诱导多能干细胞的分化诱导方法及筛选方法

诱导多能干细胞的分化诱导方法及筛选方法
【专利摘要】发明的课题在于提供一种将iPS细胞高效率地分化诱导为具有目标功能的细胞的方法、以及从制备的iPS细胞中筛选向目的细胞分化诱导效率较高的iPS细胞的方法。本发明涉及一种诱导多能干细胞的分化诱导方法，该方法包括在含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物上培养诱导多能干细胞，其中，结构物中的细胞与经过分化诱导的细胞为相同的细胞型。
【专利说明】
诱导多能干细胞的分化诱导方法及筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及诱导多能干细胞的分化诱导方法、诱导多能干细胞的筛选方法、以及 诱导多能干细胞的筛选试剂盒。
【背景技术】
[0002] 干细胞对再生医疗而言起到了重要的作用。作为具有分化全能性的干细胞，已知 有胚胎干细胞(ES细胞）、胚胎癌性细胞(EC细胞）、胚胎生殖细胞(EG细胞）、核移植ES细胞、 源自体细胞的ES细胞(ntES细胞)及诱导多能干细胞（iPS细胞）；作为具有分化多能性的干 细胞，已知有体性干细胞、组织干细胞及成体干细胞。上述当中，诱导多能干细胞(iPS细胞） 具有分化全能性，是从体细胞人工制备的细胞，因此不存在破坏胚胎、卵细胞所导致的伦理 上的问题，也不存在移植时的适合性的问题，期待其在再生医疗方面的应用。
[0003] 将诱导多能干细胞（iPS细胞)分化诱导为希望的细胞的方法已经报告了多种方 法，例如，报道了分化诱导为胰细胞、肝细胞、心肌细胞、血液细胞、生殖细胞、神经细胞等。 但是，在将使用了诱导多能干细胞(iPS细胞)的再生医疗实用化时，需要建立能够高效率地 分化诱导为具有目标功能的细胞的方法。
[0004] 在专利文献1中记载了如下方法，其是诱发干细胞向特定细胞系统分化的方法，该 方法包括，在组织样品和/或组织样品的细胞外培养基的存在下、于诱发该干细胞向特定细 胞系统分化的条件下，对干细胞进行体外（in vitro)培养，这时，该经过分化的干细胞为与 组织样品相同的细胞型。专利文献1中使用的干细胞为胚胎干细胞(ES细胞），对于诱导多能 干细胞(iPS细胞)没有记载。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:日本特表2005-520516号公报

【发明内容】

[0008] 发明要解决的课题
[0009] 作为将使用了诱导多能干细胞（iPS细胞）的再生医疗实用化时的课题，可以举出： 建立将未分化状态的iPS细胞高效率地分化诱导为具有目标功能的细胞的技术。另外，作为 其它课题，可以举出：建立对iPS细胞的品质进行评价/管理的方法。即，本发明以提供将iPS 细胞高效率地分化诱导为具有目标功能的细胞的方法、以及从制备成的iPS细胞中筛选向 目的细胞分化诱导效率较高的iPS细胞的方法作为待解决的课题。另外，本发明还以提供用 于上述方法中使用的iPS细胞筛选试剂盒作为待解决的课题。
[0010] 解决课题的方法
[0011] 本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，发现通过在以再生为目的的组 织/脏器的冷冻切片上培养iPS细胞，能够实现向目的细胞的分化诱导，从而完成了本发明。
[0012] 即，根据本发明可以提供以下发明。
[0013] (1) -种诱导多能干细胞的分化诱导方法，该方法包括在含有细胞和/或源自细胞 的成分的结构物上培养诱导多能干细胞，其中，结构物中的细胞与经过分化诱导的细胞为 相同的细胞型。
[0014] (2)根据（1)所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为片状结 构物。
[0015] (3)根据（1)或(2)所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为 生物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。
[0016] (4)根据(1)~⑶中任一项所述的方法，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。
[0017] (5) -种经过分化诱导的细胞的制造方法，该方法包括在含有细胞和/或源自细胞 的成分的结构物上培养诱导多能干细胞，其中，结构物中的细胞与经过分化诱导的细胞为 相同的细胞型。
[0018] (6)根据(5)所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为片状结 构物。
[0019] (7)根据(6)或(7)所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为 生物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。
[0020] (8)根据(5)~(7)中任一项所述的方法，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。
[0021] (9)-种诱导多能干细胞的筛选方法，该方法包括通过在含有细胞和/或源自细胞 的成分的结构物上培养诱导多能干细胞来对诱导多能干细胞进行分化诱导，并对分化诱导 效率较高的诱导多能干细胞进行筛选，其中，结构物中的细胞与经过分化诱导的细胞为相 同的细胞型。
[0022] (10)根据(9)所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为片状 结构物。
[0023] (11)根据(9)或（10)所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物 为生物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。
[0024] (12)根据(9)~（11)中任一项所述的方法，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。
[0025] (13)-种用于诱导多能干细胞的筛选的试剂盒，其至少包含含有细胞和/或源自 细胞的成分的结构物。
[0026] (14)根据（13)所述的试剂盒，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为片 状结构物。
[0027] (15)根据（13)或（14)所述的试剂盒，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构 物为生物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。
[0028] (16)根据(13)~（15)中任一项所述的试剂盒，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。
[0029] 发明的效果
[0030] 根据本发明的方法能够将iPS细胞高效率地分化诱导为具有目标功能的细胞。进 而，根据本发明的方法还能够从制备的iPS细胞中筛选出向目的细胞分化诱导效率较高的 iPS细胞。
【附图说明】
[0031] 图1示出在盖玻片上（对照）、正常肝脏切片上、或肝炎肝脏切片上培养得到的iPS 细胞的显微镜图像(培养第2日和培养第8日）。
[0032]图2示出在盖玻片上（对照）或正常肝脏切片上培养得到的iPS细胞的显微镜图像 (培养第3日和第9日）。
[0033]图3示出在脑切片上或脊髓切片上培养得到的iPS细胞的显微镜图像(培养第3日 和第9日）。
[0034]图4示出通过RT-PCR对肝细胞的相关基因(AFP、AAT、ALB)的表达进行研究的结果。
[0035] 图5示出通过RT-PCR对神经细胞的相关基因（如8衍11、冊？、0即386、及6?4?)的表达 进行研究的结果。
[0036] 图6示出对AFP的表达进行免疫细胞化学分析的结果。
[0037] 图7示出对有核细胞中的AFP阳性细胞的比例进行测量的结果。
[0038] 图8示出对AAT的表达进行免疫细胞化学分析的结果。
[0039] 图9示出对有核细胞中的AAT阳性细胞的比例进行测量的结果。
[0040] 图10示出对GFAP的表达进行免疫细胞化学分析的结果。
[0041 ]图11示出对有核细胞中的GFAP阳性细胞的比例进行测量的结果。
[0042]图12示出对CNPase的表达进行免疫细胞化学分析的结果。
[0043 ]图13示出对CNPase的表达进行免疫细胞化学分析的结果。
[0044] 图14示出对有核细胞中的CNPase阳性细胞的比例进行测量的结果。
【具体实施方式】
[0045] 以下，对本发明更详细地进行说明。
[0046] (1)诱导多能干细胞的分化诱导方法、以及经过分化诱导的细胞的制造方法
[0047] 本发明涉及包括在含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物上培养诱导多能干细 胞的诱导多能干细胞的分化诱导方法或经过分化诱导的细胞的制造方法，特别是结构物中 的细胞与经过分化诱导的细胞为相同的细胞型。需要说明的是，结构物中的细胞是否与经 过分化诱导的细胞为相同的细胞型可以通过例如表达的标记物是否相同来判断。
[0048] 作为肝细胞的细胞标记物可以列举:a-胎蛋白（AFP)、a_l抗胰蛋白酶(AAT)、白蛋 白（ALB)、酪氨酸氨基移换酶(TAT)、色氨酸2,3双加氧酶(TD02)、及细胞色素 P450等，没有特 另IJ限定。
[0049] 作为神经细胞的标记物可以列举:巢蛋白（Nestin)、髓磷脂碱性蛋白（MBP)、环核 苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP)、及神经丝(Neurofilament)等， 没有特别限定。
[0050] 作为成骨细胞的标记物可以列举:碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白（osteopontin)、及 骨?丐蛋白（osteocalcin)等，没有特别限定。
[0051]作为胰脏细胞的标记物可以列举:Pdxl、淀粉酶、及羧肽酶等，没有特比限定。
[0052]作为软骨细胞的标记物可以列举：Sox9、II型胶原、及聚集蛋白聚糖（aggrecan) 等，没有特别限定。
[0053] 作为心肌细胞的标记物可以列举:心肌肌f丐蛋白I(cardiac troponin I:cTnI)、 a-肌球蛋白重链(a-MHC)、a心肌肌动蛋白（a-cardiac actin)、及同源框蛋白（homeobox protein)Nkx-2.5等，没有特别限定。
[0054] 本发明中使用的"含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物"的形态没有特别限 定，考虑到在该结构物上培养诱导多能干细胞（iPS细胞），优选为片状结构物。作为含有细 胞和/或源自细胞的成分的片状结构物的一个例子，可以使用生物体组织、脏器的切片或涂 布了源自细胞的成分的培养基材。包含细胞的片状结构物(优选为生物体组织或脏器的切 片）的厚度没有特别限定，通常为1~1〇〇_左右，优选为2~50mi左右，更优选为2~20_左 右。
[0055] 含有源自细胞的成分的结构物可以通过以下方式得到:使用与源自细胞的成分有 相互作用的核酸、微小RNA、抗体或化合物对源自细胞的成分进行纯化，使经过纯化的源自 细胞的成分附着于培养基材上，再用酶、表面活性剂等进行涂布，由此可以得到。另外，通过 使涂布后的培养基材进一步干燥，可以提供能够长期保存的培养基材。
[0056] 本发明中使用的"培养基材"的形态没有特别限定，优选为膜、板或盖玻片。
[0057] 组织或脏器的切片可以优选采集自哺乳动物(优选为小鼠或人等）。在使用生物体 组织或脏器的切片的情况下，对组织或脏器的种类没有特别限定，可以使用含有细胞型与 要从诱导多能干细胞（iPS细胞)分化诱导的分化细胞的细胞型相同的细胞的组织或脏器的 切片。作为组织或脏器的例子，可以列举:肝脏、脑、脊髓、心脏、呼吸器官、生殖器官、肾脏、 胰脏、皮肤、肌肉及骨骼器官等，没有特别限定。例如，在想要从iPS细胞分化诱导为肝细胞 时可以使用肝脏切片，在想要从iPS细胞分化诱导为神经细胞时可以使用含有神经细胞的 切片(例如，脑切片或脊髓切片等）。
[0058]作为源自细胞的成分，可以列举:核酸(DNA或RNA、特别是微小RNA等)或蛋白质等， 特别优选能够在上述细胞中特异性表达的核酸(DNA或RNA、特别是微小RNA)或蛋白质。
[0059] 在本发明的方法中，诱导多能干细胞分化诱导为特定细胞系统，优选分化诱导为 肝脏、神经、肺、前列腺、胰脏、乳腺、肾脏、肠、骨骼、血管、造血系统、心肌、骨骼肌等细胞系 统。
[0060] 诱导多能干细胞是通过向小鼠成纤维细胞中导入0(^3/4、5(?2、1(1€4、(3-1^(3等4种 因子而首次建立的，被命名为iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell, (2006)126:663-676)。其后，使用相同的4种因子也建立了人iPS(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell, (2007)131:861-872.)。进而，还报告了使用不含(：-1^的3种因子的方法(似1?^ &抓1， Yamanaka S.，et al.Nature Biotechnology, (2008)26,101-106)。另外，还报告了将 0CT3/ 4、3(?2、祖勵6、1^28等4种基因导入人成纤维细胞而建立诱导多能干细胞以11^11〇1118〇11 JA.et al.，Science(2007)318:1917-1920.)。另外，还报告了向皮肤细胞中导入0CT3/4、 S0X2、KLF4、C-MYC、hTERT、SV401arge T等6种基因而建立诱导多能干细胞(Park IH，Daley GQ.et al ?，Nature(2007)451:141-146)、以及不向体细胞导入而通过向存在于出生后的组 织中的未分化干细胞中导入0ct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc等来建立诱导多能干细胞（日本特 开2008-307007)。
[0061] 如上所述，诱导多能干细胞(iPS细胞)是指，通过使体细胞或未分化的干细胞初始 化而诱导得到的具有多潜能性和自体增殖能力的细胞。并不限定于来自体细胞，可以源自 胚胎、胎儿、或成熟体中的任一种。体细胞对来源动物种类没有特别限定，优选为哺乳动物， 更优选为人或小鼠等。作为体细胞，可以列举例如:成纤维细胞、上皮细胞、肝细胞、血液细 胞等，没有特别限定。本发明中使用的诱导多能干细胞的制造方法没有特别限定，对导入因 子、导入方法等也没有特别限定。作为与诱导多能干细胞有关的公知的文献，除了上述的以 外，还可以列举：日本特开2008-283972、US2008-2336610、US2009-047263、W02007/069666、 TO2008/118220、TO2008/124133、TO2008/151058、TO2009/057831、W02009/006997、W02009/ 007852 等。
[0062] 在本发明中，按照通常方法在饲养细胞上培养iPS细胞，然后将饲养细胞剥离，回 收iPS细胞，使其悬浮于适当的培养基(例如，含有胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基 (DMEM)等）。接着，设置载置有包含细胞的结构物(优选为生物体组织或脏器的切片）的培养 物盖玻片，在其上接种iPS细胞的悬浮液。通过接种后静置，使悬浮的iPS细胞附着于结构 物，然后，添加适当的培养基(含有5%FBS的DMEM等），按照通常方法进行培养即可。
[0063] 在含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物上培养诱导多能干细胞时的条件只要 能够对诱导多能干细胞的分化进行诱导即可，没有特别限定。作为培养基，可以使用例如， 含有胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM)、或灵长类ES细胞用培养基 (ReproCELL公司）等。虽然可以添加用于对诱导多能干细胞的分化进行诱导的各种生长因 子、细胞因子或分化诱导因子等来进行培养，但在本发明中，通过在含有细胞的结构物上进 行培养，即使不添加上述生长因子、分化诱导因子也能够实现分化诱导。作为用于对诱导多 能干细胞的分化进行诱导的各种生长因子、细胞因子或分化诱导因子的例子，可以列举:激 活素(activin)、bFGF、头蛋白（noggin)、烟酰胺、视黄酸、EGF、糖皮质激素等，没有特别限 定。
[0064] (2)诱导多能干细胞的筛选方法
[0065] 根据本发明，可以通过在含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物上培养诱导多 能干细胞而对诱导多能干细胞进行分化诱导，能够筛选分化诱导效率较高的诱导多能干细 胞。如上所述，现在可以用各种方法制备诱导多能干细胞。期待能将制备的诱导多能干细胞 分化诱导为希望的细胞，并应用于再生医疗等。然而，通常在制备的诱导多能干细胞中混有 向希望的细胞分化诱导效率较高的细胞和向希望的细胞分化诱导效率较低的细胞。希望从 制备的诱导多能干细胞中筛选向希望的细胞分化诱导效率较高的细胞。
[0066] 根据本发明，可以通过在含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物上培养诱导多 能干细胞来对诱导多能干细胞进行分化诱导，能够筛选向希望的细胞分化诱导效率较高的 诱导多能干细胞。将这样筛选得到的分化诱导效率较高的诱导多能干细胞作为储备进行保 管，可以在再生医疗的场所于需要时进行分化诱导而使用。
[0067] 另外，生体组织或脏器的切片等含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物能够提 供用于诱导多能干细胞的筛选的试剂盒。上述试剂盒中，除了含有细胞和/或源自细胞的成 分的结构物以外，还可以包含用于培养诱导多能干细胞的培养基、用于设置含有细胞的结 构物的盖玻片等。
[0068] 通过以下的实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[0069] 实施例
[0070] (1)冷冻切片的制作
[0071]从雄性、6周龄的ICR小鼠摘取正常的肝脏、脑和脊髓。另外，以1:4的比例将lml/kg 的四氯化碳混入橄榄油中得到混合物，通过腹腔内给药该混合物而人为地使ICR小鼠引发 药物性肝炎，在给药四氯化碳后的第1、2、3、5日从ICR小鼠摘取肝炎肝脏。
[0072] 将各脏器包埋于作为00'包埋剂的118 8116-161^(3&1〇1瓜？；[1161：116(31111；[0&1)中并封 固，然后浸渍于液氮中制成冷冻切片制作用块。由这些块制成各自厚度6mi的冷冻切片并载 置于圆形的培养物盖玻片（聚L赖氨酸涂布型、松浪硝子）上。在干燥后用磷酸缓冲液 (Phosphate Buffered Saline:以下简称为PBS、pH7.4)清洗2次，对0CT包埋剂进行冲洗后 用于iPS细胞的培养。
[0073] (2) iPS细胞的培养和分化诱导
[0074] 在按照通常方法培养iPS细胞后，用iPS/ES细胞剥离液(CTK solution，ReproCELL 公司）剥离饲养细胞，用PBS进行清洗，然后回收iPS细胞，使其悬浮于含有5%胎牛血清（以 下简称为FBS，Biological Industries)的Dulbecco改进的Eagle培养基（以下简称为DMEM， SIGMA)。在35mm 口径的盘(无涂层型，松浪硝子）中设置载置有上述冷冻切片的圆形培养物 盖玻片，向其中接种iPS细胞的悬浮液。通过在接种后静置1天，使悬浮的iPS细胞附着于冷 冻切片，然后加入含有5%FBS的DMEM 2ml进行培养。然后每3天更换一次培养基，共培养9 天。
[0075]将在盖玻片上(对照）、正常肝脏切片上、或肝炎肝脏切片上培养的iPS细胞的显微 镜图像(培养第2日和培养第8日）示于图1。可以确认到对照、正常肝脏、肝炎肝脏上接种的 iPS细胞的集落扩展且细胞分散开来。另外，可以确认到细胞形态的变化，在对照中，与培养 第2日相比，第8日扩展的iPS细胞如箭头所示，呈现各种形态，没有确认到统一性。另一方 面，在正常肝脏、肝炎肝脏中，确认到扩展的细胞具有呈现如箭头所示的较大型且多边形的 形态的倾向。
[0076]另外，将在盖玻片上(对照)或正常肝脏切片上培养的iPS细胞的显微镜图像(培养 第3日和第9日）示于图2,将在脑切片上或脊髓切片上培养的iPS细胞的显微镜图像(培养第 3日和第9日）示于图3。
[0077] (3)基因表达的确认
[0078] 为了确认iPS细胞向肝细胞或神经细胞分化的状态，使用半定量的逆转录聚合酶 链反应法(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction法，以下简称为RT-PCR 法）对神经细胞和肝细胞的各种分化标记物的mRNA表达进行了研究。使用TRIzol试剂 (Invitrogen Corp.、〇31'18匕&(1、04、1]54)从在肝脏、脑、脊髓的冷冻切片上进行了培养的1?3 细胞中回收总RNA。在室温下使用100units/ml脱氧核糖核酸酶1(以下简称为DNase I)对得 到的总RNAlyg进行处理，然后添加 lml的25mM EDTA，在65°C下处理5分钟，使DNase I失活。 加入随机六聚体引物(Random Hexamer Primer) (Invitrogen)，使用逆转录酶SUPERSCRIPT 111?代&11^11;1^;[0&1:;[011378七6111(111￥；[1：1'08611)在50°0、50分钟的条件下进行逆转录反应。进 一步在37 °C下用核糖核酸酶H处理20分钟，得到了 cDNA。使用对人的各基因特异性的引物和 PCR MasterMix Kit (Thermo、Rockford、USA)进行 PCR，对各基因的mRNA 表达进行 了研究。将 研究得到的分化标记物、引物及PCR的条件示于表UPCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳， 用溴化乙锭染色，然后使用UV摄影装置FAS-III(东洋纺株式会社、大阪)使其可视化。
[0079] 将对肝细胞的相关基因(AFP、AAT、ALB)的表达进行研究的结果示于图4。
[0080] 在对照组、正常肝脏组、肝炎肝脏组中确认了 AFP的表达，但与对照组相比，可以观 察到肝炎肝脏组中具有表达较强的倾向，且正常肝脏组中的该表达进一步增强。在对照组、 正常肝脏组、肝炎肝脏组中也确认了AAT的表达，可以确认，与对照组相比，正常肝脏组中的 表达较强。另一方面，对于ALB的表达而言，在对照组中没有确认到其表达，相比之下，在正 常肝脏组、肝炎肝脏组中确认了其表达，且确认到正常肝脏组比肝炎肝脏组的表达更强。由 该结果可以确认，通过在正常肝脏、肝炎肝脏的冷冻切片上进行培养，能够诱导iPS细胞向 固有肝细胞的分化。
[0081] 同样地，将对神经细胞的相关基因（如8^11、冊？、0即&86、及6?4?)的表达进行研究 的结果示于图5。
[0082] 表 1

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶 .AFP: ?-胎蛋白 AAT: al-抗胰蛋白酶 ALB:白蛋白 MB:P:髓磷脂碱性蛋白 CNPase:2',；r-环核苷酸3，-磷酸二酯酶 GFAP:神经胶质纤维酸性蛋白 NES:巢蛋白
[0085] (4)蛋白质表达的确认
[0086]用PBS对在各种冷冻切片上培养的iPS细胞进行清洗，然后使用2%多聚甲醛在室 温下对每个冷冻切片进行60分钟的固定。用roS清洗后再使用1 % Triton-X处理15分钟，用 10%正常兔血清或正常山羊血清在室温下进行10分钟的封闭。然后，使兔抗人a-胎蛋白抗 体(Abeam、500倍稀释)或山羊抗人a 1-抗胰蛋白酶抗体(Abeam、300倍稀释)在4 °C下反应过 夜。用PBS清洗，然后使作为二次抗体的FITC-con jugated anti-rabbit IgG或FITC-conjugated anti-goat IgG在室温下反应1小时。用PBS清洗，然后用DAPI对核进行染色，并 用荧光显微镜进行观察（图6和图8)。在图6中，对照组中基本上没有确认到AFP阳性细胞，但 在正常肝脏组、肝炎肝脏组中确认到大量的AFP阳性细胞。在图8中，与AFP的情况相同，与对 照组相比，在正常肝脏组和肝炎肝脏组中确认到大量的AAT阳性细胞。对表达了a-胎蛋白抗 体和al-抗胰蛋白酶抗体的iPS细胞的数量进行测量，并计算出其占有核细胞的比例（图7和 图9)，由此对分化诱导效率进行了研究。如图7所示，确认到与对照组相比，在正常肝脏组和 肝炎肝脏第1日的组中AFP阳性细胞的比例显著增加。另外，如图9所示，确认到与对照组相 比，在正常肝脏组、肝炎肝脏第1、2、5日的组中AAT阳性细胞的比例显著增加。
[0087]另外，使用抗人GFAP抗体或抗CNPase抗体作为一次抗体，用荧光显微镜观察了蛋 白质表达。使用2%多聚甲醛对在各种冷冻切片上培养的iPS细胞固定1小时，用PBS清洗2 次，然后使用由含有〇 ? 1 %BSA的PBS稀释过的1 % TRITON X-100 (ICN Biomedical)处理15分 钟。用PBS清洗2次，然后用10 %山羊正常血清封闭1小时。用PBS清洗2次，然后使用由含有 1 %BSA的PBS稀释过的一次抗体在4°C下反应过夜。作为一次抗体，使用了1^&13；^3111:;[-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody(SIGMA、80倍稀释）或Rabbit anti-CNPase &扣1130(^以1^&111、100倍稀释）。用1^3清洗3次，然后使用由含有1%834的1^3稀释的二次抗 体反应1小时。作为二次抗体，对于GFAP使用了Goat anti-rabbit IgG FITC(Wako、40倍稀 释），对于CNPase使用了Goat anti-rabbit IgG Alexa(Invitergen、100倍稀释）。用PBS清 洗2次，然后用DAPI进行30分钟的染色。用roS清洗2次，用VECTASHIELD封入，并用荧光显微 镜进行观察。
[0088]使用抗人GFAP抗体作为一次抗体用荧光显微镜对蛋白质表达进行观察，将观察结 果示于图10。测量表达了GFAP的iPS细胞的数量，计算出其占有核细胞的比例（图11)，由此 研究了分化诱导效率。
[0089]使用抗CNPase抗体作为一次抗体用荧光显微镜对蛋白质表达进行观察，将观察结 果示于图12和图13。测量表达了 CNPase的iPS细胞的数量，计算出其占有核细胞的比例（图 14)，由此研究了分化诱导效率。
[0090]对于在盖玻片上（对照）、正常肝脏切片上、或肝炎肝脏切片上培养iPS细胞的情 况，将细胞形态和基因（AFP、AAT、ALB)表达的结果示于表2,将蛋白质(AFP、AAT)表达的结果 示于表3。另外，将GFAP和CNPase的基因和蛋白质表达的结果示于表4。
[0095]表 4
[0097]由上述结果可知，利用本发明的方法，能够进行从iPS细胞向肝细胞和神经细胞的 分化诱导。
【主权项】
1. 一种诱导多能干细胞的分化诱导方法，该方法包括:在含有细胞和/或源自细胞的成 分的结构物上培养诱导多能干细胞，其中，结构物中的细胞与经过分化诱导的细胞为相同 的细胞型。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为片状 结构物。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为生 物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。5. -种经过分化诱导的细胞的制造方法，该方法包括:在含有细胞和/或源自细胞的成 分的结构物上培养诱导多能干细胞，其中，结构物中的细胞与经过分化诱导的细胞为相同 的细胞型。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为片状 结构物。7. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为生 物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。8. 根据权利要求5~7中任一项所述的方法，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。9. 一种诱导多能干细胞的筛选方法，该方法包括:通过在含有细胞和/或源自细胞的成 分的结构物上培养诱导多能干细胞来对诱导多能干细胞进行分化诱导，并对分化诱导效率 高的诱导多能干细胞进行筛选，其中，结构物中的细胞与经过分化诱导的细胞为相同的细 胞型。10. 根据权利要求9所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为片状 结构物。11. 根据权利要求9或10所述的方法，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为 生物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。12. 根据权利要求9~11中任一项所述的方法，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。13. -种用于诱导多能干细胞的筛选的试剂盒，其至少包含含有细胞和/或源自细胞的 成分的结构物。14. 根据权利要求13所述的试剂盒，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构物为 片状结构物。15. 根据权利要求13或14所述的试剂盒，其中，含有细胞和/或源自细胞的成分的结构 物为生物体组织、脏器的切片或涂布了源自细胞的成分的培养基材。16. 根据权利要求13~15中任一项所述的试剂盒，其中，细胞源自肝脏、脑或脊髓。
【文档编号】C12M1/26GK105849256SQ201480056130
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年9月5日
【发明人】里村人, 里村一人
【申请人】株式会社钟化, 里村人, 里村一人