用于聚集蛋白聚糖酶相关疾病治疗的针对聚集蛋白聚糖酶型adamts种类的人抗体的制作方法

用于聚集蛋白聚糖酶相关疾病治疗的针对聚集蛋白聚糖酶型adamts种类的人抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制人聚集蛋白聚糖酶的酶活性的抗体。在一个实施方案中，聚集蛋白聚糖酶是ADAMTS4。在一个实施方案中，所述抗体识别人ADAMTS4中的特定表位，且不仅抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性还抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。此外，本发明还提供了所述抗体在预防或治疗关节炎进展中的用途。
【专利说明】
用于聚集蛋白聚糖酶相关疾病治疗的针对聚集蛋白聚糖酶型 ADAMTS种类的人抗体
技术领域
[0001 ]本发明涉及抗人聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)抗体和其药物用途。
【背景技术】
[0002] 聚集蛋白聚糖降解和后续的胶原纤维消化是在人体关节疾病(包括骨关节炎(0A) 和类风湿性关节炎(RA))中软骨破坏的中心途径。胶原降解是主要由胶原降解基质金属蛋 白酶(丽P)，诸如丽P-l、MMP-8和MMP-13[l-3]进行。另一方面，称为聚集蛋白聚糖酶的降解 聚集蛋白聚糖的金属蛋白酶被认为在聚集蛋白聚糖降解中发挥关键作用[4,5]。聚集蛋白 聚糖酶属于ADAMTS(具有血小板反应蛋白基序的解联蛋白和金属蛋白酶）基因家族，并且 ADAMTS1、4、5、8、9和15已知具有聚集蛋白聚糖酶活性[4,6]。使用ADAMTS4和ADAMTS5敲除小 鼠的最近的研究表明，ADAMTS5，但不是ADAMTS4，在小鼠关节炎中的聚集蛋白聚糖降解中起 重要作用[7，8 ]。但是，由于关于小鼠 ADAMTS4和ADAMTS5的生化特征、表达模式或基因启动 子结构的信息很少，来自基因敲除小鼠的数据必须仔细解释，并且不应被外推到人的疾病 0A和RA[9，10]。在人类软骨细胞中，ADAMTS4是通过用细胞因子诸如白介素 -l(IL-l)处理 而被诱导，但ADAMTS5的表达是组成型的[9，11-13]。我们最近的研究还表明，在聚集蛋白聚 糖酶型ADAMTS种类中，ADAMTS4在人骨关节炎软骨中选择性过表达与软骨破坏的程度有直 接的相关性，而ADAMTS5在正常和骨关节炎软骨中组成型表达[10]。这些表明，ADAMTS4是在 人类骨关节炎软骨中的主要聚集蛋白聚糖酶。ADAMTS4也由RA中的滑膜细胞和关节软骨细 胞过表达，表明该蛋白酶参与RA关节软骨破坏。ADAMTS4和ADAMTS5不仅可以消化聚集蛋白 聚糖还可以消化蛋白聚糖lectican家族的其它成员，包括多能聚糖和短小蛋白聚糖。因为 多能聚糖是在皮肤和血管壁中的主要蛋白聚糖，其被ADAMTS4和ADAMTS5的降解还分别参与 病理条件(诸如慢性溃疡以及皮肤和各种血管炎的纤维化)下的组织破坏以及皮肤和血管 的修复。此外，已知在多形性成胶质细胞瘤中的肿瘤细胞过表达ADAMTS5，并且表明肿瘤细 胞衍生的ADAMTS5通过裂解短小蛋白聚糖在浸润中发挥作用[14]。
[0003] 噬菌体展示法是一种展示技术，其已通过在功能肽或蛋白和编码其的DNA之间以 噬菌体颗粒的形式形成一对一对应，而实现体外的高速选择。此噬菌体展示方法应用于抗 体选择，并且通过该方法得到的许多抗体已被开发作为药物产品[15]。此外，已经建立了通 过结合人人工抗体文库和噬菌体展示法而获得特异性抗体的方法，并且这种方法已经由多 个公司实用化，如通过MorphoSys的HuCAL(人类组合抗体文库)所证明。
[0004] [文献列表]
[非专利文献]
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[0005] 发明概述 技术问题 本发明的一个目的是提供一种抗-人聚集蛋白聚糖抗体(特别是抗人ADAMTS4抗体)可 用于其中Lectican家族分子(其是蛋白聚糖)被降解的由关节炎所代表的各种疾病的进展 的预防或治疗。
[0006] 问题的解决方案 为了解决上述问题，本发明人生产了结合人聚集蛋白聚糖酶的多种抗人聚集蛋白聚糖 抗体。作为结果，他们已发现，所产生的抗人ADAMTS4抗体抑制人ADAMTS4的酶活性，并且可 以防止在关节炎中发生的聚集蛋白聚糖被关节软骨细胞降解。此外，他们已发现，识别特定 表位的抗体也显示与人ADAMTS4之外的聚集蛋白聚糖酶的交叉反应性，并且还可以抑制它 们的活性。基于上述研究发现，他们已经进行了进一步的研究，尝试开发用于其中聚集蛋白 聚糖作用于组织破坏的由关节炎代表的疾病的治疗药物，这导致本发明的完成。
[0007] 因此，本发明涉及以下内容。
[0008] [ 1 ]特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖 酶活性的抗体。
[0009] [2]根据[1]的抗体，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0010] [3]根据[2]的抗体，其还抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。
[0011] [4]根据[2]或[3]的抗体，其在包含SEQ ID N0:9中所示的氨基酸序列的表位结 合人 ADAMTS4。
[0012] [5]根据[2]-[4]中任一项所述的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中 (1) 轻链可变区包括包含在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含在SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重链可变区包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所示的 氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:6中所示的氨基酸序列的⑶R3;或 (2) 轻链可变区包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重链可变区包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在选自SEQ ID N0: 1-3的至少一个氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加1-3个氨 基酸，和/或 在选自SEQ ID N0: 4-6的至少一个氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加4-3个氨基 酸。
[0013] [6]根据[5]的抗体，其中所述轻链可变区包含在SEQ ID N0: 7中所示的氨基酸 序列，并且重链可变区包含在SEQ ID N0: 8中所示的氨基酸序列。
[0014] [7]根据[1]_[6]任一项的抗体，其是人抗体。
[0015] [8]药物组合物，其包含根据[1]_[7]任一项的抗体。
[0016] [9]多核苷酸，其编码根据[1]-[7]任一项的抗体。
[0017] [10]载体，其包含根据[9]的多核苷酸。
[0018] [11]转化子，其包含根据[10]的载体。
[0019] [12]用于预防或治疗关节炎的试剂，其包含特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑 制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性的抗体。
[0020] [13]根据[12]的试剂，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0021] [14]根据[12]或[13]的试剂，其中所述抗体是根据[1]_[7]任一项的抗体。
[0022] [15]用于预防或治疗哺乳动物中关节炎的方法，其包括使用有效量的抗体，所述 抗体特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶对哺乳动物的聚集蛋白聚 糖酶活性。
[0023] [16]根据[15]的方法，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0024] [17]根据[15]或[16]的方法，其中所述抗体是根据[1]_[7]任一项的抗体。
[0025] [18]特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖 酶活性的抗体，其用于关节炎的预防或治疗。
[0026] [19]根据[18]的抗体，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0027] [20]根据[18]或[19]的抗体，其是根据[1]_[7]任一项的抗体。
[0028] [21]特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖 酶活性的抗体用于生产用于关节炎的预防或治疗的试剂的用途。
[0029] [22]根据[21]的用途，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。
[0030] [23]根据[21]或[22]的用途，其中所述抗体是根据[1]-[7]任一项的抗体。
[0031]发明的有利效果 根据本发明，提供了一种抗人聚集蛋白聚糖酶抗体(特别是抗人ADAMTS4抗体），其用于 预防或治疗关节炎的进展。
【附图说明】
[0032] 图1候选Fab与ADAMTS4和ADAMTS5的免疫反应性，以及它们对ADAMTS4聚集蛋白聚 糖酶活性的抑制。(A)转移到PVDF膜上的重组ADAMTS4(左)和ADAMTS5(右）（各100 ng/泳道） 与每一个候选Fab(克隆237-1、237-5、237-21、237-43或237-53)反应，然后进行免疫印迹。 (B)ADAMTS4活性被Fab抑制。重组ADAMTS4 (180 ng)与每种Fab(克隆237-1、237-5、237-21、 237-43或237-53)或对照Fab以1:1摩尔比反应，并且然后与聚集蛋白聚糖（100 yg)在37°C 一起孵育16小时。用抗聚集蛋白聚糖新表位(NITEGE392)抗体通过免疫印迹评价ADAMTS4的 聚集蛋白聚糖酶活性。TS(-)，单独缓冲液;Fab (-)，ADAMTS4不与Fab-起孵育；对照，对照 Fab〇
[0033] 图2抗ADAMTS抗体（克隆237-53)与ADAMTS、ADAM和MMP种类的免疫反应性。（A) ADAMTS4、5和1，ADAMIO，12和17，以及MMP1、2、3、9和13的银染凝胶。样品（100 ng/泳道)进行 SDS-PAGE并且凝胶用银染试剂盒染色。（B)抗体(克隆237-53)与ADAMTS、ADAM和MMP种类的 免疫反应性。转移到PVDF膜上的样品用抗ADAMTS抗体克隆237-53进行免疫印迹。注意，抗体 与ADAMTS4和ADAMTS5反应，但是不与其它ADAMTS、ADAM和MMP种类反应。
[0034] 图3抗ADAMTS抗体(克隆237-53)的结构域图谱分析。（A和B)抗体与ADAMTS4的每个 结构域的免疫反应。通过HJREfrex制备对应ADAMTS4的金属蛋白酶(MET)结构域、解联蛋白 和血小板反应蛋白结构域(Dis/TSP)、解联蛋白（Dis)结构域或血小板反应蛋白结构域 (TSP)的重组FLAG/DHFR标记的蛋白。这些蛋白用抗FLAG抗体（阳性对照；左）或抗体克隆 237-53(右)进行免疫印迹。
[0035] 图4通过抗ADAMTS抗体(克隆237-53)对ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性 的抑制，以及抗体对IL-la刺激的软骨细胞中ADAMTS种类的表达和聚集蛋白聚糖酶活性的 作用。(A)抗ADAMTS抗体(克隆237-53)对ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。 重组ADAMTS蛋白与抗ADAMTS抗体以1 : 0.2-5(酶:抗体)的摩尔比或与对照正常IgG(对照； 1:5摩尔比）反应，并然后与聚集蛋白聚糖一起孵育。通过免疫印迹用抗聚集蛋白聚糖新表 位抗体(上）监测聚集蛋白聚糖消化。通过免疫印迹的光密度分析评价抑制（下h(B)抗体 (克隆237-53)对IL-la-刺激的软骨细胞中ADAMTS4和ADAMTS5的mRNA表达和聚集蛋白聚糖 酶活性的作用。骨关节炎软骨细胞在存在和不存在IL-la和抗ADAMTS抗体或对照正常IgG (对照）的情况下培养。然后，分别通过RT-PCR和用抗聚集蛋白聚糖新表位抗体的免疫印迹 检查这些ADAMTS种类(左)的mRNA表达和在条件培养基中（右)聚集蛋白聚糖酶活性。GAPDH， 针对加载的样品的对照。 具体实施方案
[0036]本发明提供对人聚集蛋白聚糖酶具有特异性结合活性，并且抑制聚集蛋白聚糖酶 的聚集蛋白聚糖酶活性的抗体。
[0037]聚集蛋白聚糖酶是一种已知的蛋白酶，其是ADAMTS (具有血小板反应蛋白基序的 解联蛋白和金属蛋白酶)蛋白家族的成员，并且作用于和降解称为聚集蛋白聚糖的蛋白聚 糖。聚集蛋白聚糖酶包括 ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS 1、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS 15等。
[0038] 人ADAMTS4的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO: 15， 人ADAMTS4的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO: 14， 人ADAMTS5的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO: 17,和 人ADAMTS5的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO: 16。
[0039]本发明的抗体具有针对人聚集蛋白聚糖的特异性结合活性。
[0040] "人聚集蛋白聚糖酶"是指聚集蛋白聚糖酶的氨基酸序列或核苷酸序列具有与人 天然表达的聚集蛋白聚糖酶的氨基酸序列或核苷酸序列相同或基本相同的氨基酸序列或 核苷酸序列。"基本上相同的"是指目的氨基酸序列或核苷酸序列具有70%或更多（优选 80%或更多，更优选90%或更多，进一步优选95%或更多，最优选99%或更多）的与在人中 天然表达的特定聚集蛋白聚糖酶的氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，并且具有特定的人 聚集蛋白聚糖酶的功能。人以外的生物物种，聚集蛋白聚糖酶之外的蛋白，其基因和片段也 以相同的方式解释。
[0041] 抗体对抗原X的"特异性结合"是指在抗原抗体反应中抗体对抗原X的结合亲和力 比对非特异性抗原的结合亲和力更高(例如，牛血清白蛋白（BSA))。
[0042] 本发明的抗体具有抑制人聚集蛋白聚糖酶的酶活性的活性。人聚集蛋白聚糖酶的 酶活性，具体是指人聚集蛋白聚糖酶的裂解聚集蛋白聚糖(例如，人或猪聚集蛋白聚糖）的 活性。人聚集蛋白聚糖酶的切割聚集蛋白聚糖的活性可以通过如下进行评价:将猪聚集蛋 白聚糖和人聚集蛋白聚糖在37°C孵育16小时，用软骨素酶ABC和角蛋白酶使它们去糖基化， 并且通过，根据例如，Yatabe T,等 Ann Rheum Dis. 2009;68:1051-8和Hashimoto G,等 J Biol Chem. 2004; 279:32483-91中所述的方法使用抗NITEGE392聚集蛋白聚糖的新表位 的抗体进行免疫印迹分析所获得的反应产物。
[0043]在优选的实施方案中，本发明的抗体具有对人ADAMTS4的特异性结合活性，并抑制 人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性。
[0044]除了人ADAMTS4聚集蛋白聚糖酶活性之外，本实施方案的抗体优选还抑制，人 ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。
[0045] 在本说明书中，"抗体"用来涵盖全长抗体和其任何抗原结合片段（8卩"抗原结合部 分"）或其单链的抗体。"抗体"是指包含通过二硫键连接的至少两条重链(H)和两条轻链 (L)，或其抗原结合部分的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为V H)和重链恒定区构 成。重链恒定区由Ch1，Ch2和Ch3的3个结构域构成。每条轻链由轻链可变区（本文缩写为Vl) 和轻链恒定区构成。轻链恒定区由单个结构域Cl构成。Vh和Vl区进一步细分成具有更高的可 变性的区域称为互补决定区（CDR)，其包含分散在其中的更高度保守区域，称为框架区 (FR)。每个V H和Vl由3个CDR和4个FR构成，其以下列顺序排列，即，从氨基末端到羧基末端 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合 结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞 (例如效应子细胞)和常规补体系统的第一组分(Clq)的结合。
[0046] 在本说明书中，抗体的"抗原结合部分"用于指保留特异性结合抗原（例如，人 ADAMTS4)的能力的抗体的一个或多个片段。已阐明，抗体的抗原结合功能由全长抗体的片 段执行。包括在术语抗体的"抗原结合部分"中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由Vl，Vh， Cl和CH1结构域构成的单价片段；（ii )F(ab'）2片段，包含由铰链区中二硫键连接的两个Fab 片段的二价片段，（iii)Fab'片段，具有铰链区部分的固有的Fab(参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed.，3. sup. rd ed. 1993)，（iv)由Vh和Chi结构域构成的Fd片段；（v) 在抗体的单个臂中由Vl和Vh结构域构成的Fv片段，（vi)由Vh结构域构成的dAb片段(Ward 等，（1989) Nature 341:544_546)，（vii)分离的互补决定区（CDR)和（viii)纳米抗体，其 是含有单个可变结构域和两个恒定区的重链可变区。尽管V L和VH，其是Fv片段的两个结构 域，由不同的基因编码，但是它们可以通过合成的接头连接以通过重组技术从它们产生单 条蛋白链，其中，在此链中，Vl和Vh区彼此配对以形成单价分子(称为单链FKscFv);参见，例 如Bird 等（1988) Science 242: 423-426;和Huston 等，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。这样的单链抗体也涵盖在抗体的"抗原结合部分"中。这样的抗 体片段由本领域普通技术人员通过在已知的常规技术获得，并且以与未修饰的抗体的相同 方式针对有用性进行筛选。
[0047] 本发明的抗体优选是单克隆抗体。"单克隆抗体"是指单分子组合物的抗体分子的 制备。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
[0048] 本发明的抗体优选是人抗体或人源化抗体。"人抗体"是指在框架区和CDR区两者 中具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，当抗体含有恒定区时，所述恒 定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。在本说明书中，"人抗体"还甚至涵盖包括不是由人 种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的实施方案(例如，通过在体外的随机或位点定向 诱变或体内的体细胞突变引入的突变）。此外，在本说明书中，"人源化抗体"是指这样的抗 体，其中衍生自除人之外的动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列融合在人构架序列上。
[0049] 在本说明书中，人抗体涵盖"重构的人抗体"。重构的人抗体是指修饰的抗体，其中 包含在第一人类供体抗体中的至少一个CDR而不是第二人受体抗体的CDR，用在第二人受体 抗体中。优选地，所有6个CDR都是被置换的。更优选的是，使用第一人供体抗体的整个抗原 结合区（例如，Fv、Fab或F(ab'）2)，而不是第二人受体抗体中的相应相应区域。更优选，所述 第一人供体抗体的Fab区可操作地连接到第二人受体抗体的合适的恒定区从而形成全长抗 体。
[0050] 该重构的人抗体可以通过公开于例如EP125023，W096/02576,上述文献15等的常 规基因重组技术产生。具体地讲，例如，设计以连接供体人抗体中期望的CDR和受体人抗体 中期望的框架区（FR)的DNA序列通过PCR方法合成，使用几个寡核苷酸作为引物，生产所述 寡核苷酸以具有与CDR和FR两者的末端区重叠的区域(参见W098/13388中所述方法）。将所 得的DNA连接到编码人抗体恒定区或人抗体恒定区突变体的DNA，其被掺入到表达载体中， 并且所述载体导入宿主，以允许生产，由此可以获得重构的人抗体（参见EP125023，W096/ 02576) 〇
[0051] 此外，在本说明书中，人抗体涵盖"人工的人抗体"。人工的人抗体可以通过公开于 例如上述文献15等的常规基因重组技术产生。
[0052] 本发明的抗体还包括融合蛋白，其中上述抗体和其它肽或蛋白质融合。融合蛋白 的制备方法包括:将编码本发明抗体的多核苷酸和编码其它肽或多肽的多核苷酸连接，以 匹配框架，并将其引入到表达载体中，并允许其在宿主中表达，并且可以使用本领域技术人 员已知的技术。至于与本发明的抗体融合的其它的肽，可以使用已知的肽，诸如FLAG(Hopp， T.P?等，BioTechnology (1988) 6，1204-1210)、由6个His(组氨酸）残基组成的6XHis、 10\把8、人(3-1^(3片段、￥3￥-6?片段、？18111￥片段、了7标签、批￥标签4标签、3￥401'抗原片段、 lck标签、a微管蛋白片段、B标签、蛋白C片段等。与本发明的抗体融合的其它多肽的实例包 括GST(谷胱甘肽-S-转移酶）、HA(流感血凝素）、免疫球蛋白恒定区、半乳糖苷酶、MBP(麦 芽糖结合蛋白）等。编码这样的肽或多肽的市售的多核苷酸与编码本发明抗体的多核苷酸 融合，并且表达由此制备的融合多核苷酸，从而可以制备融合多肽。
[0053]本发明的抗体可以是与各种分子结合的缀合抗体，诸如，诸如聚乙二醇(PEG)、透 明质酸等的聚合物物质、放射性物质、荧光物质、发光物质、酶、毒素等。这种缀合抗体可以 通过化学修饰所得到的抗体来获得。在该领域已经建立了抗体的修饰方法（例如， US5057313，US5156840)。
[0054]本发明的抗体优选是分离的或纯化的。"分离的或纯化的"是指除去目的组分之外 的组分的操作已经应用到天然存在的状态。本发明的分离的或纯化的抗体的纯度(本发明 的抗体的重量与总的蛋白的重量比）通常是50%或更多，优选70%或更多，更优选90%或更 多，最优选95%或更多（例如，基本上100%)。
[0055]在一个具体的实施方案中，本发明的抗体在包含SEQ ID N0:9(YCEGRRTRF)所示的 氨基酸序列的表位特异性结合人ADAMTS4并抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性。 [0056] 包含SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列的表位包括，例如，由SEQ ID N0::15所示的 氨基酸序列的连续部分序列组成的表位，其包含SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列，并且优选 具有20个或更少，更优选12或更少的氨基酸长度。作为包含SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列 的表位，具体而目，可以提及 由SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列组成的表位， 由SEQ ID NO: lO(GGKYCEGRRTRF)所示氨基酸序列组成的表位， 由SEQ ID NO: ll(GKYCEGRRTRFR)所示氨基酸序列组成的表位， 由SEQ ID NO: 12(KYCEGRRTRFRS)所示氨基酸序列组成的表位，和 由SEQ ID NO: 13(YCEGRRTRFRSC)所示氨基酸序列组成的表位。
[0057] SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列是人ADAMTS4的部分氨基酸序列，并且没有显示出 与人类ADAMTS5的相应部分序列非常高的同一性。然而，令人惊奇的是，除了人ADAMTS4的聚 集蛋白聚糖酶活性之外，在包含SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列的表位特异性结合人 ADAMTS4的抗体也可以抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶的活性。
[0058]特异性结合人ADAMTS4并抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性的抗体的具体实 例包括下文(1)或(2)中所述的抗体： (1) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体， 其中所述轻链可变区包括包含在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含在SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并 且重链可变区包括包含SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQIDN0 :5中所示 的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:6中所示的氨基酸序列的⑶R3;和 (2) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体， 其中轻链可变区包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重链可变区包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在选自SEQ ID N0: 1-3的至少一个氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1-3 个氨基酸，和/或 在选自SEQ ID N0: 4-6的至少一个氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1-3个氨 基酸。
[0059] 在实施方案(2)中，仅在轻链可变区的CDR3的氨基酸序列中置换，缺失，插入，和/ 或仅添加优选1_3(优选1或2,更优选1)个氨基酸。
[0060] 用于用其它期望的氨基酸置换一个或多个氨基酸残基的方法的实例包括位点定 向诱变法（Hashimoto-Gotoh, T，Mizuno，T，Ogasahara, Y，和 Nakagawa，M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152， 271-275; Zoller， MJ，和Smith， M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100， 468-500; Kramer,ff, DrutsaJansen,Hff, Kramer，B， Pflugfelder，M，和Fritz， HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12， 9441-9456; Kramer ff, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154， 350-367， Kunkel， TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82，488-492)。使用这些方法，抗体中期望的氨 基酸可以被其它目标氨基酸置换。此外，使用文库技术诸如框架改组(Mol Immunol. 2007 Apr; 44( 11): 3049-60)和CDR修复(US2006/0122377)等，在框架或CDR中的氨基酸，也可以 被其它适当的氨基酸置换。
[0061 ]在本发明的抗体中，选择能够使CDR形成良好的抗原结合位点的框架，作为连接到 CDR的抗体构架区（FR)。尽管用于本发明抗体的FR没有特别限制，并且可以使用任意的FR， 但是优选使用人抗体的FR。作为人抗体的FR，可以使用具有天然序列的抗体，或者根据需 要，在具有天然序列的框架区中的一个或多个氨基酸可以被置换，缺失，添加和/或插入等， 以便CDR将形成适当的抗原结合位点。例如，可以通过测量和评价具有含有置换的氨基酸的 FR的抗体对抗原的结合活性，选择具有期望性质的突变FR序列（Sato, K.等，Cancer Res. (1993)53， 851-856)。
[0062]在⑴和(2)的抗体中，优选使用人抗体的Vk4(Kabat数据库）的FR用于轻链并且优 选使用人抗体的VHla(Kabat数据库）的FR用于重链。
[0063] 用于本发明的抗体的恒定区没有特别限制，并且可以使用任何恒定区。用于本发 明的抗体恒定区的优选的实例包括人抗体的恒定区（衍生自IgG 1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、 IgM等的恒定区）。例如，在H链中可以使用Cy l、Cy 2、Cy 3、(：丫4、〇1、(：5、〇€[1、0€[2、0￡，并且 在L链中可以使用Ck、CA。
[0064] 在（1)和(2)的抗体中，优选使用人抗体的Ck的恒定区用于轻链，并且优选使用人 抗体的Cy 1的恒定区用于重链。
[0065] 本发明的优选抗体包括以下内容： (T)包含轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包含在SEQ ID N0: 7中所示的氨基酸序列，并且重链可变区包含在SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列。
[0066] 上述(1'）的抗体对应上述(1)的抗体的优选的实施方案。
[0067]除了人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性之外，上述（1)和（2)的抗体优选地也抑制 人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。
[0068]在一个具体的实施方案中，上述（1)和（2)的抗体在包含SEQ ID N0:9所示的氨基 酸序列的表位特异性结合人ADAMTS4并抑制人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性。除了人 ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性之外，所述抗体也可以抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活 性。
[0069] 本发明提供了包含编码本发明的上述抗体的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷 酸可以是DNA或RNA，或DNA/ RNA嵌合体。所述多核苷酸可以是双链或单链的。当多核苷酸是 双链的，其可以是双链DNA，双链RNA或DNA: RNA杂合体。
[0070] 本发明的多核苷酸涵盖包含编码本发明抗体的重链可变区和轻链可变区两者的 核苷酸序列的多核苷酸，以及包含编码本发明抗体的重链可变区的核苷酸序列的多核苷酸 与包含编码本发明抗体的轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的组合。
[0071] 本发明的多核苷酸可以容易地基于本发明抗体的氨基酸序列的信息，已知序列信 息和本说明书中序列表中描述的序列信息，并利用已知的基因重组技术进行生产。例如，基 于序列信息设计合适的引物，编码构成本发明抗体的元件的DNA通过PCR反应扩增，DNA片段 通过适当的酶诸如连接酶等进行连接，由此可以生产本发明的多核苷酸。可替代地，编码每 个元件的多核苷酸可以由多核苷酸合成仪合成，基于本发明抗体的氨基酸序列的信息。
[0072] 所获得的编码本发明抗体的多核苷酸可以根据上述目的直接使用，或需要时用限 制性酶消化或添加接头后使用。多核苷酸可具有ATG作为对5 '末端侧上的翻译起始密码子， 并且可具有TAA、TGA或TAG作为3'末端侧的翻译终止密码子。这些翻译起始密码子和翻译终 止密码子可以用合适的合成DNA接头来添加。
[0073] 本发明的多核苷酸优选是分离的或纯化的。本发明的分离的或纯化的多核苷酸具 有通常50 %或更多，优选70 %或更多，更优选90 %或更多，最优选95%或更多（例如，基本上 100%)的纯度(本发明的多核苷酸的重量与总的多核苷酸的重量比）。
[0074] 本发明提供了包含上述本发明的多核苷酸的载体。本发明的载体涵盖含有包含编 码本发明抗体的重链可变区和轻链可变区两者的核苷酸序列的多核苷酸的载体，以及含有 包含编码本发明抗体的重链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的载体与含有包含编码本发 明抗体的轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的载体的组合。所述载体优选是分离的或纯 化的。载体的实例包括表达载体、克隆载体等，其可以根据目的进行选择。优选地，所述载体 是表达载体。所述表达载体可以表达本发明的抗体。表达载体可通过在合适的表达载体中 将本发明的多核苷酸可操作地连接到启动子的下游来生产。这类载体包括，例如，质粒载 体，病毒载体等，其可以根据要使用的宿主适当地选择。
[0075]作为宿主，使用埃希氏菌属(大肠杆菌(Escherichia coli)等）、芽孢杆菌属(枯草 芽抱杆菌(1^(3；[11113 311131：；[118)等）、酵母(酿酒酵母(3&(^11&1'01115^6306代￥181&6)等）、昆 虫细胞（衍生自甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae)(草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)细 胞;Sfcell)等的幼虫的建立的细胞系）、昆虫(家蚕(Bombyx mori)幼虫等）、哺乳动物细胞 (大鼠神经细胞、猴细胞(C0S-7等）、中国仓鼠细胞(CH0细胞等)等)等。
[0076]哺乳动物的实例包括，但不限于，实验动物，诸如啮齿动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠和 豚鼠等，兔等，家养动物诸如猪、牛、山羊、马、绵羊、貂等，陪伴动物诸如狗、猫等，灵长类动 物如人、猴、食蟹猴、猕猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等等。
[0077]质粒载体的实例包括衍生自大肠杆菌的质粒载体(例如，pBR3 2 2、pBR3 25、pUC 12、 pUC 13 )，衍生自枯草芽孢杆菌的质粒载体(例如，pUB 110、pTP5、pC 194)，衍生自酵母的质粒 载体(例如，pSH19，pSH15)等，其可以根据要使用的宿主和使用的目的适当地选择。
[0078] 病毒载体的种类可根据所使用的宿主种类和使用目的进行适当选择。例如，当使 用昆虫细胞作为宿主时，可以使用杆状病毒载体等。当使用哺乳动物细胞作为宿主时，可以 使用逆转录病毒载体，诸如Moloney鼠白血病病毒载体、慢病毒载体、新培斯病毒载体等、腺 病毒载体、疱疹病毒载体、腺相关病毒载体、细小病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体 等。
[0079] 可以根据所要使用的宿主的种类选择启动子，并且可以选择能够在宿主中起始转 录的启动子。例如，当宿主是埃希氏菌属时，trp启动子、lac启动子、T7启动子等是优选的。 当宿主是芽孢杆菌属时，SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等是优选的。当宿主是酵母 时，PH05启动子、PGK启动子等是优选的。当宿主是昆虫细胞时，多角体蛋白启动子、P10启动 子等是优选的。当宿主是哺乳动物细胞时，亚基因组(26S)启动子、CMV启动子、SRa启动子等 是优选的。
[0080] 本发明的载体可以包含用于抗体分泌的信号序列。当抗体在大肠杆菌的周质中生 产时作为用于抗体分泌的信号序列，可以使用pelB信号序列（Lei，S. P.等J. Bacteriol. (1987) 169， 4379)。
[0081] 当需要时，本发明的载体可以包含各自以可操作模式的增强子、剪接信号、多聚A 添加信号、选择标志物、SV40复制起始点（下文有时缩写为SV40or i )等。选择标志物的实例 包括二氢叶酸还原酶（下文中有时缩写为dhfr)基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]，氨苄青霉素抗 性基因（有时缩写为AmpD，新霉素抗性基因（有时缩写为Nec/，G418抗性)等。
[0082]通过用本身已知的基因转移方法(例如，脂质转染法，磷酸钙法，微注射法，原生质 体融合法，电穿孔法，DEAE葡聚糖法，通过基因枪的基因转移方法等)将本发明的上述载体 导入上述宿主，可以生产其中导入该载体的转化体(本发明的转化体）。当使用表达载体作 为被导入的载体时，所述转化体可表达本发明的抗体。本发明的转化体可用于生产本发明 的抗体等。
[0083] 本发明的抗体可通过根据宿主的种类以本身已知的方法培养本发明的转化体，并 从培养物分离本发明的抗体来生产。当宿主是埃希氏菌属时，转化体在适当的培养基中培 养，诸如LB培养基，M9培养基等，在通常约15-43°C进行约3-24小时。当宿主是芽孢杆菌属 时，转化体在适当的培养基中培养，在通常约30_43°C进行约6-24小时。当宿主是酵母时，转 化体在适当的培养基中培养，诸如伯克霍尔德氏培养基等，在通常约20°C_35°C进行约24-24-72小时。当宿主为昆虫细胞或昆虫时，转化体在适当培养基中诸如添加约10%牛血清的 Grace昆虫培养基等中培养，通常在约27°C进行约3-5天。当宿主为动物细胞时，转化体在适 当培养基中诸如添加约10%牛血清的MEM培养基等中培养，通常在约30°C - 40°C进行约15 -60小时。在任何培养中，通气和搅拌可以根据需要进行。
[0084] 对于通过基因改造生产抗体的方法，可以参考例如Co, M. S.等，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976; Better, M?和Horwitz， A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178， 476-496; Pluckthun, A?和Skerra, A.， Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515 ; Lamoyi , E. , Methods Enzymol. (1986) 121 , 652-663; Rousseaux, J?等， Methods Enzymol. (1986) 121， 663-669; Bird, R. E?和Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9，132-137等。
[0085] 本发明抗体从培养物中的分离和纯化不以任何方式限制，并且可以采用通常用于 抗体纯化的分离和纯化方法。例如，抗体可以通过适当地选择和组合层析柱、过滤器、超滤、 盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析、重 结晶等进行分离和纯化。
[0086] 所述层析的实例包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸 附层析等（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。这些层析可以通过使用液相层析，例如诸如HPLC，FPLC等的液 相层析进行。用于亲和层析的柱的实例包括蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作为使用蛋白A的柱， 可以提及Hyper D、P0R0S、琼脂糖凝胶FF(由GE Amersham Biosciences制造）等。本发明还 涵盖通过这些纯化方法高度纯化的抗体。
[0087] 此外，本发明提供了含有上述本发明抗体作为活性成分的药物组合物。聚集蛋白 聚糖酶(特别是，ADAMTS4和5)降解聚集蛋白聚糖并促进关节炎诸如骨关节炎，类风湿性关 节炎等中的软骨破坏。因此，本发明的抗体的施用抑制聚集蛋白聚糖酶的活性，抑制聚集蛋 白聚糖的降解，抑制软骨破坏，并且，结果是，可以预防或治疗关节炎的进展。因此，本发明 抗体和本发明的药物组合物作为用于关节炎的进展等的预防或治疗剂是有用的。特别是， 在实施方案中，本发明的抗体可以同时抑制多种聚集蛋白聚糖酶，其中所述抗体不仅抑制 人ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性，还抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。因此，可以预 期优异的软骨变性或破坏抑制效果，和对关节炎的优异的预防或治疗效果。不特别限制关 节炎的种类，只要其伴有通过聚集蛋白聚糖酶(特别是，ADAMTS4和5)对聚集蛋白聚糖的降 解导致的软骨破坏或变性，并且本发明的抗体提供了预防或治疗效果。其实例包括，但不限 于，在例如，骨关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎等中由于聚集蛋白 聚糖的降解导致的关节软骨变性或破坏，椎间盘突出症中的椎间盘的变性和破坏等。
[0088] 此外，由于已经指出ADAMTS4和5参与在脑肿瘤(胶质母细胞瘤）中由于短小蛋白聚 糖降解导致的脑肿瘤细胞的浸润、在难治性血管炎中由于多能聚糖降解导致的血管破坏、 皮肤组织的破坏，在皮肤慢性溃疡中由于多能聚糖降解和其产物导致的过量修复作用等、 瘢痕瘤等，本发明的抗体和本发明的药物组合物作为用于这些疾病进展的预防或治疗剂等 也是有用的。
[0089]当本发明的抗体"作为活性成分被包含"时，这意味着本发明的抗体作为活性成分 的至少一种被包含，并且不限制其含量。本发明的药物组合物可以包含其它活性成分连同 本发明的抗体。
[0090] 本发明的抗体可以按照常规方法进行配制（例如，Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U. S. A) 〇而且，在必要 时，它可以含有药学上可接受的载体和/或添加剂。例如，它可以包含表面活性剂(PEG，吐温 等）、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等）、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂(磷酸盐，柠 檬酸盐、其它有机酸等）、螯合剂(EDTA等）、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流 剂、矫味剂等。不被限定于这些，本发明的药物组合物可适当地含有其它常规的载体。具体 的实例包括轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲基纤维素 钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙胺乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明 胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐 等。它也可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶和蛋白，诸如免疫球蛋白等，以及 氨基酸。当配制用于注射的水溶液时，本发明的抗体溶解于，例如，包含盐水、葡萄糖或其它 辅剂的等渗溶液。辅剂的实例包括D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，并且可以与合 适的增溶剂，例如醇（乙醇等）、多元醇(丙二醇、PEG等）、非离子表面活性剂(聚山梨醇酯80， HCL-50)等组合使用。
[0091]如果需要，多肽也可以包含在微胶囊中（由羟乙基纤维素，明胶，聚[甲基丙烯酸甲 酯]等制成的微胶囊），或配制成胶体药物递送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒 和纳米胶囊等）（参见，Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &，Oslo Ed. (1980)等）。此外配制药物作为缓释药物的方法也是已知的，并适用于多肽(Langer 等，J. Biomed. Mater. Res. (1981)15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12: 98-105;美国专利号 3,773,919;￡卩-厶-58,481;51(111^11等，81〇?〇171116^(1983) 22:547- 56;欧洲专利号133,988)。此外，也可以通过添加或掺合透明质酸酶到本发明试剂中或与本 发明试剂一起，增加皮下施用的液体量(例如，W02004/078140等）。
[0092]药物组合物中本发明的抗体含量为整个药物组合物的，例如，约0.01-100重量％， 优选 0.1-99.9%。
[0093] 虽然本发明的药物组合物可以口服和肠胃外施用，优选肠胃外施用。具体而言，其 通过注射或透皮施用给予患者。作为注射剂型的实例，其可以全身和局部通过静脉内注射、 肌内注射、皮下注射等施用。其也可通过局部注射，特别是肌肉内注射施用到治疗部位或其 附近。经皮施用的剂型的实例包括软膏、凝胶、霜剂、膏药、贴剂等，其可全身和局部施用。另 外，施用方法可以适当地根据患者的年龄和症状选择。作为本发明的抗体，剂量可以选自， 例如，0.5 mg-1 Omg/kg体重的范围。然而，本发明的药物组合物并不受这些剂量的限制。
[0094] 本说明书中引用的所有参考文献，包括出版物、专利文献等，在此单独和具体地通 过引用并入，达到其整体已在本文中具体公开的程度。 实施例
[0095] 本发明在下面通过参考实施例进行更详细地解释，所述实施例不应当被解释为限 制性的。在实施例中的各种基因操作，按照Molecular cloning第三版（Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中描述的方法。
[0096]材料和方法 B策菌体展示库筛选(panning)和Fab的生成。
[0097] 使用人组合抗体库（HuCAL; MorphoSys AG, Martinried, Germany)生成对 ADAMTS4和ADAMTS5特异性的单克隆Fab抗体的生产。重组ADAMTS4和ADAMTS5(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)进行生物素化，并与HuCAL-起孵育。结合的Fab表达噬菌体在三 个连续的筛选轮次中富集。Fab基因池从噬菌粒分离并插入大肠杆菌表达载体，其导致装备 有Strep-标签II的Fab的功能性周质表达。转化后，挑取单独的菌落，并在微量滴定板中生 长。通过与异丙基0硫代半乳糖苷过夜孵育诱导抗体的表达后，将细胞酶促裂解，并且粗提 取物通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测试。对于在ELISA中给出对抗原的强信号的克 隆，确定抗体VH CDR区的DNA序列。选择含有Fab的菌落用于后续的纯化，并且一些Fab被重 排到全人IgGl中用于进一步实验。
[0098] 重组人 ADAMTS4 和 ADAMTS5。
[0099]含有编码人ADAMTS4的Phe213-Cys685残基的cDNA片段的表达载体，所述片段对应 ADAMTS4的金属蛋白酶、解联蛋白、血小板反应蛋白和富含半脫氣酸的结构域，在C末端具有 Strep-标签II，使用脂质体转染（Lipofectamine)(Life Technologies, Rockville, MD) 转染HEK293T细胞。培养基在转染2天后收获，并且重组人ADAMTS4通过根据制造商的说明书 (IBA Biotechnica, Hanover, Germany)，使用Strep-Tactin琼脂糖进行纯化。含有金属蛋 白酶，解联蛋白和血小板反应蛋白结构域(ADAMTS5的Ser 262-Pro622残基）的重组ADAMTS5蛋 白购自R&D Systems Inc〇 [0100] 人抗-ADAMTS抗体的免疫印迹。
[0101]人ADAMTS1(R&D Systems)、ADAMTS4、ADAMTS5(R&D Systems)、ADAMTS15(R&D Systems)、ADAM10(R&D Systems)、ADAM12(Mochida Pharmaceutical Co.， Ltd.， Tokyo, Japan)、ADAM17(R&D Systems)和MMP_13(Millipore, Billerica, MA)的重组蛋白和纯化 的人MMP-l、MMP-2、MMP-3和MMP_9(Daiichi Fine Chemical, Co. , Ltd.，Toyama, Japan) 在还原条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并且将在凝胶上分 离的样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与针对ADAMTS种类的候选Fab-起(5 yg/ 1111;克隆237-1、237-5、237-21、237-43和237-53)在4°(：孵育16小时。用含有0.1%1￥661120 的磷酸盐缓冲盐水洗涤后，将膜与针对人IgG(Invitrogen, Carlsbad, CA)的辣根过氧化 物酶缀合的第二抗体在室温下1小时进行反应。化学发光试剂(Pierce ECL蛋白质印迹底 物；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)用于使标记的蛋白质条带是可见的。还检 查了银染凝胶上的所有样品，其通过银染试剂盒(Cosmo Bio Co., Ltd, Carlsbad, CA)制 备。
[0102] 用人抗-ADAMTS抗体(克隆237-53)对ADAMTS4和5的聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。
[0103] 重组ADAMTS4(180 ng)和ADAMTS5(180 ng)在37°C下与人抗ADAMTS抗体（IgGl;克 隆237-53)以1:0.2-5的摩尔比（酶:抗体)或人对照正常IgGl(R&D Systems)孵育30分钟，然 后在37°C下与猪聚集蛋白聚糖（lOOyg)-起反应16小时。聚集蛋白聚糖用软骨素酶ABC和角 蛋白酶（Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan)去糖基化后，通过使用抗NITEGE392聚集 蛋白聚糖新表位抗体（1.2μg/ml)的免疫印迹监测聚集蛋白聚糖酶活性(Hashimoto G,等J Biol Chem. 2004;279:32483-91)。蛋白带的密度通过使用ImageJ分析软件（National Institute of Health, Bethesda, MD)的光密度测定进行评价。
[0104] 抗ADAMTS抗体(克隆237-53)的结构域作图。
[0105] ADAMTS4的各结构域和具有NH2-或C00H-末端缺失的血小板反应蛋白的结构域的 重组FLAG和二氢叶酸还原酶（DHFR)-标记的蛋白使用无细胞翻译系统（PUREflex)(Gene Frontier Corporation, Chiba, Japan)合成。这些样品进行SDS-PAGE，然后用抗FLAG抗体 (Sigma-Aldrich, St Louis, M0; 2μg/ml)或人抗ADAMTS抗体（克隆237_53;2iig/ml)进行 免疫印迹。
[0106] 表面等离子体共振相互作用(BIAcore)分析 重组ADAMTS种类经由胺偶联共价固定在CM5传感器芯片流动室(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)〇使用BIAcore 3000CGE Healthcare Life Sciences) 将克隆237-53的IgGl注射到腔室。从所确定的KjPKd值计算Kd(亲和力）。
[0107]用抗ADAMTS抗体(克隆237-53)对在培养的软骨细胞中聚集蛋白聚糖酶活性的抑 制。
[0108]从人骨关节炎软骨通过酶解分离的软骨细胞在补充有10 %胎牛血清和25μg/ml抗 坏血酸的Dulbecco改良Eagle培养基/Ham F-12培养基(Sigma-Aldrich)中培养，并且通过 在含有0.2 %乳清蛋白水解物的培养基中培养血清饥饿后，在有或没有白介素_la( IL_la( 1 ng/ml; Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Company Ltd. , Okada, Japan)的情况下 处理24小时。它们用ADAMTS抗体（5μg/ml，克隆237-53)或人对照IgG(5μg/ml; Invitrogen, Carlsbad，CA)处理1小时，并且然后在聚集蛋白聚糖（100yg)的存在下孵育16小时。浓缩的 培养基在去糖基化后进行SDS-PAGE并转移到PVDF膜上。聚集蛋白聚糖酶活性通过用抗 NITEGE 392新表位抗体（1.2iig/ml)的免疫印迹进行评价。根据医院的道德准则从具有骨关节 炎的患者获得对于手术样品的实验用途的知情同意。
[0109] 为了检查ADAMTS4和5的mRNA表达，从有或没有IL-la(l ng/ml)和人抗ADAMTS抗体 (克隆237-53)处理18小时的软骨细胞中制备总RNA，并使用Superscript II逆转录酶(Life Technologies，Rockville，MD)反转录成cDNA。如先前所述，用对ADAMTS4和5以及管家基 因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异性的引物通过PCR扩增cDNA(Naito S，等Pathol Int. 2007;57:703-11)〇
[0110] 结果： 针对ADAMTS4和ADAMTS5的人抗体的筛选 通过使用噬菌体展示方法筛选人抗体文库(HuCAL)，通过ELISA获得共5个克隆（237-1、 237-5、237-21、237-43和237-53)与4041〇^4和4041〇^5两者反应。免疫印迹分析表明，所有 的克隆均识别重组ADAMTS4和ADAMTS5，虽然对ADAMTS5的反应性在克隆之间不同（图1A)。为 了检验候选克隆是否抑制ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶的活性，克隆的Fab种类以1:1的摩尔 比与ADAMTS4-起孵育，并且然后通过使用新表位(NITEGE 392)特异性的抗体进行免疫印迹 监测活性。如在图1B中所示，克隆237-53抑制五个候选克隆中的聚集蛋白聚糖酶的活性。
[0111] 克隆237-53与ADAMTS4和ADAMTS5的免疫反应性 由于克隆237-53显示对ADAMTS4的抑制活性，所以关注该抗体。当通过免疫印迹检验针 对八0經^^0411和]\^3种类的抗体的交叉反应性时，克隆237-53与40410'34和40410'35两者反 应。然而，对于 ADAMTSl、ADAMTS15、ADAM10、ADAM12、ADAM17、MMP-l、MMP-2、MMP-3、MMP-9 或 丽P-13没有获得免疫反应性（图2)。这些数据表明，克隆237-53与通常存在于ADAMTS4和 ADAMTS5中的某些区域发生反应。
[0112] 克隆237-53识别的ADAMTS4表位的确定 为了确定被抗体克隆237-53识别的ADAMTS4的免疫反应性结构域，我们首先检验对通 过PUREf lex产生的单独金属蛋白酶结构域或解联蛋白和血小板反应蛋白结构域的重组蛋 白的反应性。如图3A所示，抗体仅识别解联蛋白和血小板反应蛋白结构域的蛋白。因此，我 们进一步检验了与解联蛋白或血小板反应蛋白结构域的免疫反应性，并且发现，该抗体仅 识别血小板反应蛋白结构域（图3B)，表明ADAMTS4的血小板反应蛋白结构域包含抗体的表 位。
[0113]为了更详细地确定表位，使用具有人ADAMTS4的固定化的部分肽的肽阵列用于抗 体克隆237-53的表位作图。具体地讲，如下表所示，相对覆盖人ADAMTS4的血小板反应蛋白 结构域的序列，产生由具有12个氨基酸残基的残基数目和3个氨基酸残基弥补的肽组成的 肽阵列。HRP标记的抗体克隆237-53与肽阵列反应。
[0114] 结果是，237-53特异性结合于上述肽# 36- # 39。该结果表明，237-53的表位包含 3￡〇10从):9(￥0￡61?^1^)所示的氨基酸序列，其对于肽#36-#39是常见的。
[0115] 培养所获得的克隆237-53的大肠杆菌，并回收质粒(QIAprep Spin Miniprep试剂 盒:QIAGEN制造），并用于DNA序列分析。表2显示⑶R237-53 H链和L链的⑶R(互补决定区）的 氨基酸序列。
[0116] 237-53的H链和L链的可变区的全长氨基酸序列如下。
[0117] 抗体克隆237-53对ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。
[0118] ADAMTS4和ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性通过使用聚集蛋白聚糖新表位特异性 抗体的具有NITEGE392的C00H-末端序列的65-kDa聚集蛋白聚糖片段的免疫印迹展示来进行 测定。如图4A所示，抗体克隆237-53阻断ADAMTS4的活性到原活性的不到20%，而ADAMTS5活 性被轻微抑制到原活性的大约70%。用正常对照186(图4六)没有观察到抑制。使用別 &(3〇代 的动力学分析证明，这种抗体对ADAMTS种类的高亲和力结合，对于ADAMTS4和ADAMTS5分别 显示 1.17X10-8 M和 1.46X10-9 M的KD值。
[0119] 来自骨关节炎软骨的培养的软骨细胞表达ADAMTS5，但不表达ADAMTS4(图4B，左）。 当软骨细胞用IL-la处理时，ADAMTS4被诱导，但ADAMTS5的表达没有变化（图4B，左）。未处理 的软骨细胞的聚集蛋白聚糖酶活性是最小的，但其在IL-la刺激后增加（图4B，右）。当IL-la 刺激的软骨细胞用抗体克隆237-53处理时，聚集蛋白聚糖酶的活性基本上降低到对照水 平，但通过用正常对照IgG处理没有观察到抑制（图4B，右）。
[0120] 工业实用性 根据本发明，提供了对于预防或治疗关节炎的进展有用的抗人聚集蛋白聚糖酶抗体。
[0121]本申请基于美国临时专利申请序列号61/891，087(申请日：2013年10月15日），其 内容通过引用全部并入本文。








【主权项】
1. 特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性 的抗体。2. 根据权利要求1的抗体，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。3. 根据权利要求2的抗体，其还抑制人ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。4. 根据权利要求2或3的抗体，其在包含SEQ ID N0:9中所示的氨基酸序列的表位结合 人ADAMTS4。5. 根据权利要求2-4中任一项的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中 (1) 轻链可变区包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重链可变区包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3;或 (2) 轻链可变区包括包含SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID N0:2 中所示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列的⑶R3,并且 重链可变区包括包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的⑶R1、包含SEQ ID N0:5中所 示的氨基酸序列的⑶R2和包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在选自SEQ ID NO: 1-3的至少一个氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加1-3个氨 基酸，和/或 在选自SEQ ID NO: 4-6的至少一个氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加1-3个氨基 酸。6. 根据权利要求5的抗体，其中所述轻链可变区包含在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸 序列，并且重链可变区包含在SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列。7. 根据权利要求1-6任一项的抗体，其是人抗体。8. 药物组合物，其包含根据权利要求1-7任一项的抗体。9. 多核苷酸，其编码根据权利要求1-7任一项的抗体。10. 载体，其包含根据权利要求9的多核苷酸。11. 转化子，其包含根据权利要求10的载体。12. 用于预防或治疗关节炎的试剂，其包含特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述 聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性的抗体。13. 根据权利要求12的试剂，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。14. 根据权利要求12或13的试剂，其中所述抗体是根据权利要求1-7任一项的抗体。15. 用于预防或治疗哺乳动物中关节炎的方法，其包括施用有效量的抗体，所述抗体特 异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶对哺乳动物的聚集蛋白聚糖酶活 性。16. 根据权利要求15的方法，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。17. 根据权利要求15或16的方法，其中所述抗体是根据权利要求1-7任一项的抗体。18. 特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性 的抗体，其用于关节炎的预防或治疗。19. 根据权利要求18的抗体，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。20. 根据权利要求18或19的抗体，其是根据权利要求1-7任一项的抗体。21. 特异性结合人聚集蛋白聚糖酶并抑制所述聚集蛋白聚糖酶的聚集蛋白聚糖酶活性 的抗体用于生产用于关节炎的预防或治疗的试剂的用途。22. 根据权利要求21的用途，其中所述人聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS4。23. 根据权利要求21或22的用途，其中所述抗体是根据权利要求1-7任一项的抗体。
【文档编号】C07K16/40GK105849128SQ201480056880
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月14日
【发明人】宫越阳, 中川美纪子, 古城周久, 望月早月, 冈田保典
【申请人】基因先端领域株式会社, 学校法人庆应义塾