一种医药用倍半萜类化合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的倍半萜类化合物及其制备方法，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的倍半萜类化合物，可以从乌药的干燥块根中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能明显提高ox?LDL损伤的人脐静脉内皮细胞的细胞活力，具有抑制ox?LDL诱导的HUVEC损伤的作用，并且效果呈剂量依赖性，可以用来开发成内皮细胞保护的药物。
【专利说明】
一种医药用倍半萜类化合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从乌药的干燥块根中分离得到的一种具有内 皮细胞保护作用的倍半萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 乌药为棒科（Lauraceae)山胡椒属（Lindera)植物乌药（Lindera aggregata (Sims)Kosterm.)的干燥块根。全年均可采挖，除去细根，洗净，趁鲜切片，晒干，或直接晒 干。主产于浙江、安徽、湖南、广东、广西等地。乌药作为中国传统中药具有行气止痛，温肾散 寒的作用。主治胸胁满闷、脘腹胀痛、头痛、寒疝疼痛、痛经及产后腹痛、尿频、遗尿等证。
[0003] 乌药的化学成分种类较多，目前报道的主要成分有挥发油、异喹啉生物碱、倍半萜 及其内酯、黄铜类等成分。乌药的根、叶、果皮及种子中均含有挥发油，其主要成分多为常见 的单萜和倍半萜类化合物。乌药所含的生物碱以异喹啉型生物碱为主。乌药中报道最多的 成分是呋喃倍半萜及其内酯，并且该类成分是乌药的特征性成分，具有较强的专属性，2010 版中国药典中规定以乌药醚内酯作为乌药含量测定的指标性成分。
[0004] 乌药的化学成分复杂，药理作用广，具有抗炎镇痛、抗病毒、抑菌、抗氧化、抗疲劳、 调节消化道、松弛内脏平滑肌、改善中枢神经系统功能、调理妇科病症等药理作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从乌药的干燥块根中分离得到的一种具有内皮细胞保 护作用的倍半萜类化合物，此外本发明的另一个发明目的还在于提供上述倍半萜类化合物 的制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -种医药用倍半萜类化合物，其特征在于，具有下述结构式的化合物(I)，
[0008]
[0009] -种医药用倍半萜类化合物的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将乌药的干燥块 根粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗 脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75% 乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基 硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱 体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。实验证 明，上述化合物（I)采用MTT法检测发现化合物（I)能明显提高ox-LDL损伤的人脐静脉内皮 细胞的细胞活力，说明其具有抑制ox-LDL诱导的HUVEC损伤的作用。进一步采用AnnexinV-FITC、PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡，研究发现各浓度组化合物（I)均能显著减少OX-LDL诱导的HUVEC凋亡，并且效果呈剂量依赖性。说明化合物（I)能通过抑制ox-LDL诱导的 HUVEC凋亡来实现内皮保护作用。
【附图说明】
[0013] 图1为化合物(I)结构式；
[0014]图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0016] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0017] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0018] 制备方法：（a)乌药的干燥块根（IOkg)粉碎，用80%乙醇热回流提取(25LX 3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱和的 正丁醇（3LX 3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（398g)和正丁醇萃取物； (b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（163g); (c) 步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱 体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、12:1 (10个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步 分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积）、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶 0DS-C18分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (43mg)。
[0019] 结构确证:HR-ESIMS显示[Μ+Na]+为m/z 335.1128,结合核磁特征可得分子式为 C15H2Q〇7，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据δΗ(ppm，DMSO-Cl 6，500MHz): H-3 (2 · 14，d)，H-3 (1.97，d)，H-5(1.91，m)，H-6(2.18，m)，H-6(1.99，m)，H-9(2.12，d，J=13.8)，H-9(1.97，d，J =13.8)，!1-13(2.04,8)，!1-14(1.07,8)，!1-15(1.21，8);核磁共振碳谱数据6。(卯 111，0130-(16， 75MHz):104.7(Ca-C)，212.1(C，2-C)，51.1(CH2,3-C)，79.6(C，4-C)，49.3(CH，5-C)，20.1 (CH2,6-C)，161.5(C，7-C)，104.1(C，8-C)，42.4(CH2,9-C)，69.3(C，10-C)，120.1(C，n-C)， 173.1(<：，12-〇,9.7(013，13-〇,26.1(013，14-〇,27.3(013，15-〇 ;碳原子标记参见图1。红 外光谱表明该化合物含有羟基(3453CHT1)和羰基（1757(31^ 1)基团，紫外光谱显示在213nm处 有最大吸收，表明含有α，β_不饱和-γ-内酯。1H匪R谱显示三个甲基信号δΗ1.07(3Η，8)， 1.21(3!1，8)和2.〇4(3!1，8)。 13(：匪1?显示15个碳信号，包括三个甲基碳原子0〇9.7,26.1， 27.3)，三个亚甲基0〇2〇.1，42.4,51.1)，一个次甲基0〇49.3)，以及八个季碳[酮羰基碳0 0212.1)，<1，0-不饱和酯羰基碳0(：173.1)，两个烯烃碳0(：120.1，161.5)和四个含氧季碳0 C69.3,79.6，104.1，104.7)]<X-l(SC104.7)，C-4(SC79.6)，C-8(SC104.lWPC-10(SC69.3) 的化学位移表明它们各连有一个羟基。NOESY谱中，Me-14与Η-3β，Η-6β和Me-13;Me-15与H-9 β; H-5与Η_3α，Η_6α和Η_6β;以及Η_6α和Η_9α的相关性表明H-5为α-取向，Me-15和Me-14为β-取向。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该 化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0020]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0021] -、材料和仪器
[0022]人脐静脉内皮细胞珠(HUVEC)由上海午立生物技术有限公司细胞库提供。化合物 (I)自制，HPLC归一化纯度大于98% jPMI-1640培养基、ΜΤΤ、二甲基亚砜均购于Sigma公司。 胎牛血清购于HyCLone公司。FITC标记羊抗兔IgG、兔抗人第八因子相关抗原购于北京博奥 森生物技术有限公司。MDA含量检测试剂盒购于南京建成生物研究所。AnnexinV-FITC凋亡 检测试剂盒购于Centrebio公司。乙二胺四乙酸(EDTA)购于广州威佳科技有限公司。
[0023] DK-8AD型电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司），ER-120A型电子分析天平 (岛津公司），6219型电子pH计（上海任氏电子有限公司），高速低温离心机（Sigma公司）， L420台式低速自动平衡离心机(湘仪离心机仪器有限公司），SYC-2101水平摇床(其林贝尔 仪器制造有限公司），1000 yL微量加样枪X 1支、20-100yL微量加样枪X 1支、l-20yL微量加 样枪X 1支(法国吉而森公司），C〇2(培养箱Heraeus公司），超净台（苏净集团安泰公司），倒 置相差显微镜(德国莱卡公司），酶标仪(Sigma公司）,FACSCaLibur(流式细胞仪）。
[0024]二、试验方法
[0025] 1、脐静脉内皮细胞的培养
[0026] 培养条件
[0027] 将新购入的HUVEC细胞株接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。置于37°C， 5 % CO2培养箱中，每2天更换1次培养基。
[0028] 1.2细胞传代
[0029] 取一瓶HUVEC在倒置相差显微镜下观察细胞，如长成致密的单层，即可进行传代； 将培养瓶轻轻摇动数次，悬浮起浮在细胞表面的碎片，然后连培养液一起倒出，吸取2~3mL PBS液加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，重复3次;加入ImL 0.25 %胰酶，以能覆盖瓶底为限， 转动培养瓶，使湿润整个细胞层，置37°C孵育箱内消化2~3min，待确认细胞己收缩变圆时 为止;加 ImL培养液于培养瓶中终止消化，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之 从瓶壁脱离形成细胞悬液，注入离心管离心(800r/min，5min)后弃去上清液;加入3mL培养 液于离心管中，用吸管吸取培养液轻轻吹打数次，使细胞悬重，然后按1:3或1:4分配传代培 养;置于孵育箱内37°C、5%C(Vg温箱中培养，24h后换液，通常3-4天可形成单层，此时便可 换维持液供实验用。
[0030] 1.3HUVEC 的计数
[0031]首先取待测的细胞悬液50yL滴入细胞计数板内，按白细胞计数法，于低倍镜下计 数4角的4个大方格内的细胞总数，然后用以下公式计算细胞浓度:4个大方格内的活细胞 数/4X104=细胞数/mL [0032] 2、脐静脉内皮细胞的鉴定
[0033]在6孔培养板内放置无菌盖玻片I cm X I cm，将内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待内 皮细胞长至汇合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗盖玻片，放入100%丙酮中固定15min，用 PBS冲洗3次，每次2min，滴加3 %的H2O2室温孵育8min，PBS冲洗3次，每次2min，滴加兔抗人硼 因子单克隆抗体（1:100)，另一盖玻片上不加一抗作阴性对照4°C过夜。次日，用PBS冲洗3 次，每次2min，滴加 FITC标一记的羊抗兔IgG，37°C孵育60min，用PBS冲洗3次，每次2min，荧 光显微镜下观察并拍照。
[0034] 3、利用MTT比色法测定HUVEC的细胞活性
[0035] 3.1利用MTT比色法观察不同浓化合物（I)对脐静脉内皮细胞活性的影响
[0036] 3.1.1传代培养
[0037] 将HUVEC按2\104/!1^的密度用含10%?83的1^]\〇-1640培养基接种于96孔板，每孔 种植200yL。
[0038] 3.1.2分组加药
[0039] 传代细胞培养24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为 7组:对照组（contro 1)，化合物（I) 5yg/mL组，化合物（I) IOyg/mL组，化合物（I) 20yg/mL组， 化合物（I) 40yg/mL组，化合物（I) 60yg/mL组，化合物（I) 80yg/mL组，每孔6孔。继续培养48小 时后，MTT法检测细胞活性。
[0040] 3.1.3MTT 法检测
[00411 直接向每孔加入20yL己配制好的MTT溶液，37°C孵育4h，吸净上清，然后加入150yL DMSO。待结晶充分溶解后，利用酶标仪在波长490nm处测定OD值。
[0042] 3.2利用MTT比色法观察不同浓度ox-LDL对脐静脉内皮细胞活性的影响
[0043] 3.2.1传代培养:同上。
[0044] 3.2.2分组加药
[0045] 细胞培养24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6组： 对照组（control)，ox_LDL(为自制）10yg/mL组，ox-LDL 20yg/mL组，ox-LDL 40yg/mL组，οχ-LDL 60yg/mL组。ox-LDL 80yg/mL组，每孔6孔。继续培养24小时，MTT法检测细胞活性。
[0046] 3.3利用MTT比色法观察化合物（I)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞损伤的干预作用
[0047] 3.3.1传代培养:同上。
[0048] 3.3.2分组加药
[0049] 细胞培养24h后，用10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为5组:对 照组（contro 1 )，ox-LDL 50yg/mL组，ox-LDL 50yg/mL+化合物（I) 5yg/mL组，ox_LDL50yg/mL +化合物（I)lOyg/mL组，OX-LDL 50yg/mL+化合物（I)20yg/mL每孔6孔。继续培养24小时后， MTT法检测细胞活性。
[0050] 4、利用流式细胞技术观察化合物(I)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞凋亡的干预作
[0051] 4.1用传代培养
[0052] 将HUVEC按2\105/11^的密度用含10%?83的1?^1-1640培养基接种于6孔板，每孔 种植 1500yL。
[0053] 4.2分组加药
[0054]细胞培养24h后，以RPMI-1640无血清培养基血清剥夺24h，使细胞进入静止状态。 用含RPML-1640血清培养基配制药物，将细胞随机分为5组:对照组(control)，ox-LDL 50μ g/mL组，οχ-LDL 50yg/mL+化合物（I) 5yg/mL组，οχ-LDL 50yg/mL+化合物（I) IOyg/mL组，οχ-LDL 50yg/mL+化合物（I) 20yg/mL每孔加 ImL含药培养基。
[0055] 4.3操作步骤
[0056] 加药后12h取材，把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细 胞消化液消化细胞。细胞消化下来后，转移到离心管内，PBS洗三次（1000 g离心10分钟）。加 入200yL结合缓冲液，重悬细胞。加入IOyL Annexinv-FITC、10yL PI染色液轻轻混匀。室温 避光孵育15分钟，30分钟内上机检测细胞凋亡。
[0057] 5、统计学分析
[0058]采用SPSS13.0统计一软件进行分析，结果表示为：均数士标准差（^±S)。方差齐 时，两组比较采用LSD，如多组与对照组比较使用Dunnett检验，当方差不齐时，采用WeLch稳 健估计，再采用T3方法两两比较。P〈0.05表示有统计学意义。
[0059]三、结果及结论
[0060] 1、不同浓度化合物⑴对HUVEC细胞活力的影响
[0061] 化合物（I)药物在一定的浓度范围才能发挥其药理作用，而且不同的细胞体系对 药物的敏感性也会有所不同。为此，首先用MTT法确定实验用的药物浓度范围。结果如表1 (VS对照组 #P〈0.01)显示，不同浓度的化合物（I)对内皮细胞的作用效应不同，低剂量的药 物浓度(5~20yg/mL)细胞活性与对照组比较，没有统计学差异。40yg/mL作用48小时后细胞 活力下降了约50%，80yg/mL作用48小时后细胞活力下降了70%，与对照组比较有统计学差 异(P〈0.01)，产生了一定的毒副作用。因此本实验所用的化合物（I)浓度为5、10、20yg/mL， 以排除药物自身对细胞的毒性作用。
[0062] 2、不同浓度ox-LDL对脐静脉内皮细胞活力的影响
[0063] 由于氧化低密度脂蛋白氧化程度的差异，氧化低密度脂蛋白的细胞毒性范围会有 所不同。因此我们先采用MTT确定ox-LDL细胞毒的范围。结果如表2(VS对照组乍〈0.05 #P〈 0.01)所示，不同浓度ox-LDL对HUVEC细胞活性影响不同。与对照组相比，10yg/mL组有促进 HUVEC细胞活性增加的趋势，但与对照组比较没有统计学差异(PX). 05); 20~100yg/mL各组 内皮细胞活性随浓度增加而减少，与对照组比较有统计学差异(P〈〇. 05或P〈0.01)。
[0064] 3、化合物(I)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞损伤的干预作用
[0065] 结果如表3(VS.ox-LDL group#P〈0·01)所示，ox_LDL(50yg/mL)组的细胞活性下 降，与对照组比较有统计学差异(P〈〇.〇l)，说明ox-LDL组细胞活性显著降低， 〇x-LDL(50yg/ mL)对正常HUVEC具有损伤作用。化合物⑴不同剂量组的细胞活性均高于ox-LDL组，与ox- LDL组比较差异有统计学意义(P〈0.01)，说明此三个剂量组的细胞活性显著高于ox-LDL组， 提示化合物（I)可抑制ox-LDL诱导的HUVEC损伤。化合物（I) lOyg/mL和化合物（I) 20yg/mL组 的细胞活性高于化合物（I )5yg/mL组，与化合物（I )5yg/mL比较有统计学差异(P = 0.0 1或卩〈 〇. Ol)。化合物（I) 20?/!^细胞活性较化合物（I) lOyg/mL组有升高趋势，但没有统计学差异 (P = O. 185)。提示化合物(I)的内皮保护作用在一定范围内具有量效关系。
[0066] 4、化合物(I)对ox-LDL诱导损伤的脐静脉内皮细胞凋亡的影响
[0067] 各组流式细胞结果显示：各组细胞的凋亡率差异有统计学意义(P〈0.01 )，ox-LDL 组的增殖指数明显升高，与对照组比较有统计学差异(P〈〇.〇l)说明〇X-LDL(50yg/mL)对正 常HUVEC具有损伤作用。化合物（I)不同剂量组的凋亡率均低于ox-LDL组，与ox-LDL组比较 差异有统计学意义(P〈〇.01)，说明此三个剂量组的凋亡率显著低于ox-LDL组，提示化合物 (I)可抑制ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。化合物（I)不同剂量组的凋亡率随着剂量升高逐渐降 低，各组之间差异有统计学意义(P〈〇. 01)。结果见表4(VS ox-LDL group#P〈0.01)。提示化 合物(I)的内皮保护效应在一定范围内具有量效关系。
[0068]结论，本研究采用MTT法检测发现化合物（I)能明显提高ox-LDL损伤的人脐静脉内 皮细胞的细胞活力，说明其具有抑制〇 X - L D L诱导的H U V E C损伤的作用。进一步采用 AnnexinV-FITC、PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡，研究发现各浓度组化合物（I)均能显 著减少ox-LDL诱导的HUVEC凋亡，并且效果呈剂量依赖性。提示化合物（I)能通过抑制OX-LDL诱导的HUVEC凋亡来实现内皮保护作用。
[0069]表1不同浓度化合物⑴对HUVEC细胞活力的影响(i±s，n = 6)
[0086] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0087] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种医药用倍半萜类化合物，其特征在于，具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述医药用倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包含以下操作步 骤：（a)将乌药的干燥块根粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味， 依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱 体积，再用75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸 膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、 12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步 分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤 (d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等 度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述医药用倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，用 80 %乙醇热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述医药用倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂 为AB-8型大孔吸附树脂。
【文档编号】A61P7/00GK105859671SQ201610240878
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月17日
【发明人】王赛波
【申请人】温州统益生物医药科技有限公司