OsPEX11基因及其蛋白在提高水稻耐盐性中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种OsPEX11基因在提高水稻耐盐性中的应用。本发明通过酵母双杂交系统(in vivo)和GST pull?down(in vitro)技术筛选并验证了与调控水稻耐盐性重要功能蛋白OsCYP2互作的下游靶蛋白OsPEX11，利用RNAi技术证明了该基因参与调控水稻盐胁迫耐受性；本发明旨在探索新的调控水稻耐盐基因，丰富水稻耐盐基因调控网络及相关信号转导途径，为水稻盐胁迫基因功能研究提供新的思路；与此同时，对揭示水稻盐胁迫调控机制和提高水稻生产力有重要的意义。
【专利说明】
OsPEX11基因及其蛋白在提高水稻耐盐性中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及分子生物学领域，尤其设及Os阳Xll基因及其蛋白在提高水稻耐盐性 中的应用。
【背景技术】
[0002] 农业用地的盐溃化日趋严重，我国约有6.7X104km2的盐溃±地(张建锋，束玉民， 刑尚军，等.盐碱地改良利用与造林技术[J].东北林业大学学报，2002,30(6) :124-129),已 成为农业可持续发展的制约因素。
[0003] 在高盐环境条件下，作物生长发育受到明显的抑制，主要表现为光合速率低，营养 生长和生殖生长缓慢，有效干物质积累低，从而严重影响结实率。盐胁迫是自然界中限制农 作物生长发育及产量的主要的非生物胁迫之一，随着生物技术的发展及广泛应用，植物耐 盐生理及分子机制的研究已取得一定进展。通过对耐盐调控途径相关的功能基因进行克 隆，并利用遗传转化，获得了一些耐盐性的转基因作物，不仅为作物抗逆育种提供了新的遗 传资源，同时对农业用地盐溃化环境有所改善，在农作物耐盐性研究W及农业用地盐溃化 改良方面展示了诱人的前景。作物抗逆研究一直是作物育种方向的一个重要目标，因此，挖 掘耐盐功能基因资源，选育高耐盐性的转基因作物品种显得尤为重要。
[0004] 植物在逆境下会积累过量的活性氧类物质，如也化等，破坏细胞膜和一些大分子， 对植物造成伤害。相应的，植物也会合成一些抗氧化酶和抗氧化剂来清除体内多余的活性 氧类物质，抗氧化酶主要包括过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氨酶(CAT)、 抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷脫甘肤还原酶(GR)等；抗氧化剂主要是还原型谷脫甘肤 (GSH)、抗坏血酸(AsA)、类胡萝h素、2-生育酪(维生素 E)、和半脫氨酸等。
[0005] 研究发现，盐胁迫下抗氧化酶活性显著升高，表明抗氧化酶活性高低与耐受程度 存在相关性（Mittova V,Tal !,Volokita M,et al.Up-regulation of the leaf mitochondrial and peroxisomal antioxidative systems in response to salt-induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii[J] .Plant Cell and Environment[J],2003,26:845-856)。盐胁 迫诱导下，拟南芥麟脂过氧化氨谷脫甘版过氧化物酶(PHGPX)表达水平较正常情况下升高 了3倍（Sugimoto M,Sakamoto W.Putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene from Arabidopsis thaliana induced by oxidative stress[J] ? Genes Genetic Systems, 1997,72:311-316);在巧橘类中也发现了类似的5葬脂过氧化氨 谷脫甘版过氧化物酶受盐胁迫诱导而大量表达，同时，超氧化物歧化酶、谷脫甘版过氧化物 酶和胞质中抗坏血酸过氧化物酶的活性也是上升的（Gueta-Dahan Y，Yaniv Z，Zilinskas BA，et al. Salt and oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt tolerance in citrus[J].Planta, 1997,203:460-469) dROS清除剂还 可清除膜脂过氧化作用产生的丙二酸，从而保护膜结构、缓解胁迫对植物造成的伤害（陈 瑶，郑海雷，肖强，等.盐度对互花米草氧化和抗氧化系统的影响[J].厦口大学学报，2005， 44(4): 576-579)。植物叶绿体中主要是利用抗坏血酸盐过氧化物酶的催化作用来清除活性 氧物质（Shi QHjZhu ZJ,Khalid AA,et al .Effects of is〇-〇smotic salt stress on the activities of antioxidative enzymes，H+-ATPase and H+-PPase in tomato plants[J] .Acta Photophysiologica SiniCa,2004,30:311-316)，其他酶活性也能参与活 性氧的清除，但不同品种间存在一定的差别。稷稻耐盐品种韭莱青在盐胁迫下根中的POD和 CAT活性强于盐敏感型品种武运稷8号，而SO巧日APX则没有显著差异，表明水稻品种之间存 在不同抗氧化酶盐胁迫响应机制（陈海燕，崔香菊，陈熙，等.盐胁迫及La 3+对不同耐盐性水 稻根中抗氧化酶及质膜H+-ATPase的影响[J].作物学报，2007,33(7): 1086-1093)。
[0006] 盐胁迫下细胞内积累过量的活性氧类物质，将导致酶类失活、蛋白质降解和膜脂 过氧化等，从而对植株造成伤害。抗氧化酶类物质能在盐胁迫下诱导表达，清除活性氧物 质，缓解胁迫伤害，如番茄中编码叶绿体内囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因化etAPX)受盐 胁迫诱导。克隆编码抗氧化酶基因通过遗传转化超表达后能显著提高转化植株的耐盐性 (Alscher RG,Erturk N,Heath LS.Role of superoxide dismutases(SODs) in controlling oxidative stress in plants[J].Journal of Experimental Botany, 2002,53:1331-1341；Wang J,Zhang H,Allen RD.Overexpression of an Arabidopsis peroxisomal ascorbate peroxidase gene in tobacco increases protection against oxidative stress.Plant and Cell Physiology,1999,40:725-732)。
[0007] 在烟草中过表达番茄LetAK(基因有助于提高烟草的耐盐能力，在盐胁迫下转基因 烟草的种子发芽率、植株的干鲜重、APX酶活性和清除此化能力都显著高于对照（孙卫红，李 风，束德峰，等.转番茄正义抗坏血酸过氧化物酶基因提高烟草耐盐能力[J].中国农业科 学，2009，42(4): 1165-1171)。烟草中编码谷脫甘肤S转移酶和谷脫甘肤过氧化物酶的基因 在过表达的情况下也能提高烟草的耐盐性，有效清除过氧化物质，提高谷脫甘肤酶和抗坏 血酸酶代谢活性，降低盐害产生的过氧化损伤（Roxas VP，Smith RK Jr，Allen ER，et 曰1.0 verexpression of glutathione S-tr曰nsfer曰se/glut曰thione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress.Nature Biotechnology,1997,15:988-991;Roxas VP,Lodhi SA,Garrett DK,et al.Stress tolerance in transgenic tobacco seedings that overexpress glutathione S-tr曰nsfer曰se/glut曰thione peroxid曰se[J].Pl曰nt Cell Physiology,2000,41:1229-1234)。从大肠杆菌中克隆的ka巧基因通过遗传转化能增强转基因水稻耐盐性，该基因编码 的过氧化氨酶活性较对照高1.5-2.5倍，且能在IOOmM化Cl胁迫下开花结实(化gamiya K， Motohashi T,Nakao K,et al.Enhancement of salt tolerance in transgenic rice expressing an Escherichi曰 coli catalase gene ,k曰tE[J]. Plant Biotechnology Report,2007,1:49-55)。
[000引目前，水稻抗氧化酶系统在耐盐生理生化方面的研究已有较多的报道，但抗氧化 酶类耐盐基因发掘和抗氧化酶基因耐盐分子机理W及相关信号转导途径的研究值得进一 步的深入研究。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种OsPEXII基因及其蛋白在提高水稻耐盐性中的应用，该OsPEXII 基因能够直接调控水稻耐盐性，蛋白OsPEXl I能够与功能蛋白OsCYP2互作，并提高水稻对盐 胁迫的耐受性。
[0010] 本发明发现了OsPEXII基因在提高水稻耐盐性中的应用，所述OsPEXII基因为 0s03g0302000〇
[0011] 具体地，所述的应用，包括:构建包含所述OsPEXl 1基因的过表达载体，通过农杆菌 介导将OsPEXII基因转入水稻细胞，培养生成水稻耐盐植株。
[0012] 所述过表达载体为pl300-Ubi。
[0013] 所述农杆菌为EHA105。
[0014] 本发明还发现了与水稻亲环素蛋白CYP2互作的蛋白OsPEXII在提高水稻耐盐性中 的应用，所述蛋白OsPEXII的编码基因为0s03g0302000,所述亲环素蛋白CYP2的编码基因为 0s02g0121300〇
[0015] 本发明通过酵母双杂交系统，从水稻cDNA文库中筛选到一个与已知耐盐功能蛋白 0SCYP2互作的下游祀蛋白，经序列同源性比对，鉴定为水稻过氧化物酶合成因子，所述蛋白 OsPEXII的编码基因为0s03g0302000,所述亲环素蛋白CYP2的编码基因为0s02g0121300。
[0016] 然后，对互作祀蛋白进行分离，提取酵母细胞的表达载体，转化大肠杆菌DH5a，利 用PGADT7载体的氨节青霉素抗性标记在LB+Amp的培养基中分离互作表达载体，送生物公司 测序，再进行序列比对，鉴定为水稻过氧化物酶合成因子(OsPEXl 1)。
[0017] 接着，通过体外pul 1-down和western blot检测，验证0sCYP2和Os阳Xll存在真实 互作，将0sCYP2和OsPEXII分别克隆至原核表达载体PGEX-4T-1和祀T28a，形成两个融合表 达载体（PGEX-4T-1中GST蛋白与0SCYP2蛋白融合表达，pET28a中Hi S蛋白与OsPEXl 1蛋白融 合表达），经GST和Hi S纯化磁珠提取GST-0SCYP2融合蛋白和Hi S-OsPEXl 1融合蛋白，利用 MagneGST Pull-Down System和His标签偶联HRP进行蛋白互作试验，经DAB染色验证GST-0SCYP2融合蛋白与化S-OsPEXl 1融合蛋白互作。
[0018] 然后，利用反向遗传学的方法，验证该基因调控水稻耐盐功能。具体包括:在200mM 氯化钢溶液处理下，观察过表达转化植株与干扰转化植株相对于野生型的盐胁迫耐受性； 结果表明，干扰转化植株相对于野生型和过表达转化植株表现出对盐胁迫更敏感的表型。 相关盐胁迫调控基因的表达结果与表型一致，其抗氧化酶活性结果也验证运一结果。
[0019] 最后，对过表达转化植株与干扰转化植株进行细胞超微结构观察。发现，在盐胁迫 处理下，野生型植株的叶绿体形态结构发生变化，少量基粒片层和类囊体呈堆叠状且不规 贝IJ;过表达植株的内囊体和叶绿体都保持相对的正常形态，而干扰植株的线粒体等细胞器 均呈现异常形态。
[0020] 本发明通过酵母双杂交系统（in vivo)和GST pull-down(in viho)技术筛选并 验证了与调控水稻耐盐重要功能蛋白0sCYP2互作的下游祀蛋白OsPEXll，旨在探索新的调 控水稻耐盐基因，丰富水稻耐盐基因调控网络及相关信号转导途径，为水稻耐盐基因功能 研究提供新的思路;与此同时，对掲示水稻盐胁迫机制和提高水稻生产力有重要的意义。
【附图说明】
[0021] 图1为酵母双杂交筛选互作蛋白；
[0022] A:SD/-T 巧-Leu-Ade-His/X-a-gal/AbA 固体培养基筛选；B:SD/-T 巧-Leu/X-a-gal 固体培养基筛选。
[0023] 图2为0sCYP2蛋白与OsPEXII蛋白的酵母一对一互作验证；
[0024] DDO/X:SD/-hp-Leu/X-a-gal;QDO/X/A:SD/-hp-Leu-Ade-His/X-a-gal/AbA;
[00 巧]AD-OsPEXI1:pGADT7+0sPEXl1;BD:pG服T7;抓-0sCYP2:pG服T7+0SCYP2。
[00%] 图3为SDS-PAGE凝胶电泳(A)及DAB染色(B)验证GST-0SCYP2融合表达蛋白；
[0027] 1:GST 蛋白；2:GST-〇sCYP2 融合蛋白；M:预染蛋白 marker。
[00 巧]图4为GST(Glutathione-S-transferase)pull-down;
[00 巧]GST:PGEX-4T-1;GST-〇sCYP2:pGEX-4T-l+0sCYP2;His-P邸11:pET28a+0sPEXl1。
[0030] 图5为To代过表达和干扰转化再生植株潮霉素筛选标记PCR检测；
[0031] M:DNA Marker F;P:pl300-RNAi;WT:野生型植株;1-4:过表达转转化植株;5-8:干 扰转化植株。
[0032] 图6为OsPEXII基因过表达及干扰植株的盐胁迫表型分析结果；
[0033] A:野生型；B :盐胁迫处理野生型；C : OsPEXl 1基因过表达植株；D :盐胁迫处理 OsPEXl 1基因过表达植株;E: OsPEXl 1基因干扰植株;F:盐胁迫处理Os阳Xl 1基因干扰植株。
[0034] 图7为过表达及干扰植株在对照(水处理)和盐胁迫处理下OsPEXII基因表达情况；
[0035] WT:野生型；OsPEXl I-OEl，0E2: OsPEXl 1基因过表达植株；OsPEXl I-RNAi 1，RNAi2: OsPEXII基因干扰植株。
[0036] 图8为盐胁迫处理对过表达及干扰植株的钢钟离子积累和生理生化的影响；
[0037] A:钢钟离子比；B:超氧化物歧化酶活性;C:过氧化物酶活性;D:过氧化氨酶活性； E:丙二醒含量;F:脯氨酸含量。
[0038] 图9为过表达及干扰植株盐胁迫相关调控基因表达情况；
[0039] A:0s服t2;l;B:0s服tl;5;C:0sLti6a;D:0sLtim3;E:0sS0Sl;F:0sWlXl;G:0sAKTl。
[0040] 图10为盐胁迫处理下对过表达及干扰植株细胞超微结构的影响；PM:质膜;CW:细 胞壁;G:基粒;PG:质体小球;MTC:线粒体。
[0041 ] A:野生型化2〇处理）；B:过表达植株化2〇处理）；C:干扰植株化2〇处理）；D:野生型 (NaCl处理）；E:过表达植株(NaCl处理）；F:干扰植株(NaCl处理）。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
[0043] 其中，下列实施例中的水稻品种'爱知旭'由杭州市农业科学研究院提供。
[0044] 实施例1
[0045] 一、酵母Y2H感受态细胞的制备和共转化
[0046] 共转化酵母表达载体pG服T7+0SCYP2和水稻pGADT7+cDNA文库表达载体至酵母菌 株Y2H，酵母感受态细胞制备及转化；
[0047] 具体步骤如下：
[004引 1)吸取化1酵母菌株Y2H菌液涂布于YPDA培养基，30°C培养3-5天；
[0049] 2)挑取2-3臟单克隆接种于31111￥?04液体培养基中，30°(：，250巧111培养8-12虹；
[00加]3)取化1转接至50ml YPDA液体培养基中，30°C，250巧m培养至ODso日达到0.15-0.3; [0051 ] 4)700g室溫离屯、5min，弃上清，重悬于100mL YPDA液体培养基中，30°C，250巧m培 养至ODso日达到0.4-0.5;
[0化2] 5)700g室溫离屯、5min，弃上清，重悬于30ml灭菌dd出0;
[0化3] 6)700g室溫离屯、5min，弃上清，重悬于 1.5ml l.lXTE/LiAc;
[0化4] 7)菌液转移至1.5ml离屯、管中，10000巧m离屯、15s，弃上清，重悬于60化1 1.1 XTE/ LiAc至冰上备用；
[0055] 8)在预冷的50ml灭菌离屯、管中依次加入化g酵母表达载体pGBKT7+0sCYP2，15iig pGADT7+cDNA文库表达载体，200yg 化astmaker Carrier DNA，600iU酵母Y2H感受态细胞；
[0056] 9)加入2.5ml PEG/LiAc，混匀后3(TC解育45min，每隔15min摇匀混合一次；
[0057] 10)加入16化1 DMSO混匀，42°C水浴20min，每隔IOmin摇匀混合一次；
[005引 11 MOOOrpm离屯、5min，弃上清，重悬于3ml YPDA Plus Medium,30°C，150巧m培养 90min；
[0059] 12)4000巧m离屯、5min，弃上清，重悬于15ml 0.9%的氯化钢溶液中；
[0060] 13)将15ml菌液按25化1/皿涂布于SD/-化p/-Leu/X-a-gal/AbA固体培养基，30°C 培养3-5天；
[0061 ] 14)挑取蓝色单克隆接种于SDAlYpALeuAAdeAHisA-Q-SaVAbA固体培养基， 30 °C培养3-5天。
[0062] 在固体筛选培养基中能生长且呈蓝色的酵母菌落，即为可能与0SCYP2蛋白存在互 作的祀蛋白（如图IA所示）。
[0063] 二、分离及鉴定阳性互作祀蛋白（体内）
[0064] 挑取上述SD/-化p/-Leu/-Ade/-His/X-a-gal/AbA固体培养基中蓝色单克隆，划线 接种至SD/-Trp/-Leu/X-a-gal固体培养基，重复2-3次，分离蓝色酵母单克隆（如图IB所 示），采用小量法提取酵母质粒巧asy Yeast Plasmid Isolation Kit,Clontech,630467)， 具体步骤如下：
[0(?日]1)挑取酵母蓝色单克隆重悬于50化1 IOmM的邸TA, IlOOOg离屯、Imin,去上清；
[0066] 2)加200iil ZYM溶液重悬菌体，再加入酶解液，轻微满旋混匀，30°C振荡培养 化r;
[0067] 3)2000g 离屯、lOmin，去上清；
[006引 4)加入25化1 YlBuffer/RNase Asolution重悬菌体；
[0069] 5)加入25化1 Y2Lysis Buffer,轻微颠倒混匀，室溫放置3min;
[0070] 6)加入30化1 Y3化utilization Buffer,轻微颠倒混匀，IlOOOg室溫离屯、5min;
[0071] 7)转移上清液至新的离屯、管中aiOOOg室溫离屯、5min;
[0072] 8)将上清液转移至化ast Plasmid Spin Column,IlOOOg室溫离屯、Imin，弃废液；
[0073] 9)加450iU Y4Wash 8证'6'，11000邑室溫离屯、3111111，弃废液；
[0074] 10)将空离屯、管IlOOOg室溫离屯、3min;
[00巧]11)吸附柱置于新的1.5ml离屯、管中，加入SOiil YE Elution Buffer,室溫静置 Imin, IlOOOg 室溫离屯、Imin;
[0076] 12)回收质粒置于-20°C保存备用。
[0077] 将上述提取的质粒转化大肠杆菌D册a,涂布与含有氨节青霉素的LB固体培养基， 利用酵母表达载体PGAD17的氨节青霉素抗性标记筛选互作表达载体，小量法提取质粒，送 生物公司测序。利用NCBI数据库进行序列同源性比对，鉴定上述序列编码的蛋白为过氧化 物酶合成因子(Peroxisomal biogenesis factor 11)。
[0078] 将分离的pGADT7+0sPEXl I质粒，与pG服T7或pG服T7+0sCYP2分别共转化酵母菌株 Y2H，酵母感受态制备及质粒转化同步骤一。
[00 巧]取 1〇化1 转化菌液涂布于 SDATrpALeuA-Q-Sa^PSDAlYpALeuAAdeAHisA-a-gal/AbA固体培养基中，30°C培养3天;结果显示，共转化酵母表达载体pG服T与PGADT7+ Os阳Xl 1的Y2H菌株只能在SD/-化p/-Leu/X-a-gal固体培养基中生长且无蓝色信号，而共转 化酵母表达载体 pG 服 T7+0SCYP2 与 pGADT7+0sPEXll 的 Y2H 菌株在 SDAlYpALeuA-Q-Sal 和 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-Hi s/X-a-gal/AbA固体培养基中均能生长且呈蓝色菌落（如图2所 示），表明0SCYP2蛋白与OsZFP蛋白存在互作。
[0080] S、GST-〇sCYP2融合蛋白分离及Western Blot
[0081 ]将0sCYP2基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-1多克隆位点，引物序列分别为GST-0sCYP2-F:CGGAATTCATGTCGAACACGAGGGTGTT(SEQ ID NO.1)和GST-〇sCYP2-R: CCGCTCGAGCTAGGAGAGCTGGCCGCAGT(SEQ ID N0.2);构建好的重组载体转化至大肠杆菌 BL21，利用GST蛋白吸附磁珠（Ma即eGST PuU-Down System,Promega,V8870)分离纯化GST 蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白，具体步骤如下：
[0082] 1)取37°C过夜培养的新鲜菌液11111，10000旨离屯、2111111，在-20°(：下冷冻15111111，室溫 下融化；
[0083] 2)加入20化1 Cell Lysis Reagent重悬混匀菌体；
[0084] 3)加入化 1 RQlRNase-Free Dnase,室溫下旋转解育30min;
[00化]4)取GST磁珠至1.5ml离屯、管中，放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并弃 置；
[00化]5)取下离屯、管并加入25化1 Ma即eGST Binding/Wash Buffer重悬混匀GST磁珠；
[0087] 6)重复2次步骤4)和5);
[0088] 7)加入 10化1 Ma即eGST Binding/Wash Buffer(含 1%BSA)重悬混匀磁珠；
[0089] 8)将20化1细菌裂解液加入磁珠溶液，室溫下轻微振荡旋转解育30min;
[0090] 9)将离屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并弃置；
[0091] 10)取下离屯、管并加入25化1 Ma即eGST Binding/Wash Buffer重悬混匀，室溫旋 转解育5min;
[0092] 11)将离屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并弃置；
[0093] 12)重复3次步骤10)和11);
[0094] 13)加入20iU Ma即eGST Binding/Wash Buffer重悬混匀备用；
[00巧]取化1上述纯化的GST蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白点样，经SDS-PGAE凝胶（浓度 12 % )电泳分离，在固定液(500ml甲醇，100mL乙酸和400ml dd此0)中固定化r;弃去固定液， 加入考马斯亮蓝染色液(450ml甲醇，1 OOml乙酸，450ml dd出0和1.6g考马斯亮蓝R-250)，常 溫下染色化r;弃去染色液，加入脱色液(50ml甲醇，70ml乙酸和880ml d地2〇)，常溫下脱色 3化r，观察拍照，GST蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白纯化结果如图3A所示。
[0096] 通过Bio-Rad电转仪将SDS-PAGE凝胶中蛋白转至PDVF膜（转膜液：3.03g Tris base，14.4g甘氨酸，200ml甲醇，880ml d地2〇)，转膜条件为330mA化r;将PVDF膜置于IOml 封闭液中（100ml PBS Buffer,5g脱脂奶粉），37°C封闭化。加入偶联HRP的GST抗体，用一抗 稀释液（1 g BSA，1 OOml洗膜液，pH 7.4)按1:1000比例稀释，常溫下解育Ihr;用洗膜液 (0.5ml Tween 20，1000ml PBS Buffer)洗膜3次，每次lOmin。最后，用辣根过氧化氨酶DAB 显色试剂盒显色，并观察拍照，GST蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白Western Blot结果如图3B所 /J、- O
[0097] 四、His-P邸11融合蛋白分离及GST化Il-Down
[009引将OsPEXII基因克隆至原核表达载体pET28a多克隆位点，引物序列分别为化3-OsPEXlI-F:CGCGGATCCATGGCCGCCGCCGCCGCCGC(SEQ ID NO.3)和His-OsPEXll-R: CCGCTCGAGGCACGAATTCCAATTCTTGT(SEQ ID N0.4);构建好的重组载体转化至大肠杆菌 BL21，利用His蛋白吸附磁珠（Ma即eGST Protein Purification System，P;romega，V8500) 分离纯化化S蛋白和化s-OsPEXll融合蛋白，具体步骤如下：
[0099] 1)取37°C过夜培养的新鲜菌液Iml于1.5ml离屯、管中aOOOOg离屯、2min，在-20°C下 冷冻15min，室溫下融化；
[0100] 2)加入lOOul 1 XF'ast&reak Cell Lysis Reagent重悬混匀菌体；
[0101] 3)加入化1 Dnase I，室溫下旋转振荡20min;
[0102] 4)加入IOiU 5M NaCl，30iU MagneHis Ni-Particles颠倒混匀 10次，室溫静置 2min;
[0103] 5)将离屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并弃置；
[0104] 6)取下离屯、管并加入 15化1 Ma即細is Binding/Wash Buffer和 15iil 5M 化Cl重 悬混匀，室溫旋转解育5min;
[0105] 7)将离屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并弃置；
[0106] 8)重复2次步骤6)和7);
[0107] 9)加入10化1 Ma即eHis Elution Buffer重悬混匀，室溫解育2min;
[0108] 10)将离屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液至新的1.5ml离屯、管中备用；
[0109] 11)分别取20山纯化的His-Os阳Xl 1融合蛋白至扣1 GST蛋白和GST-〇sCYP2融合蛋 白的固化磁珠液中；
[0110] 12)加入 15化 1 Ma即eGST?Binding/Wash Buffer和20iU 10%BSA，室溫下旋转解 育化r;
[0111] 13)将离屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并弃置；
[0112] 14)取下离屯、管并加入400]il MagneGST Binding/Wash Buffer重悬颠倒振荡混 匀，室溫静置5min;
[0113] 15)重复4次步骤13)和14);
[0114] 16)加入20iU IXSDS loading buffer重悬混匀，室溫静置5min;
[0115] 17)将离屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液至新的1.5ml离屯、管中备用。
[0116] 取扣1上述洗脱液点样，SDS-PAGE凝胶电泳和转膜方法同步骤S，封闭后加入偶联 HRP的化S抗体，洗膜及DAB显色反应方法同上，Western Blot检测结果如图4所示，表明 0sCYP2蛋白与Os阳Xl 1蛋白存在互作。
[0117] 实施例2
[0118] 一、OsPEXII基因过表达和干扰植株的盐胁迫表型分析
[0119] 为了验证Os阳Xll基因耐盐功能，将Os阳乂11基因克隆至口1300-化巧化1300-3酷1， 成功构建了该基因过表达和干扰载体;遗传表达载体导入农杆菌EHA105,水稻遗传转化试 验方法参照文南犬化iei Y,0hta S,Komari T,et al.Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of 化 e T-DNA[J].Plant Journal ,1994,6:271-282),对转化再生植株潮霉素 筛选标记进行PCR检测验证(如图5所示），获得过表达和干扰阳性转化植株。
[0120] W野生型、OsPEXII基因过表达植株和干扰植株的10天幼苗为试验材料，在添加 200mM NaCl的水培条件下，处理24小时后，野生型和Os阳Xll基因干扰植株的叶片表现出卷 缩的形态特征，且干扰植株的叶片出现部分失绿的现象;而相同条件下的OsPEXII基因过表 达植株则表现正常(如图6所示）。
[0121] 同时，对S种基因型幼苗植株的OsPEXII基因的转录水平进行巧光定量PCR分析， 内参基因引物序列和OsPEXII基因引物序列如下：
[0122] Actin-F:GACCTTGCTGGGCGTGAT(沈Q ID N0.5)
[0123] Actin-R:GTCATAGTCCAGGGCGATGT(沈Q ID N0.6)
[0124] qRT-〇sPEXll-F：GCGTCTACTACTTCCTCG(SEQ ID NO.7)
[0125] qRT-〇sPEXll-R：GACTCCAGTTTGCCGATC(SEQ ID NO.8)
[0126] 结果显示，OsPEXll基因在过表达植株和干扰植株中分别显著高于和低于野生型； 在盐胁迫诱导下，过表达植株中OsPEXII基因的转录水平显著高于野生型（如图7所示），表 明OsPEXII基因响应盐胁迫，且该基因过表达能提高转化植株盐胁迫的耐受性。
[0127] 二、OsPEXII基因过表达和干扰植株的生理生化分析
[0128] W上述盐胁迫处理下的幼苗植株为试验材料，进行相关生理生化指标测定，包括 Na7K+离子比，丙二醒(MDA)、抗氧化酶活性(ROS)和脯氨酸(Proline)。主要测定方法参照文 南犬(Munns R,Wallace PA,Teakle NL,et al.Measuring soluble ion concentrations(Na + ,K+,Cr)in salt-treated plants.Plant Stress Tolerance,Humana Press,2010,371-382；Hodges DM,DeLong JM,Forney CF,et al. Improving the thiobarbituric acid-re曰ctive-subst曰nces assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds[J].Planta,1999,207: 604-611;Dhindsa SR and Matowe !.Drought tolerance in two mosses: correlated with enzymatic defence against lipid peroxidation[J].Journal of Experimental Botany ,1981,32:79-91;Rao L,Perez D,White E.Lamin proteolysis facilitates nuclear events during 曰poptosis[J].Journ曰I of Cell Biology,1996,135:1441-1455;Aebi HXatalases[J].Journal of Clinical 化thology,1984,2:673-684;Bates L,Waldren R,Teare I.Rapid determination of free proline for water stress studies[J].Plant and Soil,1973,39:205-207)。
[0129] 在对照(水处理)条件下，化Vr离子比在野生型、OsPEXl I基因过表达和干扰植株 中没有显著差异。但在200mM化Cl胁迫处理下，野生型、过表达植株和干扰植株的钢离子和 钟离子含量均升高，且过表达植株化7K+比率显著低于野生型和干扰植株(如表1和图8A所 示)。
[0130] 表1不同处理条件下S种基因型植株中Na+和r含量
[01311
[0132] 注:相同字母代表5 %水平上无显著差异。
[0133] 进一步的盐胁迫下生理生化指标的测定，如图8B-8F所示，两个过表达植株丙二醒 的积累相对于野生型植株低了 15.39 % (OE1)和29.14% (0E2)，而SOD，POD，CAT的酶活性显 著增加(0E1:5.00，1.35和1.78倍;0E2:6.88，1.39和1.85倍）。同时，过表达植株脯氨酸的积 累与抗氧化酶活性的变化趋势一致，分别提高了 3.81倍(OEl)和4.46倍(0E2)。
[0134] W上结果从生理生化水平上表明Os阳Xll基因过表达能增加抗氧化酶活性W及脯 氨酸积累，从而降低膜脂的过氧化水平，提高转化植株的耐盐性。
[0135] =、0sPEXll基因过表达和干扰植株的相关耐盐基因表达情况分析
[0136] W上述盐胁迫处理下的幼苗植株为试验材料，对=种基因型幼苗植株的盐胁迫7 个相关基因的表达情况进行分析，内参基因引物序列同SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6,其它 基因引物序列如下：
[0137] qRT-0sWT2;l-F:TGCATTCATCACTGAGAGGAG(SEQIDN0.9)
[0138] qRT-Os服T2;1-R:GGTGCAGTTTCTGCAACCTC(SEQ ID N0.10)
[0139] qRT-Os服T1;5-F:CCCATCAACTACAGCGTCCT(沈Q ID NO.ll)
[0140] qRT-0sWTl;5-R:AGCTGTACCCCGTGCTGA(SEQIDN0.12)
[0141] qRT-〇sLti6a-F：CCTTCCAAGGTGATGGTGAA(SEQ ID NO.13)
[0142] qRT-〇sLti6a-R：CCGTCCAAAGAACCAGAAAA(SEQ ID NO.14)
[0143] qRT-OsLti化-F:GCTCCAAACCGCTTCATCTA(SEQ ID N0.15)
[0144] qRT-OsLti化-R:CAAGAATTGGAGCACTCAGGA(SEQ ID N0.16)
[0145] qRT-〇sSOSl-F:ATACTGAGTGGGGTTGTTATTGC(沈Q ID N0.17)
[0146] qRT-〇sSOSl-R：AAAGGTAAATTTCAAAAGGTACATGG(SEQ ID NO.18)
[0147] qRT-〇sNHXl-F：AATGATCACCAGCACCATCA(SEQ ID NO.19)
[014引 qRT-OsN册1-R:AAGGCTCAGAGGTGACAGGA(SEQ ID N0.20)
[0149] qRT-〇sAKTl-F：GAAACGAGCAATGCGTCAG(SEQ ID NO.21)
[0150] qRT-〇sAKTl-R:CTTCTCACACAGCGCTTCC(沈Q ID N0.22)
[0151] 结果表明，相对于野生型，钢离子转运基因（Os皿T2; I和OsHKTl; 5)的转录水平在 过表达植株和干扰植株中分别显著上调和下调（如图9A和9B所示）；另外，细胞钢离子外排 基因（OsLtiGa和OsLtiGb)，钢氨离子逆向转运基因 （OsSOSl )，液泡钢钟氨离子逆向转运基 因（OsNHXl)和钟离子转运基因（OsAKTl)的转录水平在过表达植株和干扰植株中刚好相反 (如图9C-9G所示），W上结果从分子水平上表明Os阳Xll基因具有耐盐的生物学功能。
[0152] 四、过表达植株与干扰植株细胞超微结构观察
[0153] 在对照（水处理)条件下，野生型与过表达植株的细胞器形态正常，叶绿体呈楠圆 形，基粒和基质内囊体有序排列，层状结构紧凑，叶绿体外膜完整且含有大体积的淀粉粒 (如图IOA和IOB所示）；干扰植株的叶绿体呈圆形，周围线粒体肿胀(如图IOC所示）。
[0154] 在盐胁迫处理下，野生型植株的叶绿体形态结构发生变化，少量基粒片层和类囊 体呈堆叠状且不规则(如图IOD所示）；过表达植株的内囊体和叶绿体都保持相对的正常形 态(如图IOE所示），而干扰植株的线粒体等细胞器均呈现异常形态(如图IOF所示）。
【主权项】
1.OsPEXl 1基因在提高水稻耐盐性中的应用，其特征在于，所述OsPEXl 1基因的碱基序 列为 0s03g0302000。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括:构建包含所述OsPEXl 1基因的过表达载 体，通过农杆菌介导将OsPEXll基因转入水稻细胞，培养生成水稻耐盐植株。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述过表达载体为pi 300-Ubi。4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述农杆菌为EHA105。5. 与水稻亲环素蛋白CYP2互作的蛋白OsPEXll在提高水稻耐盐性中的应用，其特征在 于，所述蛋白OsTOXll的编码基因为0s03g0302000,所述亲环素蛋白CYP2的编码基因为 0s02g0121300〇
【文档编号】A01H5/00GK105838722SQ201610317903
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】刘宏波, 崔鹏, 周伟军, 阮松林, 李兰
【申请人】浙江农林大学