表达C₃₀类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌的制作方法

表达C₃₀类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及能够合成30个碳原子(C30)的类胡萝卜素4，4′?二脱辅基链孢红素(4，4’?diaponeurosporene)重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了含有C30类胡萝卜素合成酶基因(crtm和crtn)的枯草芽孢杆菌表达质粒pMK3?crtmn(能够在枯草芽孢杆菌中表达C30类胡萝卜素合成酶Crtm和Crtn)，并成功电击转化入枯草芽孢杆菌WB800中。转化后的WB800菌体由原来的白色变为黄色。提取重组WB800中的色素成分经高效液相色谱(HPLC)鉴定为4，4′?二脱辅基链孢红素。4，4′?二脱辅基链孢红素能够刺激树突状细胞成熟，产生的细胞因子(IL?6、IL?10、IL?12p70和TNFα)量增加，并且具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力。口服能够合成4，4′?二脱辅基链孢红素的枯草芽孢杆菌可以显著降低葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎症状。这种能产4，4′?二脱辅基链孢红素的枯草芽孢杆菌有望开发成为一种预防结肠炎的益生菌。
【专利说明】表达C30类胡勃、素的重组枯草芽抱杆菌 -、技术领域
[0001] 本发明设及表达C30类胡萝h素的重组枯草芽抱杆菌，属于生物技术基因工程领域。 具体包括:C30类胡萝h素表达质粒pMK3-cd皿的构建;C30类胡萝h素的生物合成与鉴定;C30 类胡萝h素能够刺激树突状细胞成熟，产的细胞因子（化-6、IL-10、IL-12p70和TN化)量增 加，并且具有更强的刺激T淋己细胞增殖的能力；口服能够表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆 菌可W显著降低葡聚糖硫酸钢(DSS)诱导的小鼠结肠炎症状。 二、【背景技术】
[0002] 1.类胡萝h素合成研究进展
[0003] 类胡萝h素是广泛存在于自然界的一类物质，其中有很多是人和动物必需的营养 物质。自然界中的类胡萝h素来自于两种碳骨架:C30和C40 dC40骨架合成起始与两个牛儿基焦 憐酸(GGPP)的聚合，由&tB催化；而C30碳骨架的合成开始于两个法尼基焦憐酸(FPP)的聚 合，由CrtM催化。形成的C30或C40骨架在脱氨酶的作用下一步一步脱氨，运一过程会形成许 多产物。大肠杆菌中有=种异戊二締合酶:C15PP合酶，辛异戊締醇二憐酸盐(C20PP)合酶和 Z型十一异戊締二憐酸盐(C55PP)合酶。C30合成途径可W直接从C15PP开始，而由于C40类胡 萝h素合酶CrtB不能W Cl 5为底物，大肠杆菌又没有C20PP合酶存在，所W要想在大肠杆菌中 合成C40类胡萝h素必须先在大肠杆菌中表达C20PP合酶。而CrtM不但可W催化C15形成C30， 还可W催化C20形成C4Q，虽然效率远比催化C15形成C3Q的低。
[0004] 大多数类胡萝h素合成相关的酶是膜结合的，产物多为疏水的，因此在胞质会形成 疏水的区域。目前还不清楚相关的合酶是否形成多聚体，但已有证据表明，存在酶多聚体形 成一条类胡萝h素"生产线"。不同来源的类胡萝h素合酶能够相互协作合成类胡萝h素说明 多聚酶体的形成不是合成类胡萝h素的关键因素。
[0005] 八氨番茄红素(C40)合酶在多种生物中广泛存在，而C30类胡萝h素合酶目前鉴定的 只有一个那就是金黄色葡萄球菌的化tM。
[0006] 类胡萝h素碳骨架合成的酶促反应与角整締合成的酶促反应非常相似，角整締合 成是胆固醇合成的第一步。角整締合酶(Sqs)产生的C30骨架仅仅比类胡萝h素合酶产生的碳 骨架多一个NADPH。而且运两种酶具有相似的保守结构域。
[0007] 化tM的单个氨基酸突变就能大大提高其合成C40类胡萝h素的能力，而同时其C30合 成能力随之降低。如26位上的F突变成L或S使化tM合成C4Q的能力与化tB相当F26和W38双突 变后化tM合成C3Q的能力几乎可W忽略不计。另外，W38C和E180G也能够提高化tM合成C40的 能力。事实上将F26或W38换成一个更小的或是结构可塑性更大的氨基酸就能够提高C4G合成 的能力。运种突变似乎不会改变CrtM对底物的识别而是改变了中间产物，因为突变后的 CrtM还是不能识别C20PP。
[0008] 与CrtM不同，对CrtB进行随机突变却不能筛选到能够合成C30的突变体。因此对类 胡萝h素合成的改造用CrtM更加合适，吐巧只能将C20合成C4Q，不能识别C15。点突变改造后 的化tM能够将C15合成C40,而C15是在所有生物中都有的。另外，野生型的化tM在同时存在 C15和C20的条件下能够合成C35
[0009] 八氨番茄红素是合成过程中第一个C40类胡萝h素，碳链的正中央有3个相邻的双 键，颜色的产生需要引入更多的连续双键（即更多的生色基团），因此去饱和酶催化双键形 成后颜色产生，并且随着双键的不断增加颜色加深。经过6步脱氨反应C40碳骨架可W积累15 个双键，而C30碳骨架最多进行4步脱氨反应积累11个双键。
[0010] 通常C40和C30去饱和酶能够共用，不具有特异性。去饱和酶识别的是碳链的一部分 而不是整个碳骨架所W不具有特异性，而在下游的修饰酶可能就具有底物特异性了，因为 每一步脱氨都会形成一个产物的分支点，如果下游的修饰酶不具有特异性那也就识别不了 对应的产物。类胡萝h素去饱和的程度即所谓进行了多少步去饱和反应可W通过细菌的颜 色反映出来。通过多CrtI的突变筛选到不同去饱和能力的CrtI,四步脱氨的CrtI能够增加 番茄红素的产量。吐tN是一个S步脱氨去饱和酶。去饱和酶在不同的宿主中的去饱和能力 不同，如CrtN在自然宿主金葡菌中几乎全部进行四步脱氨反应，而在大肠杆菌中有部分会 进行立步脱氨反应。
[0011] 在真菌和哺乳动物中异戊二締来源于甲径戊酸途径，而在植物和细菌中多来源于 憐酸木酬糖途径(DXP)。异戊二締前体是有毒的而异戊二締类化合物又是机体正常生长所 需要的，说明异戊二締的代谢受到严格的控制。dxs基因编码的酶是DXP途径中的第一个酶， 能够W甘油醒-3-憐酸和丙酬酸盐为底物合成1-脱氧-D-木酬糖-5-憐酸。其后还有六种酶 参与代谢途径的反应。经过运屯种酶的作用能够合成DMAPP或IPP。许多研究表明在植物中 DMAPP能够在异戊二締合酶（IspS)的作用下合成异戊二締。但运种酶在细菌中还没有被鉴 定。法尼基二憐酸合酶(IspA)能够聚合DMAPP和IPP形成彼牛儿基二憐酸盐(GPP)，法尼基二 憐酸盐或更大的类异戊二締。庚戊締二憐酸合成酶化epS)和十一异戊締焦憐酸合成酶 (化pS)都是IspA的下游酶，能够合成更大的类异戊二締。
[0012] 异戊二締合成酶的mRNA表达水平在不同的培养条件下受到严格的控制。在大肠杆 菌中DMAPP和IPP的堆积是有害的，而在枯草中运种毒性作用低。因此枯草芽抱杆菌更具有 合成类胡萝h素的优势。
[0013] 2.枯草芽抱杆菌对黏膜免疫的影响
[0014] 枯草芽抱杆菌作为一种安全的无致病性活细菌载体，是广泛存在于±壤和植物中 的优势生物种群，隶属于芽抱杆菌科、芽抱杆菌属，其细胞呈直杆状，大小(0.8~1.2)wiiX (1.5~4.0)wii，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，无芙膜，能运动。枯草杆菌作为抗原的载 体具有很多优点：①是人类和动物安全纪录的益生菌和食品添加剂，②成本低廉、耐热、抗 干燥、便于运输和使用，③其遗传性状和细菌学水平都很容易操纵。因此，枯草芽抱杆菌非 常适宜作为安全的口服递送载体。同时枯草芽抱杆菌作为递送载体可W诱导黏膜免疫应答 和全身免疫应答，运引起了研究者们极大的兴趣。运对于开发新型口服疫苗，提供了广阔的 空间。
[0015] 3.类胡萝h素的免疫作用
[0016] 早期的研究发现，0胡萝h素能够抑制缺乏维生素 A的大鼠的耳，肾，肠，膀脫等组织 的感染。因为e胡萝h素能够转化成维生素 A，所W运些研究提示类胡萝h素的运种作用是因 为能够转成维生素 A。但越来越多的研究表明，非维生素 A前体的类胡萝h素也具有不同的免 疫的作用，类胡萝h素本身的免疫调节作用越来越受到重视。
[0017] 抗氧化作用是类胡萝h素的重要生物学功能之一，几乎所有的类胡h素都具有抗氧 化功能。大量体外试验、动物模型和人体试验证明类胡萝h素可W巧灭单线态氧、消除自由 基、防止低密度脂蛋白的氧化。番茄红素会减弱树突状细胞表型和功能上的成熟，下调 CD80、CD86和MHCII分子的表达，降低T淋己细胞IL-2水平，抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶 P38，E服1/2和转录因子NF-KBo
[0018] 胡萝h素的水平在抵抗感染时显著高于其刺激生长时的水平，并且可显著刺激小 鼠、猪、牛等动物胸腺生长，增加胸腺小淋己细胞数量。饲料中添加 e-胡萝h素后，可提高奶 牛干奶期吞隧细胞和多形核白细胞的杀菌活性，相比之下维生素 A及其酸则减少了吞隧细 胞数量，而且对杀菌活性没有任何影响。
[0019] 类胡萝h素对炎症反应的影响汇总表
[0020]
[0022]
H、
【发明内容】

[0023] 技术问题
[0024] 本发明成功构建了类胡萝h素合成酶表达质粒pMK3-crtmn，并转化进入枯草芽抱 杆菌WB800。重组枯草芽抱杆菌能够合成C30类胡萝h素，C30类胡萝h素具有激活树突状细胞 能力。小鼠口服表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌能够显著降低结肠炎症状。重组枯草芽抱 杆菌WB800有望开发成预防结肠炎的益生菌。
[002引技术方案
[00%]本发明设及表达C30类胡萝h素的重组枯草芽抱杆菌，该重组枯草芽抱杆菌WB800菌 株，属于枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。检测C30类胡萝h素对树突状细胞的作用和口 服重组枯草芽抱杆菌对小鼠结肠炎的影响。
[0027] 1类胡萝h素合酶表达质粒构建方法包括：
[002引1.1 C30类胡萝h素合成酶基因的克隆
[0029] 参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列（GenBank登陆号：NC_ 007795.1)，设id对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上 游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列（下划线为同源 臂），引物序列如下：
[0030] P1:5 '-TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA-3，
[0031] P2:5 '-GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGG
[0032] GTATACG-3'
[0033] W金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的Pl、P2引物 PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，PCR反应体系均为50化，PCR反应条件：95 °C预变 性5111111，951：3〇36。，551：3〇36。，721：3111111，30个循环，72°(：1〇111111，4°(：1〇111111。回收扩增产 物。
[0034] 1.2pMK3-crtmn质粒的构建
[0035] 用限制性内切酶HindIII和BamHI将pMK3质粒线性化。反应条件为HindIII和BamHI 各化1，10 X buffer 4ul，pMK3质粒lug(4ul)，超纯水28ul，37°C 2小时。将酶切产物回收得 到线性化的PMK3质粒。将线性化的PMK3质粒与P1，P2引物的扩增产物按照连接试剂盒 (Clo址xpress? II One St邱Cloning Kit)说明书进行连接，得到pMK3-c;rt皿质粒，并测 序。
[0036] 2电转化枯草芽抱杆菌WB800菌株，属于枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
[0037] 取60化枯草芽抱杆菌WB800电转化感受态细胞与IiiL(SOngAiL)表达载体pMK3-〇的皿质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件:22KV/cm，2扣F，200 Q，电击 一次。加入ImL电击恢复液，37 °C 10化pm解育化，涂布于硫酸卡那霉素抗性固体基础培养基 LB平板，14-1她可见阳性菌落。收集阳性菌落进行扩大培养可见菌体呈现黄色。通过丙酬-正己烧抽提，可将色素成分提取出来，并通过高效液相色谱鉴定。
[0038] 3检测C30类胡萝h素对小鼠树突状细胞的作用
[0039] 3.1小鼠骨髓源树突状细胞的分离培养
[0040] (1)颈椎脱白处死4-6周龄的巧7BL/6小鼠，无菌分离股骨和腔骨。
[0041 ] (2)用Iml注射器吸取含有2%青链霉素的RPMI-1640培养基(4°C预冷，无血清），将 骨髓冲洗至一无菌培养皿中，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，150化pmaOmin。
[0042] (3)弃去上清，加入2ml预热的红细胞裂解液，轻轻混匀后室溫静置适当时间，加入 5ml含有2%青链霉素的RPMI-1640培养基(4°C预冷，无血清)终止裂解，150化pmaOmin。
[0043] (4)弃去上清，用5ml含有2%青链霉素的RPMI-1640培养基(4°C预冷，无血清)重悬 细胞，1500巧m，IOmin。
[0044] (5)弃去上清，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基（1%青链霉素+Wng/ ml rmGM-CSF+lOng/ml rm比-4)重悬细胞，细胞W4X IO5个/ml密度接种于24孔细胞培养板 中。
[0045] (6)37°(：，5%〇)2培养箱中培养48~7211后，全量换液，再加入新鲜的1??11-1640完 全培养基继续培养至第6天。
[0046] (7)收集悬浮W及半贴壁的细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞。
[0047] 3.2 C30类胡萝h素作用树突状细胞及相关指标的检测
[004引将培养好的树突状细胞铺到12孔板中，2 X IO5/孔。C30处理组:每孔加入IuM C30类 胡萝h素化ia组）；LPS组:每孔加入lOng/ml LPS(LPS组）；从不表达C30类胡萝h素的枯草芽抱 杆菌中提取的提取物对照组:加入与Dia组等体积的溶剂(CE组）；阴性对照组:加入等体积 溶剂(Control组）。将W上不同处理作用树突状细胞24小时，用流式检测树突状细胞的表型 变化，普通光学显微镜检测树突状细胞的形态指数变化，用ELISA检测培养上清中的细胞因 子含量，通过混合淋己细胞反应检测树突状细胞对T细胞的刺激情况。具体方法如下：
[0049] 3.2.1普通显微镜检测细胞形态指数变化
[0050] 收集细胞，将细胞铺于爬片上，直接镜下观察细胞形态。
[0051 ] 3.2.2流式检测树突状细胞表型
[0052]收集树突状细胞，200化pm，IOmin，弃上清，PBS清洗两次后，重悬细胞，调节细胞浓 度为5X l〇6/ml，取IOOiU细胞悬液，加入FITC-CD40、FITC-CD80、FITC-CD86或者FITC-MHCII，4°C解育30min，2000巧m，IOmin，弃上清，PBS清洗两次后，200iil PBS重悬细胞，流式 细胞仪检测表达共刺激分子W及MHCII的平均巧光强度。
[005引 3.2.3ELISA检测比-6、比-10、比-12p70和 TNF口
[0054] 收集细胞培养液，应用ELISA试剂盒检测培养液中IL-6、IL-IO、化-1化70和TNFa, 具体步骤如下：
[00对 （1)在酶标条中加入样品和标准品，10化1/孔，37 °C反应90min。轻轻倒掉，不洗。 [0056] (2)加入生物素标记的抗小鼠比-6、化-10、化-12p70或TN化抗体，IOOiil/孔，37°C 反应60min，0.0 lM PBS洗涂5次，5min/次。
[0057] (3)加入提前预热的ABC工作液，37r反应SOmin，0.0 lM PBS洗涂5次，5min/次。
[0化引 （4)加入提前预热的TMB显色液，9化1/孔，37。(：避光反应20-30min。
[0059] (5)加入 TMB 终止液，1 OOiil/孔。
[0060] (6)用酶标仪在450nm测定OD值，根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线。
[0061] (7)根据样品的吸光值在绘制的标准曲线上找出对应的浓度。
[0062] 3.2.4混合淋己细胞反应检测淋己细胞增殖
[0063] 将小鼠肠系膜淋己结轻轻剪碎并且转移到200目的细胞钢筛上，轻轻研磨得到单 个淋己细胞悬液，1500rpm，10min，PBS清洗两次，40山buffer重悬lX10 7个细胞，加入10i^l Biotin-Antibody Cochail混匀，4°C反应5min;加入20山 Anti-Biotin Microbeads混匀， 4°C反应lOmin，每5min轻轻混匀1次;补加至50化1 13证'6。磁力柱中加入31]11润柱液后，再 缓缓加入前面已经重悬好的细胞，收集从磁力柱中流出的细胞，即为CD4+T细胞，流式检测 CD4+T细胞的百分数，发现分选得到的CD4+T细胞纯度为99%。
[0064] 应用CFSE活细胞染料试剂盒标记CD4+T细胞，将收集的树突状细胞与CFSE标记的 CD4+T细胞按照1:5混合，37°C，5% C〇2培养箱中培养5天后，收集细胞，200化pm，IOmin，弃上 清，PBS清洗两次后，流式检测T细胞的增殖情况。
[0065] 4检测口服表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌后对小鼠结肠炎的影响
[0066] 对小鼠每天灌胃1 X IO9C即能够表达C30的枯草芽抱杆菌(WB800-C30)或对照枯草芽 抱杆菌(WB800)，连续饲喂30天后在饮水中添加5%的葡聚糖硫酸钢(DSS)诱导结肠炎。7天 后颈椎脱白处死小鼠观察结肠长度变化，并对结肠进行HE染色，评价组织病理变化。
[0067] 有益效果
[0068] 1本发明测序的crtm和crtn基因来源于金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株，其基因序 列是国内外首次报道。
[0069] 2本发明构建的pMK3-crtnm质粒是国内外第一个W大肠杆菌和枯草芽抱杆菌穿梭 质粒PMK3为骨架构建的，能够在枯草芽抱杆菌中表达类胡萝h素合酶合成C30类胡萝h素的质 粒。
[0070] 3本发明首次证明了 C30类胡萝h素(4，少-二脱辅基链抱红素）能够激活树突状细 胞。
[0071] 4本发明成功构建了能够合成C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌。口服小鼠可W减轻小 鼠结肠炎症状。重组枯草芽抱杆菌WB800有望开发成预防结肠炎的益生菌。 四、
【附图说明】：
[0072] 图1用引物Pl和P2扩增得到大小约化b的目的基因片段。
[0073] 图2 pMKS-cd皿质粒酶切验证结果。经PvuI和化el酶切得到大小分别为3758bp和 6433bp的片段。
[0074] 图3含有pMK3-cd皿的重组枯草芽抱杆菌呈现黄色（右），而含有pMK3空质粒的枯 草芽抱杆菌为白色(左）。
[0075] 图4重组枯草芽抱杆菌中的色素成分能够用丙酬-正己烧抽提。
[0076] 图5经高效液相色谱分析证明从重组枯草芽抱杆菌中提取的色素成分为C30类胡萝 h素，4，少-二脱辅基链抱红素。
[0077] 图6 C30类胡萝h素能够刺激树突状细胞形态成熟。Control:阴性对照;LPS:阳性对 照;CE:含有pM3的枯草芽抱杆菌的提取物;Dia: C3Q类胡萝h素。
[0078] 图7 C30类胡萝h素能够刺激树突状细胞表型成熟。Control:阴性对照；CE:含有 pM3的枯草芽抱杆菌的提取物;Dia: C30类胡萝h素。
[0079] 图8 C30类胡萝h素刺激树突状细胞产生更多的细胞因子。Con化Ol:阴性对照;CE: 含有pM3的枯草芽抱杆菌的提取物;Dia: C30类胡萝h素。
[0080] 图9 C30类胡萝h素增强树突状细胞刺激T细胞增殖的能力。Control:阴性对照； LPS:阳性对照;CE:含有pM3的枯草芽抱杆菌的提取物;Dia: C30类胡萝h素。
[0081] 图10小鼠口服表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌后结肠炎症状减轻。表现为结肠 长度增加，出血减轻。1:正常小鼠结肠；2:饲喂PBS的小鼠用DSS诱导结肠炎；3:饲喂不表达 C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌的小鼠用DSS诱导结肠炎;4:饲喂表达C30类胡萝h素的枯草芽 抱杆菌的小鼠用DSS诱导结肠炎
[0082] 图11小鼠口服表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌后结肠炎的组织病理症状减轻。 A:饲喂PBS的小鼠用DSS诱导结肠炎，表现出明显的组织病理变化。上皮细胞脱落(箭头），黏 膜下和肠腔中出血(五角星)黏膜下和固有层炎性细胞浸润(=角形），肠壁增生变厚。B:饲 喂表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌后肠炎组织病理变化明显减轻。无可见出血点和炎性 细胞浸润，上皮细胞较为完整，肠壁无增生。 五、
【具体实施方式】
[0083] 1类胡萝h素合酶质粒pMK3-crtmn的构建
[0084] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体设及的材料和试剂如 下：
[0085] 枯草芽抱杆菌WB800菌株由南京农业大学植物保护学院高学文惠赠，文献见:Wu, H.，Wang，S.，Qiao，J.，Liu，J.，Zhan，J.，Gao，X.,2009.Expression of HpaGx〇〇c protein in Bacillus subtilis and its biological functions.Journal of microbiology and biotechnology 19,194-203;
[0086] E.coli JM109、质粒pMK3、pCDNA3.1(购自Life Technologies);
[0087] 试剂：Q5高保真酶购自NEB公司；PMD19-T载体，Agarose Gel DNA Purification Kit,限制性内切酶，T4连接酶等均购自化kara公司；硫酸卡那霉素，氨节青霉素，细菌基因 组提取试剂盒购自OMEGA公司；One step Cloning Kit定点克隆试剂盒购自Va巧me公司； DSS购自上海前尘生物;ELISA试剂盒购自武汉博±德。門TC-CD40、門TC-CD80、門TC-CD86和 FITC-MHCII抗体购自联科生物。小鼠 CD4+T细胞分选试剂盒购自优宁维。
[0088] 1.1 C30类胡萝h素合成酶基因的克隆
[0089] 参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列（GenBank登陆号：NC_ 007795.1)，设id对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上 游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列（下划线为同源 臂），引物序列如下：
[0090] P1:5 '-TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA-3 '
[0091] P2:5 '-GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATACG-3 '
[0092] W金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的Pl、P2引物 PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，如图1所示，扩增的目的片段约3000bp。
[0093] 1.2pMK3-crtmn 质粒的构建
[0094] 用限制性内切酶HindIII和BamHI将pMK3质粒线性化。反应条件为HindIII和BamHI 各化1，10 X buffer 4ul，pMK3质粒lug(4ul)，超纯水28ul，37°C 2小时。将酶切产物回收得 到线性化的PMK3质粒。将线性化的PMK3质粒与P1，P2引物的扩增产物按照连接试剂盒 (Clo址邱ress? II One Step Cloning Kit)说明书进行连接，得到pMK3-c;rtmn质粒，经 PvuI和化el酶切验证正确，如2所示。送英俊测序。
[0095] 2表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌的验证
[0096] 将pMK3-crtmn电击转化枯草芽抱杆菌WB800。取60化枯草芽抱杆菌WB800电转化感 受态细胞与化L(SOngAiL)表达载体pMK3-c;rt皿质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电 击，电击条件：22KV/cm，2扣F，200Q，电击一次。加入ImL电击恢复液，37°C l(K)rpm解育化， 涂布于硫酸卡那霉素抗性固体基础培养基LB平板，14-1她可见阳性菌落。收集阳性菌落进 行扩大培养可见菌体呈现黄色（图3)。通过丙酬-正己烧抽提，可将色素成分提取出来（图 4)，通过高效液相色谱鉴定为C30类胡萝h素(4，4 ' -diaponeurosporene)(图5)。
[0097] 3检测C30类胡萝h素对小鼠树突状细胞的作用
[009引将培养好的树突状细胞铺到12孔板中，2 X IO5/孔。C30处理组:每孔加入IuM C30类 胡萝h素（图中Dia组）；LPS组:每孔加入lOng/ml LPS(图中LPS组）；从不表达C30类胡萝h素的 枯草芽抱杆菌中提取的提取物对照组:加入与Dia组等体积的溶剂（图中CE组）；阴性对照 组:加入等体积溶剂（图中Control组）。将W上不同处理作用树突状细胞24小时，用流式检 测树突状细胞的表型变化，普通光学显微镜检测树突状细胞的形态指数变化，用化ISA检测 培养上清中的细胞因子含量，通过混合淋己细胞反应检测树突状细胞对T细胞的刺激情况。
[0099] 具体方法如下；
[0100] 3.1普通显微镜检测细胞形态指数变化
[0101] 收集细胞，将细胞铺于爬片上，直接镜下观察细胞形态。如图6所示，C30类胡萝h素 处理的树突状细胞形态指数增加，有形态成熟的特征。
[0102] 3.2流式检测树突状细胞表型
[0103] 收集树突状细胞，200化pm，IOmin，弃上清，PBS清洗两次后，重悬细胞，调节细胞浓 度为5X l〇6/ml，取IOOiU细胞悬液，加入FITC-CD40、FITC-CD80、FITC-CD86或者FITC- MHCII，4°C解育30min，2000巧m，IOmin，弃上清，PBS清洗两次后，200iil PBS重悬细胞，流式 细胞仪检测表达共刺激分子W及M肥II的平均巧光强度。如图7所示，C30类胡萝h素能够显著 刺激树突状细胞表型成熟。
[0104] 3.3ELISA检测比-6、比-10、比-12p70和 TNF口
[0105] 收集细胞培养液，应用化ISA试剂盒检测培养液中比-6、化-10、化-12p70和TNFa， 具体步骤如下：
[0106] (1)在酶标条中加入样品和标准品，10化1/孔，37 °C反应90min。轻轻倒掉，不洗。
[0107] (2)加入生物素标记的抗小鼠比-6、化-10、化-12p70或TN化抗体，IOOiil/孔，37°C 反应60min，0.0 lM PBS洗涂5次，5min/次。
[0108] (3)加入提前预热的ABC工作液，37°C反应30min，0.0 lM PBS洗涂5次，5min/次。
[0109] (4)加入提前预热的TMB显色液，9化1/孔，37°C避光反应20-30min。
[0110] (5)加入 TMB 终止液，1 OOiil/孔。
[011。 （ 6)用酶标仪在450nm测定OD值，根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线。
[0112] (7)根据样品的吸光值在绘制的标准曲线上找出对应的浓度。
[011引如图8所示，C30类胡萝h素能够提高树突状细胞细胞因子比-6、化-10、化-1化70和 TN阳的产生量。
[0114] 3.4混合淋己细胞反应检测淋己细胞增殖
[0115] 将小鼠肠系膜淋己结轻轻剪碎并且转移到200目的细胞钢筛上，轻轻研磨得到单 个淋己细胞悬液，1500rpm，10min，PBS清洗两次，40山buffer重悬lX10 7个细胞，加入10i^l Biotin-Antibody Cochail混匀，4°C反应5min;加入20山 Anti-Biotin Microbeads混匀， 4°C反应lOmin，每5min轻轻混匀1次;补加至50化1 13证'6。磁力柱中加入31]11润柱液后，再 缓缓加入前面已经重悬好的细胞，收集从磁力柱中流出的细胞，即为CD4+T细胞，流式检测 CD4+T细胞的百分数，发现分选得到的CD4+T细胞纯度为99%。
[0116] 应用CFSE活细胞染料试剂盒标记CD4+T细胞，将收集的树突状细胞与CFSE标记的 CD4+T细胞按照1:5混合，37°C，5% C〇2培养箱中培养5天后，收集细胞，200化pm，IOmin，弃上 清，PBS清洗两次后，流式检测T细胞的增殖情况。结果如图9所示，C30类胡萝h素能够显著的 提高树突状细胞刺激T细胞增殖的能力。
[0117] 4检测饲喂表达C30类胡萝h素的枯草芽抱杆菌对小鼠结肠炎的影响
[〇11引对小鼠每天灌胃1 X IO9C即能够表达C30的枯草芽抱杆菌(WB800-C30)或对照枯草芽 抱杆菌(WB800)，连续饲喂30天后在饮水中添加5%的葡聚糖硫酸钢(DSS)诱导结肠炎。7天 后颈椎脱白处死小鼠观察结肠长度变化，并对结肠进行HE染色，评价组织病理变化。结果表 明，WB800-C30组小鼠结肠较WB800组显著增长（图10)。组织病理变化明显缓解，表现为出血 减少，淋己细胞浸润减少，肠上皮细胞脱落减少，肠壁增生减弱（图11 )。说明表达C30类胡萝h 素的枯草芽抱杆菌能够预防结肠炎的发生。
【主权项】
1. 一种C3Q类胡萝卜素合酶表达质粒pMK3-crtmn，是由以下方法构建而成： 1.1 C3Q类胡萝卜素合成酶基因的克隆 参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列（GenBank登陆号:NC_007795.1)， 设-Η对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上游的启动子 部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列（下划线为同源臂），引物序列 如下： PI:5 '-TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA-3， P2:5 '-GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATACG-3， 以金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩 增crtm的启动子及crtm和crtn基因，PCR反应体系均为50yL，PCR反应条件：95°C预变性 5min，95°C 30sec，55°C 30sec，72°C 3min，30个循环，72Γ 10min，4°C lOmin。回收扩增产 物。 1.2 pMK3_crtmn质粒的构建 用限制性内切酶Hindlll和BamHI将pMK3质粒线性化。反应条件为Hindlll和BamHI各 2ul，10Xbuffer 4ul，pMK3质粒lug(4ul)，超纯水28ul，37°C 2小时。将酶切产物回收得到 线性化的Ρ Μ K 3质粒。将线性化的ρ Μ K 3质粒与P1，P 2引物的扩增产物按照连接试剂盒 (ClonExpress? II One Step Cloning Kit)说明书进行连接，得到pMK3_crtmn质粒，酶切 鉴定并测序。2. -种用权利要求1所述表达质粒电转化获得的能够表达C3Q类胡萝卜素的重组枯草芽 孢杆菌。该重组枯草芽孢杆菌WB800菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。是由以 下方法转化而成： 取60yL枯草芽孢杆菌TO800电转化感受态细胞与lyL(50ng/yL)表达载体pMK3_crtmn质 粒混合加入电击杯中冰浴51^11后进行电击，电击条件：221^/〇11，25以？，200〇，电击一次。加 入lmL电击恢复液，37 °C lOOrpm孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固体基础培养基LB平板， 14-18h可见阳性菌落。收集阳性菌落进行扩大培养可见菌体呈现黄色。通过丙酮-正己烷抽 提，可将色素成分提取出来，并通过高效液相色谱鉴定为4,4~二脱辅基链孢红素。3. -种用权利要求2所述从能够表达C3Q类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌WB800提取的C 30 类胡萝卜素能够刺激小鼠树突状细胞活化。以下为C3Q类胡萝卜素作用小鼠树突状细胞及相关 指标的检测： 将培养好的树突状细胞铺到12孔板中，2X 105/孔。C3Q处理组:每孔加入luM C3Q类胡萝卜 素 (Dia组）；LPS组:每孔加入10ng/ml LPS(LPS组）；从不表达C3Q类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌 中提取的提取物对照组:加入与Dia组等体积的溶剂(CE组）；阴性对照组:加入等体积溶剂 (Control组）。将以上不同处理作用树突状细胞24小时，结果表明C3Q类胡萝卜素能够诱导树 突状细胞形态和表型成熟，提高其细胞因子的产生量，并增强树突状细胞刺激T细胞增殖的 能力。4. 一种用权利要求2所述能够表达C30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌WB800直接饲喂 小鼠能够降低DSS诱导的小鼠肠炎症状。 对小鼠每天灌胃1 X l〇9CFU能够表达C3Q的枯草芽孢杆菌(WB800-C3Q)或对照枯草芽孢杆 菌(WB800)，连续饲喂30天后在饮水中添加 5 %的葡聚糖硫酸钠 (DSS)诱导结肠炎。7天后颈 椎脱白处死小鼠观察结肠长度变化，并对结肠进行HE染色，评价组织病理变化。结果表明， WB800-C3Q组小鼠结肠较WB800组显著增长。组织病理变化明显缓解，表现为出血减少，淋巴 细胞浸润减少，肠上皮细胞脱落减少，肠壁增生减弱。说明表达C 3Q类胡萝卜素的枯草芽孢杆 菌能够预防结肠炎的发生。
【文档编号】A61K35/742GK105838731SQ201610159897
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月17日
【发明人】杨倩, 刘浩飞, 徐文雯, 朱立麒
【申请人】南京农业大学