一种提取mrsa基因组dna的方法
【专利摘要】本发明涉及细菌基因组提取，具体针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)提供一种基因组DNA的提取方法，利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶和核裂解液对MRSA进行裂解。所述方法包括如下步骤：(1)细菌培养：将MRSA接种液体培养基，摇床培养；(2)细菌收集：将MRSA过夜培养液离心去上清，加入EDTA重悬沉淀；(3)细菌裂解：向重悬液中依次加入溶菌酶和溶葡萄球菌酶进行孵育，孵育完成后，离心去上清，进行核裂解；(4)去除RNA与蛋白质；(5)沉淀与洗涤。本发明方法提取的基因组DNA纯度高，浓度大，能满足特定基因的鉴定和测序等研究的要求，而且省时高效，操作简单。
【专利说明】
一种提取MRSA基因组DNA的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细菌基因组提取，具体地说，涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 基因组DNA的提取。
【背景技术】
[0002] 自20世纪60年代在欧美首先发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(111的1^(^11111- resistant Staphylococcus aureus，MRSA)以来，MRSA在临床分离的葡萄球菌中的比例不 断增加，其已成为医院感染的重要病原菌，并常见其流行、暴发的报道。由于MRSA往往具有 多药耐药特征，再加上其致病性强，己成为临床抗菌感染治疗的难题之一，并成为各国研究 的热点。在奶牛养殖中也发现了 MRSA的流行，由其引起的乳房炎导致患牛产奶量严重下降， 成为牛群MRSA的感染源。MRSA感染牛很难治愈，最终导致死亡或淘汰，这对奶牛养殖业造成 了非常重大的损失，并严重威胁人类健康。
[0003] 现在针对MRSA的检测技术主要有:分子生物学方法，染色体DNA限制性内切酶指纹 图谱分析的限制性片段长度多态性方法(RFLP)，PCR方法等，这些方法的基础都是需要高质 量的细菌基因组。而且对MRSA的深入研究也非常需要得到浓度大，纯度高的MRSA基因组，现 在还没有一种专门针对MRSA的基因组提取方法。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提取MRSA基因组DNA 的方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供一种提取MRSA基因组DNA的方法，利用溶菌酶、 溶葡萄球菌酶和核裂解液对MRSA进行裂解。
[0006] 进一步地，所述方法具体包括如下步骤：
[0007] (1)细菌培养:将MRSA接种液体培养基，摇床培养；
[0008] (2)细菌收集:将MRSA过夜培养液离心去上清，加入EDTA重悬沉淀；
[0009] (3)细菌裂解：向重悬液中依次加入溶菌酶和溶葡萄球菌酶进行孵育，孵育完成 后，离心去上清，进行核裂解；
[0010] (4)去除RNA与蛋白质；
[0011] (5)沉淀与洗涤。
[0012]其中，所述溶菌酶和溶葡萄球菌酶为市售可得产品，例如，溶菌酶可购自生工生物 工程(上海)股份有限公司，溶葡萄球菌酶可购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0013 ]所述液体培养基为胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基。
[0014]进一步地，所述细菌培养具体为:将MRSA菌液加入装有胰蛋白胨大豆肉汤培养基 中，吹打混匀，放在摇床上200rpm，37 °C过夜培养。
[0015]进一步地，所述细菌裂解具体为：向重悬液中依次加入10mg/mL的溶菌酶和5mg/mL 的溶葡萄球菌酶，37°C孵育60min，孵育完成后，离心去上清，加入核裂解液80°C裂解5min;
[0016] 所述溶菌酶的加入量为步骤(2)中EDTA加入量的1/8,所述溶葡萄球菌酶的加入量 为步骤(2)中EDTA加入量的1 /12，所述核裂解液的加入量为溶菌酶的加入量的10倍。
[0017] 利用上述操作裂解细菌，可以通过溶菌酶、溶葡球菌酶以及核裂解液的裂解，使细 胞壁充分破碎裂解，释放核DNA。进一步地，所述(4)通过加入RnaseA孵育后，再加入蛋白沉 淀液冰浴离心，实现去除RNA与蛋白质。
[0018] 所述蛋白沉淀液为promegaWizard?Genomic DNA Purification kit中提供，属 市售可得产品，可购自北京照生莱博商贸有限公司。通过RnaseA和蛋白沉淀液的作用，去除 裂解后体系中的RNA与蛋白质，提高基因组DNA的纯度。
[0019] 进一步地，所述沉淀与洗涤具体为:将去除了 RNA和蛋白质的上清液加入到异丙醇 中，上下颠倒，见絮状沉淀即为DNA，离心后用70%乙醇洗涤沉淀。
[0020] 更进一步地，前述步骤中涉及离心的离心条件为13000rpm，2min-5min。
[0021]作为优选，本发明提供一个完整的最佳实施方案，具体包括如下步骤：
[0022] 1)取50yL MRSA菌液，打入装有5mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基的离心管中，吹打混 匀，放在摇床上200rpm，37 °C过夜培养；
[0023] 2)吸取lmL过夜培养物，加入灭菌离心管中，13000rpm离心2min_5min，弃上清；
[0024] 3)加入480yL pH8.0EDTA重悬沉淀，吹打混匀，再加入60yL10mg/mL的溶菌酶，最后 加入5mg/mL的溶葡萄球菌酶40yL，手弹混勾；
[0025] 4)将离心管放入金属浴中，37°C孵育60min;
[0026] 5)孵育结束后，13000rpm离心2-5min，弃上清；
[0027] 6)加入600yL核裂解液(试剂盒中）吹打混匀，80 °C裂解5min，恢复至室温；
[0028] 7)加入3yLRNaseA溶液，颠倒混匀2-5次，37°C，孵育60min;
[0029] 8)孵育结束后，加入200yL蛋白沉淀液，涡旋混匀，冰浴5min，13000rpm离心2- 5min；
[0030] 9)将离心后的上清液倒入已加入600yL异丙醇的离心管中，上下颠倒，可见絮状沉 淀即为DNA，然后13000rpm离心2min，弃上清；
[0031 ] 10)加入600yL 70% (体积分数）的乙醇，指弹清洗沉淀，13000rpm离心2min，弃上 清，即得MRSA基因组DNA。
[0032] 之后，还可接以下步骤：
[0033] 11)室温风干 10_15min，加入 100yL DNA-Rehydration solution，然后金属浴65°C 孵育lh至沉淀完全溶解；
[0034] 12)根据操作说明，用Nanodrop对提取的DNA浓度和纯度进行检测。
[0035]其中，核裂解液、DNA-Rehydration solution均为promegaWizarf⑩Genomic DNA Purification kit中提供，购自北京照生莱博商贸有限公司。Nanodrop 2000为实验室紫外 分光光度计，购自基因有限公司。
[0036]需要说明的是，上述各步骤中涉及的体积可等比例扩大或缩小，均在本发明保护 的范围之内。
[0037]本发明的有益效果在于：
[0038]本发明针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)提供一种基因组DNA的提取方法。 该方法提取的基因组DNA纯度高，浓度大，能满足特定基因的鉴定和测序等研究的要求，而 且省时高效，操作简单。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明实验例1中提取的4株MRSA菌基因组DNA图谱。
[0040] 图2为本发明实验例1中提取的4株MRSA菌MecA基因的电泳鉴定结果。
[0041 ]图3为本发明对比例1中提取的4株MRSA菌基因组DNA图谱。
[0042]图4为本发明对比例1中提取的4株MRSA菌Me cA基因的电泳鉴定结果。
[0043] 图 1 ~图 4 中，1:王 13;2:193-2;3:141-1;4 :156-1，5:阴性，M:DNA marker II。
【具体实施方式】
[0044] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 实验例1 4株MRSA菌株的基因组DNA提取：
[0048] 1、利用前述方法提取经金葡菌特异性培养基鉴定的4株MRSA菌基因组DNA电泳图 谱，如图1所示。
[0049]提取的基因组DNA样品的浓度及纯度如表1所示。0D260/280代表核酸吸收峰值与 蛋白质吸收光值的比值，以1.8-2.00为佳;0D260/230代表核酸吸收峰值与碳源物质吸收光 值的比值，等于或大于2较好。
[0050] 表1基因组DNA样品浓度及纯度信息表
[0051]
[0052]由表1可看出，所提取的基因组DNA浓度较高，从260/280和260/230两个比值看出 蛋白质和盐类污染也较少，DNA纯度较高。
[0053] 2、以前述方法提取的4株MRSA基因组DNA为模版，进行MRSA菌株的特异性基因 MecA 的鉴定，具体操作步骤如下：
[0054]设计引物序列为：
[0055] 正向引物F: 5 ' -GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3 '，
[0056] 反向引物尺：5'-〇^厶11'〇^〇厶11^1'1'111^1'0^厶-3'，
[0057]以所提取的基因组DNA为模板进行扩增，反应体系为25yL体系，具体为正向引物F lyL，反向引物R lyL，Premix Taq? 12.5yL，ddH20 8yL，模板DNA 2.5yL〇
[0058] 反应条件为：94。(：1〇111丨11;941€4〇86(3,58 1€4〇86(3,721€5〇86(3,35个循环；721€711^11 ;4°C保存;反应完成后，进行2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示。由图2可见长度为 31 Obp的清晰明亮单一的条带，鉴定为MRSA菌株的特异性基因 MecA。
[0059] 对比例1
[0060] 本对比例应用传统的煮沸提取法，即将菌液加入到生理盐水中混匀，金属浴10 0 °C，30min，离心，取上清液进行DNA提取。提取的金葡菌基因组DNA浓度及纯度如表2所示。 [0061 ] 表2煮沸法提取金葡菌基因组DNA浓度及纯度信息表
[0062]
[0063]所提取的基因组DNA的电泳图谱及按照实验例1进行MRSA菌株的特异性基因 MecA 的鉴定的电泳图谱如图3和图4所示。
[0064] 由表2和图3、图4可知，煮沸法没有对细胞壁进行充分破碎，使得提取效果并不理 想。
[0065] 通过对比可知，本发明提供的方法，通过溶菌酶、溶葡球菌酶以及核裂解液的作 用，使得细胞壁得到充分裂解，释放纯度浓度均很好的基因组DNA。
[0066] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种提取MRSA基因组DNA的方法，其特征在于，利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶和核裂解 液对MRSA进行裂解。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 细菌培养:将MRSA接种液体培养基，摇床培养； (2) 细菌收集:将MRSA过夜培养液离心去上清，加入EDTA重悬沉淀； (3) 细菌裂解：向重悬液中依次加入溶菌酶和溶葡萄球菌酶进行孵育，孵育完成后，离 心去上清，进行核裂解； (4) 去除RNA与蛋白质； (5) 沉淀与洗涤。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌裂解具体为：向重悬液中依次加 入10mg/mL的溶菌酶和5mg/mL的溶葡萄球菌酶，37°C孵育60min，孵育完成后，离心去上清， 加入核裂解液80°C裂解5min; 所述溶菌酶的加入量为步骤(2)中EDTA加入量的1/8,所述溶葡萄球菌酶的加入量为步 骤(2)中EDTA加入量的1/12，所述核裂解液的加入量为溶菌酶的加入量的10倍。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述(4)通过加入RnaseA孵育后，再加入蛋 白沉淀液冰浴离心，实现去除RNA与蛋白质。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述沉淀与洗涤具体为:将去除了 RNA和蛋 白质的上清液加入到异丙醇中，上下颠倒，见絮状沉淀即为DNA，离心后用70%乙醇洗涤沉 淀。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌培养具体为:将MRSA菌液加入装 有胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，吹打混匀，放在摇床上200rpm，37 °C过夜培养。7. 根据权利要求2~5任一项所述的方法，其特征在于，所述离心条件为13000rpm， 2min-5min〇8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤： 1) 取50yL MRSA菌液，打入装有5mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基的离心管中，吹打混匀，放 在摇床上200rpm，37 °C过夜培养； 2) 吸取lmL过夜培养物，加入灭菌离心管中，13000rpm离心2min-5min，弃上清； 3) 加入480yLpH8.0EDTA重悬沉淀，吹打混匀，再加入60yL10mg/mL的溶菌酶，最后加入 5mg/mL的溶葡萄球菌酶40yL，手弹混匀； 4) 将离心管放入金属浴中，37°C孵育60min; 5) 孵育结束后，13000rpm离心2-5min，弃上清； 6) 加入600yL核裂解液(试剂盒中）吹打混匀，80 °C裂解5min，恢复至室温； 7) 加入3yLRNaseA溶液，颠倒混匀2-5次，37°C，孵育60min; 8) 孵育结束后，加入200yL蛋白沉淀液，涡旋混匀，冰浴5min，13000rpm离心2-5min; 9) 将离心后的上清液倒入已加入600yL异丙醇的离心管中，上下颠倒，可见絮状沉淀即 为DNA，然后13000rpm离心2min，弃上清； 10) 加入600yL 70 %的乙醇，指弹清洗沉淀，13000rpm离心2min，弃上清，即得MRSA基因 组 DNA; 上述各步骤中涉及的体积可等比例扩大或缩小。
【文档编号】C12N15/10GK105838710SQ201610382596
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】俞英, 张志超, 钱梦樱, 王迪
【申请人】中国农业大学