高发酵产k精氨酸的能力。然而，虽然通过克隆N-乙酷谷氨酸激酶基 因（a巧B)并导入其它菌株获得了NAGK的过量表达，但是NAGK的比酶活并不高即NAGK的催化 活性较弱，且热稳定性不好即在37°C下NAGK的半衰期为3611，而心精氨酸的发酵周期是96h。 因此，在保持N-乙酷谷氨酸激酶过量表达的基础上，提高其催化效率与热稳定性成为工业 生产的迫切需要。
[0005] 因此，本发明公开了一种催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突变体，将来源于纯 齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酷谷氨酸激酶的基因进行定点突 变，使其编码的氨基酸序列在第74位由异亮氨酸I突变为鄉氨酸V。本发明所述的N-乙酷谷 氨酸激酶突变体口 4VNAGK的催化效率(843mM-imin-i)相对于突变之前(513mM-imin-i)提高了 1.64倍，并且此突变体的热稳定性也有所提高。本发明所得N-乙酷谷氨酸激酶突变体更有 利于精氨酸的生产需求，为高效合成k精氨酸奠定了基础。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的问题是提供一种催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突变体 (NAGK)。将来源于纯齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酷谷氨酸激酶 第74位的异亮氨酸I进行定点突变，将含突变后基因的重组质粒转化进入E.COli化21进行 表达，蛋白纯化后得到催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突变体。
[0007] 编码所述突变后N-乙酷谷氨酸激酶的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示所示。
[0008] 所述突变是将第74位的异亮氨酸突变为鄉氨酸V。
[0009] 获得所述突变体的方法，是W祀T28a-argB质粒(一种高产k精氨酸的纯齿棒杆菌 SYPA5-5)为模版，设计引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变得到含有突变后基因的重组质 粒祀T28a-a巧Bmv,将其分别转化至E. COl i化21进行表达，获得突变体口4VNAGK获得所述突 变体的方法，具体地是：
[0010] (1)突变表达载体的构建
[0011] 通过分析N-乙酷谷氨酸激酶的3D结构W及同源序列的比对，确定74位的异亮氨酸 I为目的突变为点，设计突变实验，将该位点的异亮氨酸突变为鄉氨酸VdW祀T28a-argB质 粒为模版，设计引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变得到的突变基因 argBmvW及载体 祀T28a分别用EcoRI与Sail核酸内切酶进行双酶切后于16°C连接;然后将连接产物直接转 化到E. COl i JM109菌株，提取重组质粒进行测序。
[0012] (2)含突变体的基因工程菌的获得
[OOU] 制备E.coli化2UDE3)感受态，将测序正确的重组质粒祀T28a-argBi74v转化到感 受态E.COIi化21细胞中，筛选转化子。
[0014] (3)N-乙酷谷氨酸激酶活力测定
[0015] 酶活测定方法:3血反应液中含595mmol/L Tris-肥Kp册.0)，20mmol/L N-乙酷谷 氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP二钢盐，149mmol/L NH20H ?肥I及适量粗酶液。于37°C 反应化后，加入ImL反应终止液（l.Omol/L肥I含5%化CI3 ?細20,4%S氯乙酸）终止反应。 离屯、，取上清测定N-乙酷谷氨酸氧目亏酸的光吸收值A540。
[0016] 酶活力单位定义为1个国际单位化)等于每分钟内生成Uimol产物N-乙酷谷氨酸氧 月亏酸所需要的酶量。
[0017] (4)野生型和突变体的酶活与动力学常熟的测定
[0018] 将重组E. COli化21培养后破细胞，取上清即为粗酶液，将野生酶和突变酶经Ni柱 纯化后测定酶活力与蛋白浓度得到比酶活，通过改变底物N-乙酷谷氨酸(NAG)的浓度W及 运用双倒数法测得Km，Vm与Kcat的值。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1突变表达质粒的构建及重组E.COli化21菌株的获得
[0020] 根据Coirnebacterium crenatum SYPA5-5的ar浊基因序列，设计N-乙酷谷氨酸激 酶编码基因的两头引物，再根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变中间引物：
[0021 ]利用重叠延伸PCR体外扩增获得突变基因。
[0022] 用于定点突变的引物为：
[0023] Par浊 F:5'-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAG-3'（EcoRI)
[0024] Par浊 R:5 '-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG-3 '（SalI)
[00巧]Par浊I74V Fm: 5，-CGGTGGTGGACCTCAGGTTTCTGAGATGC-3 '
[00%] Par浊I74V Rm: 5 '-GCATCTCAGAAACCTGAGGTCCACCACCG-3 '
[0027]提取纯齿棒杆菌杆菌SYPA5-5基因组为模板；
[002引 PCR反应条件:95 °C预变性5min，95 °C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，30个循 环;72°C延伸5min，。将所得突变基因片段与克隆载体祀T-2&1分别用EcoRI与Sail核酸内切 酶进行双酶切，胶回收后将两者混合，加入T4连接酶，于16°C过夜连接，转化至E. COli JM109，经过氨节青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子，进行双酶切验证，将重组质粒命名 为祀T28a-a巧Bmv并送至上海生物工程公司测序。
[00巧]将测序正确的重组质粒再转化至E.COli BL2UDE3)感受态细胞，获得重组E.COli 化21菌株
[0030] 实施例2突变体N-乙酷谷氨酸激酶的表达及Ni-NTA纯化
[0031] 取冻管保藏的重组子接种至含卡那霉素 (终浓度为50iig/mL)的LB培养基中，37°C 振荡培养过夜，按1 %接种量转接，37 °C培养至OD约0.6-0.8，加人IPTG至终浓度为1mmol/L， 16°C过夜诱导表达。将过夜诱导表达的菌液于1000化/min，4°C离屯、15min，收集菌体，用 TriS-肥I (抑8.0)缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，然后经0.45皿滤膜过滤，选用表达载 体祀T-2姑中含有細i S-Tag，过Ni-NTA纯化NAGK，将获得纯的NAGK酶蛋白经SDS-PAGE分析， 检测到一条分子量约为36kDa的特异性条带，纯的NAGK酶用于蛋白浓度与酶活的测定，得到 比酶活。
[0032] 实施例3野生酶和突变酶的催化常数比较
[0033] 将上一步得到的纯酶液进行酶促反应：酶促反应总体积为3mL，含595mmol/L Tris-HCUp 服.0)，20mmol/L N-乙酷谷氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP 二钢盐， 149mmol/L N出OH ? HCI及适量粗酶液；于37°C反应化后，加入ImL反应终止液（l.Omol/L 肥I含5%化Cl3 ?細20,4%S氯乙酸)终止反应;离屯、，取上清测定N-乙酷谷氨酸氧目亏酸的光 吸收值A540。通过改变底物N-乙酷谷氨酸(NAG)的浓度W及运用双倒数法测得Km，Vm与Kcat 的值。得到的结果如表1所示:N-乙酷谷氨酸激酶突变体I74VNAGK催化效率化cat/Km)由野生 型的513mM-Vin-i提高到843mM-Vin-i，因此突变体酶的催化效率更高，更利于精氨酸的合 成。
[0034] 实施例4野生型和突变体的热稳定性比较
[0035] 为了测定野生酶和突变酶对溫度的耐受性，将已经纯化的酶于37°C水浴不同的时 间后按上述方法测残余酶活力，考察其热稳定性。将未经37°C水浴的酶活设为100%，得到 酶的热稳定性曲线。结果如表1所示:N-乙酷谷氨酸激酶突变体口 4VNAGK的热稳定性比野生 型(CgNAGK)的也有所提高。野生酶的半衰期是36h，突变体口 4VNAGK的半衰期是52h。
[0036] 本发明所述的突变突变体口 4VNAGK的催化效率相比突变之前有了明显的提高，提 高了 1.64倍，结果表明，在关键位点突变氨基酸，可W获得优于野生型的突变体，运种策略 可W广泛应用于酶学性质的改进。
[0037] 表1野生型和突变体的动力学参数及其半衰期 [00；3 引
【主权项】
1. 一种催化效率提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，其特征在于，将钝齿棒杆菌来源的 N-乙酰谷氨酸激酶第74位的异亮氨酸I突变为缬氨酸V。2. 权利要求1所述突变体的编码基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3. 权利要求1所述突变体的应用，其特征在于，将权利要求2所述的基因导入钝齿棒杆 菌中，用于改善精氨酸的合成效率;但不限于应用于改善精氨酸的合成。
【文档编号】C12N15/54GK105838689SQ201610285765
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】饶志明, 徐美娟, 张景景, 杨套伟, 张显, 葛小勋
【申请人】江南大学