实时荧光pcr技术定量检测myd88基因l265p突变的方法、引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供了实时荧光PCR技术定量检测MYD88基因L265P突变的方法、引物和探针，并建立了MYD88第265位氨基酸突变型和野生型之间的ΔCT值与突变比例之间的指数方程关系，用以确定突变比例的方法。所述方法通量大，准确度高，适于辅助临床诊断。
【专利说明】
实时荧光PCR技术定量检测MYD88基因 L265P突变的方法、引物 和探针
技术领域
[0001 ]本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种采用MGB探针及实时荧光PCR技 术定量检测MYD88基因 L265P突变及其突变比例的方法及引物。实时荧光PCR技术经济成熟， 通量大，适于辅助临床诊断。
【背景技术】
[0002] 淋巴衆细胞淋巴瘤(Lymphoplasmacytic lymphoma，LPL)为淋巴结髓质区B细胞肿 瘤，由小B淋巴细胞、浆细胞样淋巴细胞和浆细胞组成；常侵润骨髓，有时也累及淋巴结和 脾。当LPL侵犯骨髓，同时伴有血清中单克隆免疫球蛋白IgM分泌，则被称为华氏巨球蛋白血 症（Waldenstrom macroglobulinemia，WM)〇
[0003] 尽管LPL具有产生单克隆免疫球蛋白IgM的特征，但仍有约5%的患者为IgA型或 IgG型，甚至为不分泌型。而其他B系肿瘤，如结内边缘区淋巴瘤（Nodal marginal zone lymphoma，NMZL)、脾边缘区淋巴瘤（Splenic marginal zone lymphoma，SMZL)、慢性淋巴细 胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL);甚至IgM分泌型多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，丽)均能有单克隆免疫球蛋白IgM的存在。故有时候仅从肿瘤的临床表现和病理特 征是无法明确区分LPL和其他肿瘤，特别是SMZL的。
[0004] MYD88基因 L265P突变见于约90%LPL/WM(淋巴浆细胞淋巴瘤/Waldenstrom巨球蛋 白血症）。而SMZL、CLL伴浆细胞分化及IgM分泌型MM中则罕见甚至无 MYD88基因突变。故该基 因突变可用于LPL/WM的鉴别诊断。MYD88基因突变也是预后判断的指标，伴突变的LPL/WM患 者预示着疾病进展缓慢且生存期更长。此外，MYD88基因突变也是疾病治疗的靶标和微小残 留病灶(MRD)监测的分子标志。
[0005] 目前用于MYD88基因 L265P突变的方法有：Sanger测序法和AS-PCR法。Sanger测序 法尽管被认为是金标准，但是其灵敏度低，只能检测到突变比例>20%的突变峰。而LPL/WM 患者受检样本通常为骨髓，其骨髓样本中所含的肿瘤细胞本身就低。除非通过CD19+筛选出 B细胞，否则Sanger测序检测结果的假阴性率会达到30%-50%。而通过⑶19+拣选出肿瘤细 胞是个繁重的过程，不适用于临床常规诊断使用。故AS-PCR法被美国NCCN指南推荐为 MYD88L265P突变检测的基本方法，其灵敏度可以达到1 %甚至1 %以下。
[0006] AS-PCR法虽然灵敏度高，但其检测过程相对繁琐，需要进行琼脂糖凝胶电泳分析， 容易造成污染。同时结果判断相对主观，没法进行突变比例的准确定量。用于患者的辅助诊 断尚可，但不适用于患者的MRD检测。
【发明内容】
[0007] 鉴于目前检测MYD88L265P突变的方法不能兼顾灵敏度高、方便快捷和相对定量的 需求，本发明考虑使用MGB探针结合实时荧光PCR技术的方法对L265P突变进行相对定量检 测，以满足临床对灵敏度高、检测流程简便和MRD监测的需求。
[0008] 一种用于MGB探针结合实时荧光PCR技术检测MYD88L265P突变的引物和探针，所述 引物和探针的核苷酸序列如下：
[0009] MYD88QF：CCTTGGCTTGCAGGTGC
[0010] MYD88QR：AGGATGCTGGGGAACTCTTT
[0011] MYD88-WP：HEX-AAGCGACTGATCC-MGB
[0012] MYD88-MP：FAM-AAGCGACCGATCC-MGB
[0013]本发明还提供了使用荧光PCR中FAM通道和HEX通道，在一管PCR反应体系中分别检 测MYD88第265位氨基酸突变型和野生型，并通过两者的Δ CT值与突变比例之间建立指数方 程关系。其方法如下：
[0014] ⑴合成MYD88L265P突变型和野生型质粒（由宝生物工程大连有限公司合成）；
[0015] ⑵将两种质粒均稀释至2ng/ul;
[0016] ⑶按如下表格配置成不同突变比例的混合物；
[0017]
[0018] 12345 ⑷将12个质粒混合物按不同批次重复检测至少3次，计算Δ CT = CT效-CT敕将Δ CT值作为X，突变比例作为Y(图1)，拟合曲线如下： 2 ①y = 0 · 4688e ~ [ -0 · 4027 (x+1) ]R2 = 0 · 9834 (1 · 25-60 % ) 3 ②y = 1-0 · 5059e~ [0 · 5337(x+l) ]R2 = 0 · 9814(60-100% ) 4 1.25 %-60 %区间以曲线①为计算公式，曲线60-100 %之间以曲线②为计算公式； 即Δ CT>-1.62以曲线①为计算公式，△ CT < -1.62以②为计算公式;FAM(突变型)无扩增曲 线，贝1JCT值统一以50录入进行计算。 5 指数方程的优点在于:在很多用ACT来计算突变比例的方案中，都会选用线性方 程来建立ACT和突变比例的关系。在拟合曲线时，符合线性关系的突变比例范围只在20- 80 %之间。< 20 %或> 80 %的突变比例与相应的Δ CT值之间并不符合线性关系，而符合指 数方程。从图1中可看到突变比例为5 %时，线性方程对应的X值为2.86，指数方程对应的X值 为4.56，重复检测5%突变比例的样本8次，X均值为4.96。故指数方程更符合Δ CT与突变比 例之间的关系。因此，当突变比例<20%时，若仍用线性方程计算突变比例的话，会造成假 阴性的情况，不利于微小残留病灶的监测。
[0024]本发明还提供了使用上述引物、探针及拟合的曲线计算公式检测样本中 MYD88L265P相对突变比例的方法，其步骤如下：
[0025] ⑴提取人全血样本中的DNA。
[0026] ⑵用MYD88QF、MYD88QR、MYD88-WP和MYD88-MP配置荧光PCR检测体系。PCR反应条件 为:95°(：111^11;95°(：158,601€358,4(^7(3 ;并在60°(：采集荧光信号。
[0027] ⑶分析检测数据:计算Δ CT = CT^g-CT_，将Δ CT值带入计算公式求突变比例。若 厶(：1'>-1.62，则突变比例％=0.46886~[-0.4027(叉+1)]\100%;若么(：1'<-1.62，则突变 比例％ = {1-0 · 5059e~ [0 · 5337(x+1) ]} X 100% ;若突变型无扩增曲线，则CT效=50，带入计 算公式进行计算。
【附图说明】
[0028] 图1是本发明曲线拟合中X( ACT)与Y(突变比例)之间的曲线关系图。
[0029] 图2A是使用本发明引物探针及方法对第一个待检样本进行突变比例检测的荧光 扩增曲线图。
[0030]图2B是使用本发明引物探针及方法对第一个待检样本进行突变比例检测的测序 验证图。
[0031] 图3A是使用本发明引物探针及方法对第二个待检样本进行突变比例检测的荧光 扩增曲线图。
[0032] 图3B是使用本发明引物探针及方法对第二个待检样本进行突变比例检测的测序 验证图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0034] 实施例1:
[0035] 血液DNA的提取：使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取 试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司）。取300μ1待检全血样本加入1.5ml离心管中，加入 900ul红细胞裂解液颠倒混匀，lOOOOrpm离心lmin，弃上清;加200uL缓冲液GA，振荡至彻底 混匀;加入20μ1蛋白酶K溶液，混匀;加入200μ1缓冲液GB，充分颠倒混匀，70 °C放置10min。再 加200μ1无水乙醇，混匀，将溶液加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离 心30s，弃废液；向CB3中加入500μ1缓冲液⑶，12000rpm离心30s，弃废液；向CB3中加入600μ1 漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液；重复一次。再将CB3放回收集管中，12000rpm空离心 2min;并将CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μ1 TE，室温放 置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，所得即为样本DNA。
[0036] 10X红细胞裂解液配方为：NH4C1 82g，NaHC03 8.4g，EDTA-Na2 3.72g，加 ddH20定 容至 1000ml。
[0037] 实施例2:
[0038] 荧光PCR:按如下试剂及试剂量配置PCR检测体系，其中MYD88QF(10yM)和MYD88QR (ΙΟμΜ)各Ο·8ul;MYD88-WP(ΙΟμΜ)和MYD88-MP(ΙΟμΜ)各Ο·3ul;THUNDERBIRD qPCR Mix 12.5ul(东洋纺（上海)生物科技有限公司）；加去离子水8.3ul;最后加 DNA模版2ul。检测程 序设置如下：检测探针分别设置为FAM和VIC，一管双检;95°Clmin;95°C15s，60°C30s，40f 循环;60 °C时收集焚光信号。
[0039] 实施例3:
[0040] 结果分析：Base 1 ine设置为6-15，阈值线拉至阴性线以上，计算Δ CT = CT突g- CT彩瘦，将ACT值带入计算公式求突变比例。若ACT>-1.62,则突变比例％=0.4688^[- 0.4027(叉+1)]\100%;若六(：1'<-1.62，则突变比例％ = {1-0.50596~[0.5337(叉+1)]}\ 100%〇
[0041 ] 实施例4:
[0042]特异性确认:取临床血常规正常的体检样本32例，骨髓增殖性肿瘤患者全血样本 32例，急性髓系白血病患者15例，共79例样本进行特异性确认。79例样本按实施例1-3所述 进行DNA提取、荧光PCR检测、结果分析，计算△ CT值。
[0043] 79例样本检测结果均为未突变，特异性为100%。
[0044] 实施例5:
[0045] 检测下限确认:取临床检测突变比例为80 %的样本和未突变的样本各一例，将两 例样本均稀释至30ng/ul，混合至突变比例为4%、2%、1%、0.4%，0.2%。按实施例2-3所 述，不同批次检测5次，1 %突变比例的样本5次均能检出，故检测下限为1 %。
[0046]
[0048] 实施例6:
[0049] 第一个待检全血样本检测：对第一个待检全血样本按实施例1-3所述进行DNA提 取、荧光PCR检测、结果分析，计算Δ CT = 26 · 15-28 · 65 = -2 · 5。突变比例％ = {1-0 · 5059e ~ [0.5337(-2.5+1) ]} X 100% =77.28%。该样本同时经测序检测验证，确认为突变，且突变 比例约为75 %。扩增曲线图及测序图如图2A和图2B所示。
[0050] 实施例7:
[0051]第二个待检全血样本检测：对第二个待检全血样本按实施例1-3所述进行DNA提 取、荧光PCR检测、结果分析，计算Δ CT = 50-24.5 = 25.5。突变比例％ = 0.4688e~ [-0.4027 (25.5+1) ]X 100% =0%。该样本同时经测序检测验证，确认为未突变。扩增曲线图及测序 图如图3A和图3B所示。
【主权项】
1. 一种用于MGB探针结合实时巧光PCR技术检测MYD8化265P突变的引物和探针，其特征 在于，所述引物和探针的核巧酸序列如下： a) MYD88QF：CCTTGGCTTGCAGGTGC b) MYD88QR：AGGATGCTGGGGAACTCTTT c) MYD88-WP:肥X-AAGCGACTGATCC-MGB d) MYD88-MP:FAM-AAGCGACCGATCC-MGB。 2. MYD88第265位氨基酸突变型和野生型之间的Δ CT值与突变比例之间建立指数方程 关系的方法，所述方法包括W下步骤： (1) 合成MYD88L265P突变型和野生型质粒； 间将质粒稀释； 间配置成不同突变比例的混合物； (4)计算Δ CT = CT煉-CT游瘦，将Δ CT值作为X，突变比例作为Y，拟合曲线如下： ① y = 0.4688e~[-0.4027(x+l)]R2 = 0.98:34(1.25-60%) ② y= 1-0.5059e~[0.5337(x+l)]R2 = 0.9814(60-100%) 1.25%-60%区间W曲线①为计算公式，曲线60-100%之间W曲线②为计算公式；即Δ CT>-1.62 W曲线①为计算公式，A CT < -1.62 W②为计算公式;FAM(突变型）无扩增曲线， 则CT值统一 W 50录入进行计算。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用巧光PCR中FAM通道和肥X通道，在一管 PCR反应体系中分别检测MYD88第265位氨基酸突变型和野生型。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述质粒的稀释至化g/ul。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)不同突变比例为：6. 检测样本中MYD88L265P相对突变比例的方法，其包括W下步骤： 过)提取人全血样本中的DNA;。 (2) 用 MYD88QF、MYD88QR、MYD88-WP 和 MYD88-MP 配置巧光 PCR 检测体系； 间分析检测数据:计算A CT = CT煉-CT巧瘦，将Δ CT值带入计算公式求突变比例;若Δ CT >-1.62，则突变比例％=0.4688e^'[-0.4027(x+l)]X100%;若ΔCT<-1.62，则突变比 例％ = {1-0.5059e~ [ο.5337(x+1) ]} X 100% ;若突变型无扩增曲线，贝IJCT滅;=50，带入计算 公式进行计算。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为:95 °C Imin; 95 °C 15s， 60°C 35s，40巧c;并在60°C采集巧光信号。
【文档编号】C12N15/11GK105838811SQ201610340429
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】邹媛, 杜翠, 陈红梅, 夏成青
【申请人】武汉艾迪康医学检验所有限公司