次血红素分子与肽偶联的方法、环化次血红素肽及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种次血红素分子与肽链偶联的方法；以及环化的次血红素肽及其制备方法和用途。次血红素分子与肽链的偶联方法包括：1)使次血红素的两个羧基脱水形成酸酐，2)使所述酸酐与肽链的游离氨基形成酰胺键。制备环化的次血红素肽的方法包括：1)在固相载体上，按照Fmoc固相合成法得到经保护的NH2-β-Ala-His(Trt)-X-Lys(Mtt)-固相载体，2)偶联次血红素，3)选择性地切割Mtt侧链保护基，暴露出游离氨基，使所述游离氨基与次血红素的羧基缩合成环，得到c(Dh-β-Ala-His(Trt)-X-Lys)-固相载体，4)脱除其他氨基酸的保护基团，并将所得的c(Dh-β-Ala-His(Trt)-X-Lys)从固相载体上切割下来。
【专利说明】
次血红素分子与肽偶联的方法、环化次血红素肽及其制备 方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种次血红素分子与肽链偶联的 方法；以及环化的次血红素肽及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 次血红素 6 肽（Deuterohaemin- β -Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys, Dh- β -AHTVEK，Dh ΗΡ-6)作为一种铁卟啉的肽类衍生物，是抗坏血酸过氧化物酶的模拟酶，体内/体外试验结 果表明其具有良好的抗氧化活性，在预防和/或治疗糖尿病、白内障、心脑血管疾病、衰老、 炎症方面均显示较好的功效。
[0003] 然而，次血红素6肽作为一种多肽，由于分子量大、不易透过细胞膜、易受生物体 内酶的降解，因此常规的给药途径是注射。然而，从患者使用的方便、安全及顺应性角度考 虑，尤其是例如糖尿病这类需要长期用药的情况，这样的给药方式并不理想。相较于注射给 药，口服给药是各种给药方式中较为理想的方式之一。虽然目前通过多肽链修饰技术（参 见CN103450341 A)显著提高了多肽的稳定性，从而可提高多肽的生物利用度，为口服给药 奠定了基础，但是这些修饰却不能显著改善次血红素6肽的肠道细胞透过性，因此，仍然不 适于口服。
[0004] 而且，当前次血红素分子与肽链偶联的方法主要是采用高效缩合剂，如磷、脲正离 子HATU、PyBop等，将次血红素的羧基转变成活泼酯，肽链游离氨基（亲核试剂）进攻酯键 形成酰胺键，虽然HATU、PyBop的活化性能很高，但最终目标次血红素肽的产率却并不高， 原因在于他们对Dh的两个羧基没有选择性，导致两个羧基均被活化，副反应产物竞争目的 产物生成，如次血红素与肽链双偶联产物和次血红素肽二甲胺化杂质，使粗肽产品纯度小 于40 %，增加了后续纯化难度，最终收率仅10 %。
[0005] PyBop/HOBt缩合反应的机理如下：
[0006]
[0007] 传统方法采用低取代树脂降低肽链密度、减少反应时间、更换低活性的活化剂和 反应试剂抑制副反应进行，但这些条件优化的改进效果非常有限。
[0008] 为了解决上述问题，需要对次血红素6肽进一步改造，以使其适于口服，还需要一 种能够高效偶联次血红素与肽链的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的在于提供一种次血红素分子与肽链的偶联方法，所述方法包括 以下步骤：
[0010] 1)使次血红素的两个羧基脱水形成酸酐，
[0011] 优选地，以DIC或乙酸酐为活化剂，使次血红素的两个羧基脱水形成酸酐，
[0012] 2)使所述酸酐与肽链的游离氨基形成酰胺键，
[0013] 所述肽链可以是游离的肽链或在固相载体上偶联的肽链，例如，在固相合成过程 中形成的偶联在树脂上的肽链。
[0014] 优选地，所述方法可包括以下步骤：
[0015] 1)用DMF溶解次血红素，然后加入DCM和DIC，在室温下搅拌50-70min ; _6] 2)减压挥干，得到剩余物；
[0017] 3)将剩余物用DMF溶解，加入所述肽链，在25-30摄氏度下，以120-140rpm振摇 50_70min，然后抽干。
[0018] 优选地，在步骤1中，DIC与肽链的摩尔比为1:1。
[0019] 所述肽链的长度可以为1-50个氨基酸、1-25个氨基酸、20个氨基酸、1-15个氨基 酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸。
[0020] 所述肽链可以是固相合成反应中得到的与树脂偶联的肽，例如本发明实施例中得 到的与Rink-amide树脂偶联的肽。
[0021] 举例来说，当使用DIC为活化剂时，次血红素的缩合反应的机理如下：
[0022]
[0023] 其中R代表肽链。
[0024] 本发明的方法与传统的偶联方法（例如通过PyBop/HOBt缩合反应进行的偶联） 相比，避免了副反应大量发生，将粗肽的纯度提高至80%以上，极大地增加了产率，降低了 生产成本。
[0025] 本发明的另一目的是提供一种制备环化的次血红素肽的方法，所述方法包括：
[0026] 1)在固相载体上，按照Fmoc固相合成法从C端（羧基端）至N端（氨基端）顺序 地偶联经保护的 Fmoc-Lys (Mtt) -OH、Fmoc-X-〇H、Fmoc-His-OH、Fmoc- β -Ala-OH，得到经保 护的 NH2- β -Ala-His (Trt) -X-Lys (Mtt)-固相载体，
[0027] 其中X代表具有扭转酰胺键的任一氨基酸，
[0028] 其中，所述固相载体为Fmoc固相合成法中常用的载体。优选地，所述固相载体为 Rink amide MBHA 树脂。
[0029] 2)偶联次血红素，其中优选用上述本发明的偶联方法将次血红素与步骤1)中的 NH2- β -Ala-His (Trt) -X-Lys (Mtt)-固相载体进行偶联。
[0030] 3)选择性地切割Mtt侧链保护基，暴露出游离氨基，然后在缩合剂的作用下，使所 述游离氨基与次血红素的羧基缩合成环，得到c (Dh- β -Ala-His (Trt) -X-Lys)-固相载体，
[0031] 其中所述缩合剂可为 PyBop/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt，
[0032] 其中，用I %的TFA选择性切割Mtt侧链保护基。
[0033] 优选地，在步骤3中，将偶联次血红素后得到的肽树脂抽干，加入1%的TFA-DCM， 在26-28°C下以120-140rpm振摇50-70min，来选择性切割Mtt保护基。
[0034] 优选地，在步骤3中，将选择性切割Mtt保护基的树脂肽抽干，加入PyBop/HOBt、 DIEA，26-28°C，反应10_12h，来进行缩合成环反应。
[0035] 其中所述PyBop/HOBt和DIEA与所述肽树脂的摩尔比为6:1~6. 3:1和12:1~ 12. 6:1〇
[0036] 4)脱除其他氨基酸的保护基团，并将所得的c (Dh- β -Ala-His (Trt) -X-Lys)从固 相载体上切割下来，得到含有环化的次血红素肽c (Dh-β -ΑΗΧΚ)的溶液。
[0037] 优选地，所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -ΑΗΡΚ)，其中P为脯氨酸。
[0038] 优选地，所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -AHGK)，其中G为甘氨酸。
[0039] 优选地，所述环化的次血红素的结构为c(Dh-i3 -AH-(d)E-K)，其中（d)E为D-谷氨 酸。
[0040] 优选地，所述环化的次血红素的结构为c(Dh-0 -AH-(Me)E-K)，其中（Me)E为N-甲 基谷氨酸。
[0041 ] 优选地，对4)中得到的溶液进行纯化，纯化方法例如洗涤、重结晶及色谱法（例如 HPLC)等。
[0042] 本领域已知肽链环化的成败在于成环两位点具有空间上的可接近性，包括合适的 距离及恰当的角度，距离太远或角度相背均难以使两位点偶联。本发明人意外地发现，在赖 氨酸前一位点引入扭转肽键顺式构象的氨基酸，如D型氨基酸、N-甲基氨基酸等，以促进赖 氨酸与次血红素空间相近，这种序列具有距离短、角度匹配的特点，因而能够使环化效率达 到30%。并且发明人还采用了树脂上成环策略，以特殊侧链保护的Fmoc-Lys (Mtt)-OH为 构件合成环肽前体，1 % TFA选择性切割Mtt侧链保护基，暴露出游离氨基，在高效缩合剂 PyBop/HOBt作用下，使其与Dh的羧基缩合成环。
[0043] 本发明的另一个目的是提供环化的次血红素肽，其结构如下：c (Dh- β -AHXK)，Dh 代表次血红素 ，β -A代表丙氨酸，H代表组氨酸，X代表具有扭转酰胺键的任一氨基酸，K代 表赖氨酸，c表示环化，环化发生在Dh的羧基与K侧链ε -氨基。
[0044] 其中所述具有扭转酰胺键的任一氨基酸，是指引入扭转肽键顺式构象的氨基酸， 如D型氨基酸、N-甲基氨基酸等以促进赖氨酸与次血红素空间接近。
[0045] 优选地，所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -ΑΗΡΚ)，其中P为脯氨酸。
[0046] 优选地，所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -AHGK)，其中G为甘氨酸。
[0047] 优选地，所述环化的次血红素的结构为c(Dh_i3 -AH-(d)E-K)，其中（d)E为D-谷氨 酸。
[0048] 优选地，所述环化的次血红素的结构为c(Dh-0 -AH-(Me)E-K)，其中（Me)E为N-甲 基谷氨酸。
[0049] 本发明的环化的次血红素肽具有高的过氧化物酶活性，高的肠道细胞透过性，并 具有高的抗酶解性。因此可以以口服的方式作为过氧化物酶用于疾病的治疗和/或预防。
[0050] 本发明提供了环化的次血红素肽在制备用于预防和/或治疗疾病的药剂中的用 途，所述疾病可以使用抗坏血酸过氧化物酶或者具有抗坏血酸过氧化物酶活性的化合物治 疗，具体而言，所述疾病可以选自糖尿病、白内障、心脑血管疾病、衰老、炎症，所述药剂特别 适于口服给药。
[0051] 本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的环化的次血红素肽和可药用载 体。
【附图说明】
[0052] 图1为Dh- β -AHTVEK的高效液相色谱图，其中DIC为活化剂。
[0053] 图2为Dh- β -AHTVEK的高效液相色谱图，其中乙酸酐为活化剂。
[0054] 图3为Dh- β -AHTVEK的高效液相色谱图，其中PyBop为活化剂。
[0055] 图4为Dh- β -AHTVEK的高效液相色谱图，其中HATU为活化剂。
[0056] 在图卜图 4 中，a 为 Dh-β-AHTVEK、b 为 Dh(C2H6N)-P-AHTVEK、c 为 Dh (-β -AHTVEK)2〇
[0057] 图5 :图5A为次血红素肽在血清中的稳定性；图5B为次血红素肽在小肠匀浆中的 稳定性。
【具体实施方式】
[0058] 在本文中公开了一系列多肽的氨基酸序列，本领域技术人员能够理解的是，在以 三字母的氨基酸残基或单个字母表示某一序列时，该序列从左至右表示的是该多肽从N端 (氨基端）至C端（羧基端）的序列。例如当使用"Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys"表示某 一多肽的序列时，意为该多肽的序列为"N端-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys-C端"，而当使用 "AHTVEK"表示某一多肽的序列时，意为该多肽的序列为"N端-AHTVEK-C端"。
[0059] 当没有具体标明氨基酸的构型时，其是指α -氨基酸。
[0060] 对本发明中所用英文及缩写及其含义说明如下：
[0063] "可药用的载体"是指在生物学上或其他方面不会具有不良作用的物质，即可以将 所述物质与本发明的环化的次血红素肽一同给予受试者，同时不会引起任何不良的生物学 影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。显然应当选择可使 活性成分的任何降解降到最低并且使受试者体内的任何不良副作用减到最小的载体，这 是本领域技术人员所熟知的。
[0064] 合适的载体包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、 悬液剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲剂、载体、冲淡剂、赋形剂和/或药用佐剂。
[0065] 本发明的药物组合物用于口服给药时可采用片剂、延迟型片剂、舌下片剂、胶囊 剂、吸入型气溶胶、吸入型溶液剂、干粉吸入剂或液体制剂（例如混合物、溶液剂、酏剂、糖 浆剂或悬液剂）的形式，所有剂型均含有本发明的环化的次血红素肽；所述制剂可通过本 领域公知的方法来制备。
[0066] 如果组合物为片剂的形式，可使用通常用于制备固体制剂的任意药物载体。所述 载体的实例包括硬脂酸镁、滑石、凝胶、阿拉伯胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。
[0067] 片剂可任选与一种或多种辅助成分一起压制或模制来制备。压制片剂可通过在适 合的机器中压制任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合的 呈自由流动形式（例如粉末或颗粒）的活性成分来制备。
[0068] 模制片剂可通过在适合的机器中将由惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混 合物模制来制备。所述片剂可任选包覆包衣或经刻痕且可进行调配以提供缓慢或控制地释 放其中的活性成分。
[0069] 对于片剂剂型，视剂量而定，药物可组成剂型的1重量％至80重量％，更通常组成 剂型的5重量％至60重量％。除药物外，片剂通常含有崩解剂。崩解剂的实例包括羟基乙 酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、聚乙烯吡咯 烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶凝化淀粉以及海 藻酸钠。崩解剂通常会构成剂型的1重量％至25重量％、优选5重量％至20重量％。
[0070] 粘合剂通常用来赋予片剂制剂以黏着性质。适合的粘合剂包括微晶纤维素、凝胶、 糖类、聚乙二醇、天然和合成的胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶凝化淀粉、羟丙基纤维素以及羟丙 基甲基纤维素。片剂还可含有稀释剂，例如乳糖（一水合物、喷雾干燥的一水合物、无水物 等）、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉以及二水合磷酸氢钙。 片剂还可任选包含表面活性剂，例如月桂基硫酸钠以及聚山梨醇酯80,以及助流剂，例如二 氧化硅和滑石。如果存在，表面活性剂的量通常为片剂的〇. 2重量％至5重量％，且助流剂 的量通常为片剂的〇. 2重量％至1重量％。
[0071] 片剂通常还包含润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰富马酸钠，以 及硬脂酸镁与月桂基硫酸钠的混合物。润滑剂通常以片剂的〇. 25重量％至10重量％，优 选〇. 5重量％至3重量％的量存在。其他常规成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂 以及掩味剂。
[0072] 示例性的片剂含有最高达约80重量％的药物、约10重量％至约90重量％的粘合 剂、约0重量％至约85重量％的稀释剂、约2重量％至约10重量％的崩解剂，以及约0. 25 重量％至约10重量％的润滑剂。片剂混合物可通过直接压缩或通过乳辊来压缩形成片剂。 或者，片剂混合物或混合物的部分可在制片前湿法制粒、干法制粒或熔融法制粒、熔融凝结 或挤压。最终制剂可包含一层或多层且可被包衣或不包衣；或囊封。
[0073] 如果组合物为胶囊的形式，任何常规的囊封均适合，例如在硬凝胶胶囊中使用上 述载体。如果组合物呈软凝胶胶囊形式，可考虑任何通常用于制备分散剂或悬液剂的药物 载体（例如水性胶、纤维素、硅酸盐或油类）并将其纳入软凝胶胶囊中。
[0074] 用于口服给药的固体制剂可配制为即释和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟 释放、持续释放、脉动释放、控制释放、靶向释放以及程序释放。
[0075] 液体制剂包括悬液剂、溶液剂、糖浆剂及酏剂。所述制剂可用作软胶囊或硬胶囊中 的填充剂且通常包括载体（例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或适合的油），以 及一种或多种乳化剂和/或悬液剂。溶液剂可以为活性化合物的水溶性盐或其他衍生物结 合，例如，蔗糖以形成糖浆。液体制剂还可以通过复原例如小药袋里的固体来制备。
[0076] 实施例
[0077] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例是为了使本领域普通技术 人员能够更好地理解本发明，这仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努 力确保有关数字（如数量、温度等）的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非 另有说明，份数为重量份数，温度以°(：为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。
[0078] 主要试剂、仪器：
[0079] Rink amide MBHA resin、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-d-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-N-Me-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-His (Trt)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Lys (Boc) -〇H、Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Val-OH、 DIC、HOBt、PyBop、HATU、HOAt、DIEA、NMM、DMF、DCM、哌啶、三氟乙酸、乙酸酐、苯甲醚、苯酚： 上海吉尔生化公司
[0080] 甲醇、乙醚：北京化工厂
[0081] 色谱纯乙腈：美国Baker公司
[0082] EDTA-Na2、抗坏血酸、H2O2为国产分析纯产品。
[0083] DMEM 培养基、胎牛血清、HBBS、D-HBBS :德国 GIBCO Invitrogen 公司
[0084] R215旋转蒸发仪：瑞士 BUCHI公司
[0085] Alphal-4冻干机：德国CHRIST公司
[0086] 高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司
[0087] iMark酶标仪：日本BioRAD公司
[0088] CKX41倒置显微镜：日本OLYMPUS公司
[0089] 110X50水浴振荡箱：上海智城公司
[0090] pH仪、AG285分析天平：瑞典METTLER公司
[0091] 高效液相色谱仪：美国Agilent公司
[0092] MALDI-T0F-T0F 58〇0 质谱仪：美国 AB Sciex 公司
[0093] NanoDrop 2000紫外分光光度仪、CO2培养箱：美国Thermo公司
[0094] SW-CJ-2F净化工作台：苏州安泰公司
[0095] YMC ODS-A色谱柱：日本YMC公司
[0096] Eclipse XDB C18 色谱柱：美国 Agilent 公司
[0097] 内插式24孔细胞培养板、Millicel-ERS2电阻仪：美国Millipore公司
[0098] 实施例1以DIC为活化剂制备Dh- β -AHTVEK
[0099] 溶胀：取Rink amide MBHA树脂0.1 mmol (取代度0. 33mmol/g)，置于肽合成反应 器中，加4ml DMF进行溶胀，在27°C下以130rpm振摇30min进行溶胀，用DMF洗涤树脂，每 次洗涤3分钟，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干。
[0100] 脱？111〇(3保护：向肽合成反应器中加入4111120%哌啶-01^，在27°(：下以130印111振 摇20min，DMF洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干。
[0101] 偶联：取 Fmoc-Lys (Boc)-OH (0· 3mmol)，PyBop (0· 3mmol), HOBt (0. 3mmol)，喊试 剂NMM(0. 6mmol)，溶于4ml DMF，然后将上述混合物加入至肽合成反应器中，在27°C下 以130rpm振摇lh。用DMF洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干，得到 Fmoc-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0102] 重复上述脱保护及偶联步骤，依次将Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc- β -Ala-OH 连接到序列上，最后脱除 Fmoc 保 护基，得到 NH2-0-Ala-His(Trt)-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0103] 取次血红素（0. 3mmol)用 0. 5ml DMF 溶解，然后加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在 室温下搅拌lh，在40°C下减压挥干DCM，所得的剩余物用5mlDMF溶解，并将所得的溶液加入 至肽合成反应器中，在27°C下以130rpm振摇lh。然后抽干反应物，得到Dh-β -Ala-His(T rt)-Thr (tBu)-Val-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0104] 树脂肽用DMF及甲醇洗涤，每次分别洗涤3min，共洗涤6次，真空干燥12小时。
[0105] 每次脱保护及偶联反应后，取少量树脂粒，加 Kaiser ninhydrin试剂（A，6%讳三 酮的乙醇溶液；B，80%苯酚的乙醇溶液；C，0.0 OlM KCN的吡啶溶液）2滴，120°C反应5min， 若树脂为蓝色（伯胺）表明氨基暴露。
[0106] 切割：向所得的树脂肽中加入4ml切割液（TFA:苯甲醚：苯酚：水 (92. 5:2. 5:2. 5:2. 5))，在 27°C下以 130rpm 振摇 lh，过滤除去树脂。
[0107] 沉淀：将含有粗肽的切割液滴入50ml冷乙醚中，先在-20°C下放置lh，然后在4°C 下以8000rpm离心10min，用20ml乙醚洗沉淀2次，离心，收集粗肽沉淀，真空干燥12h，得 到粗肽。
[0108] 纯化：将上述粗肽溶于水，使用半制备HPLC以下文所述的色谱条件进行纯化。分 部收集目标色谱峰，合并纯度大于95 %的组份。收集液在37°C，50毫巴减压下旋转蒸发 以除去乙腈，将剩余的肽溶液冷冻干燥24h。色谱条件：色谱柱YMC 0DS-A(250X20mm， ΙΟμπι)，流动相A为水，B为乙腈（均含0. 1% TFA)，梯度洗脱，60min内B相的比例由10% 增至70%，流速20ml/min，紫外检测386nm。获得了纯品肽。
[0109] 结构鉴定：纯品以RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS进行鉴定。色谱条件：色谱柱 Eclipse XDB (：18(4.6\15〇111111，54111)，流动相厶为10%乙腈-水，8为90%乙腈-水（均 含0. 1% TFA)，梯度洗脱，在5min内B相的比例由10%增至20%，再经IOmin增至50%， 最后5min增至70%，流速1.0 ml/min，紫外检测386nm，柱温25°C。质谱条件：0. 5 μ 1所得 的纯品肽（将冷冻干燥后的肽用纯化水溶解得到，浓度为0. lmg/ml)与0. 5 μ 1基质（50mM R-氰基-4-羟基肉桂酸溶于乙腈）混匀，点样于不锈钢测试板上，室温干燥。反射模式，阳 呙子扫描。
[0110] 结构鉴定结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为97.0%。
[0111] 实施例2以乙酸酐为活化剂制备Dh-β-AHTVEK
[0112] 采用与实施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-V al-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0113] 取次血红素（0. 3mmol)，乙酸酐（0. 3mmol)，用5ml DMF溶解，置于50mL三颈瓶中， 在130°C下搅拌Ih (侧口干燥管中以氢氧化钠收集蒸馏出来的水和乙酸）。将反应产物冷 至室温，加入至肽合成反应器中，在27°C下以130rpm振摇lh。然后抽干反应物，得到Dh-β -Ala-His (Trt) -Thr (tBu) -Val-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Rinkamide MBHA 树脂。
[0114] 树脂肽用DMF及甲醇洗涤，每次分别洗涤3min，共洗涤6次，真空干燥12小时。
[0115] 然后，采用与实施例1中相同的方法进行切割、沉淀、纯化和结构鉴定。结构鉴定 结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为98. 0%。
[0116] 结果如图1和2所示，以DIC或乙酸酐活化次血红素，与肽链偶联效率非常高，显 著降低相关副产物的生成，其中主成分DhHP-6均大于80%，二甲胺杂质小于10%，以上按 色谱峰面积归一化计算纯度值，未检出肽链双偶联产物。说明本发明的酸酐法使得Dh与肽 链偶联的选择性增强，显著提高目标产物的含量，产品最终收率为约40 %，为进一步环化次 血红素肽链奠定基础。
[0117] 实施例3以PyBop为活化剂制备Dh-β-AHTVEK
[0118] 采用与实施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-V al-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0119] 取次血红素（0· 3mmol)，PyBop (0· 3mmol), HOBt (0. 3mmol)，喊试剂 ΝΜΜ(0· 6mmol)， 溶于4ml DMF，加入肽合成反应器中，在27°C以130rpm振摇lh。抽干，得到Dh-P-Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-Val-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0120] 然后，采用与实施例1中相同的方法进行切割、沉淀、纯化和结构鉴定。结构鉴定 结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为97. 5%。
[0121] 实施例4以HATU为活化剂制备Dh-β-AHTVEK
[0122] 采用与实施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-V al-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0123] 取次血红素（0· 3mmol)，HATU (0· 3mmol)，HOAt (0· 3mmol)，碱试剂 NMM (0· 6mmol)， 溶于4ml DMF，然后加入肽合成反应器中，在27°C以130rpm振摇lh。抽干，得到Dh-P-Ala -His (Trt)-Thr (tBu)-Val-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 树脂。树脂肽用 DMF 及 甲醇洗涤，每次分别洗涤3min，共洗涤6次，真空干燥12小时。
[0124] 然后，采用与实施例1中相同的方法进行切割、沉淀、纯化和结构鉴定。结构鉴定 结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为97. 8%。
[0125] 结果如图3和4所示，以高活性缩合剂PyBop或HATU活化Dh，与肽链偶联后副产 物较多，其中主成分DhHP-6均小于40 %，二甲胺杂质及肽链双偶联产物占50 %，以上按色 谱峰面积归一化计算纯度值。将图1-4的结果进行比较，可以看出本发明具有巨大的优势。
[0126] 实施例 5 c (Dh- β -AHPK)的制备
[0127] 采用与实施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β-Ala-His (Trt)-Pro-Lys (Mt t)-Rink amide MBHA 树脂。
[0128] 取次血红素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在室温 下搅拌lh，在40°C下减压挥干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并将所得的溶液加入至 肽合成反应器中，在27°C下以130rpm振摇lh。抽干后得到Dh-β -Ala-His(Trt)-Pro-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 树脂。
[0129] 用DMF及DCM分别洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，抽干。向肽合成反应器 加入I % TFA-DCM，在27°C下反应30min，用DMF洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤 完毕后抽干。加入？78(^/!1(?丨(0.6臟〇1)，0此4(1.2臟〇1)，在27°(：下反应1211。得到(3(011 -P-Ala-His(Trt)-Pro-Lys)-Rink amide MBHA 树脂。
[0130] 所得的树脂肽用DMF及甲醇分别洗涤，每次洗涤3min，共洗涤6次，真空干燥12h。
[0131] 然后，采用与实施例1中相同的方法进行切割、沉淀、纯化和结构鉴定。结构鉴定 结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为97. 4%。环化效率为28. 8%。
[0132] 实施例 6 c (Dh- β -AHGK)的制备
[0133] 采用与实施例1中相同的固相合成方法，得到
[0134] NH2-β-Ala-His (Trt)-Gly-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 树脂。
[0135] 取次血红素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在室温 下搅拌lh，在40°C下减压挥干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并将所得的溶液加入至 肽合成反应器中，在27°C下以130rpm振摇lh。抽干后得到Dh-β -Ala-His(Trt)-Gly-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 树脂。
[0136] 以DMF及DCM分别洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干。向肽 合成反应器中加入1% TFA-DCM，在27°C下反应30min，用DMF洗涤树脂，每次洗涤3min，共 洗涤6次，洗涤完毕后抽干。向肽合成反应器加入PyBop/HOBt (0. 6mmol)，DIEA(1. 2mmol)， 在 27°C 下反应 12h。得到C(Dh-P-Ala-His(Trt)-Gly-Lys)-Rink amide MBHA 树脂。
[0137] 所得的树脂肽用DMF及甲醇分别洗涤，每次洗涤3min，共洗涤6次，真空干燥12h。
[0138] 然后，采用与实施例1中相同的方法进行切割、沉淀、纯化和结构鉴定。结构鉴定 结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为97. 7%。环化效率为29. 3%。
[0139] 实施例 7 c (Dh- β -AH- (d) E-K)的制备
[0140] 采用与实施例1中相同的固相合成方法，得到
[0141] NH2-β-Ala-His (Trt)-d_Glu (OtBu)-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 树脂。
[0142] 取次血红素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在室温 下搅拌lh，在40°C下减压挥干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并将所得的溶液加入至 肽合成反应器中，在27°C下以130rpm振摇lh。抽干后得到Dh-P-Ala-His(Trt)-d-Glu(0 tBu)-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 树脂。
[0143] 以DMF及DCM分别洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干。向肽合 成反应器加入1 % TFA-DCM，在27°C下反应30min，用DMF洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤 6次，洗涤完毕后抽干。向抽干后所得的树脂加入PyBop/HOBt (0. 6mmol)，DIEA (I. 2mmol)， 在 27°C下反应 12h。得到 c (Dh_ P-Ala-His(Trt)-d_Glu (OtBu)-Lys)-Rink amide MBHA 树 脂。
[0144] 所得的树脂肽用DMF及甲醇分别洗涤，每次洗涤3min，共洗涤6次，真空干燥12h。
[0145] 然后，采用与实施例1中相同的方法进行切割、沉淀、纯化和结构鉴定。结构鉴定 结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为97. 1 %。环化效率为27. 5%。
[0146] 实施例 8 c (Dh- β -AH- (Me) E-K)的制备
[0147] 采用与实施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-N-Me-Glu (0 tBu)-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 树脂。
[0148] 取次血红素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 2ml DCM，DIC(0. 3mmol)，在室温 下搅拌lh，在40°C下减压挥干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并将所得的溶液加入至 肽合成反应器中，在27 °C下以130rpm振摇lh。抽干后得到Dh-P-Ala-His(Trt)-N-Me-G Iu(OtBu)-Lys(Mtt)-Rink amide MBHA 树脂。
[0149] 以DMF及DCM分别洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干。向肽合 成反应器加入1 % TFA-DCM，在27°C下反应30min，用DMF洗涤树脂，每次洗涤3min，共洗涤 6次，洗涤完毕后抽干。然后向反应器加入PyBop/H0Bt(0. 6mmol)，DIEA(1. 2mmol)，在27°C 下反应 12h。得到 c (Dh_ β -Ala-His (Trt) -N-Me-Glu (OtBu) -Lys) -Rink amide MBHA 树脂。
[0150] 所得的树脂肽用DMF及甲醇分别洗涤，每次洗涤3min，共洗涤6次，真空干燥12h。
[0151] 然后，采用与实施例1中相同的方法进行切割、沉淀、纯化和结构鉴定。结构鉴定 结果表明所得的纯品肽序列与理论一致，纯度为98. 2%。环化效率为28. 2%。
[0152] 实施例9过氧化物酶活性
[0153] 将实施例1-8中所得到的纯肽用水配置成浓度为200 μ M/L的肽溶液，然后按照如 下方法分别测量所得的纯肽的过氧化物酶活性：
[0154] 取 2. 5ml 50mM 磷酸盐（ρΗ7· 4)、0· ImM EDTA-Na2缓冲液，20 μ 1 抗坏血酸（0· 5mM)， 10 μ IH2O2 (0. 3mM)，20 μ 1肽溶液（2 μ Μ)，加入Icm石英比色皿，终体积3ml。其中不加抗坏 血酸和H2O2为空白对照，室温25°C监测290nm吸光度在60s( sp〇t/5s)的降低。活性单位定 义为每min转化1 μ mol抗坏血酸所需的肽的量，比活定义为每μ mol肽所具有的活性。计 算公式如下，U比活（Unit/ μ mol)，ΔΑ吸光度差，ε抗坏血酸的消光系数（2. 8mM \ cm 3， c肽浓度（μ Μ)，1000单位换算系数。
[0155]
[0156] DhHP-6作为过氧化物酶模拟物，能够催化电子传递给还原性底物，因此酶活力以 抗坏血酸（AsA)和H2O 2体系测定。表1结果所示，DhHP-6的活性为30U/ μπιο?，即每分钟1 分子的次血红素肽可以转化约30分子的抗坏血酸和约15分子的H2O2。将DhHP-6序列截短 环化，酶活性为原形药的50-70%，这4个分子的共同特点是Lys侧链ε -NH2均被反应掉， 溶解性降低可能是一方面因素。
[0157] 表1次血红素肽过氧化物酶活性
[0159] 实施例10 Caco-2细胞透过性
[0160] Caco-2细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）以DMEM培养基（购 于德国GIBCO Invitrogen公司）（添加10%胎牛血清，1%非必需氨基酸（Gibco商品），2mM 谷氨酰胺）传代培养（37°C，5% CO2)。取60~66代次细胞，按2. 5 X IO5细胞/cm2铺种于 聚碳酸酯膜上（内插式24孔细胞培养板，孔径0. 4 μ m，表面积0. 6cm2)。每2天换液，待生 长至21~23天，细胞单层完全分化，跨膜电阻趋于稳定（500~800 Ω . cm2)，可以用于膜透 过测定。细胞用HBSS (购于德国GIBCO Invitrogen公司）洗2次，加400 μ I HBSS于37°C 孵育30min。次血红素肽样品以HBSS溶解（ImM)，经0. 22 μ m滤膜除菌，取200 μ 1加入到 细胞顶侧，400 μ I HBSS加入到细胞基底侧，37°C孵育120min。收集基底侧HBSS，以HPLC测 定所收集的HBSS中的肽含量，计算表观渗透系数。公式如下，P app表观渗透系数（cm/s)，C。 肽初始浓度，A膜表面积（0. 6cm2)，dQ/dt肽透过速率：
[0161]
[0162] Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞，在体外生长、融合并分化，形成连续的单层肠上 皮细胞，且表达小肠刷状缘相关的酶系，是预测药物人体吸收及转运机制的标准体外模型。 表2结果显示，DhHP-6的表观渗透系数P app在3 X 10 Scm/s范围，为小肠吸收不良的化合物。 4个环肽的细胞透过量比原形药均增加3倍，达到10 7cm/s范围，显著提高了肠道细胞的吸 收程度。环肽的刚性结构限制分子构象多样性，容易穿透细胞间限制性和非限制性孔道，增 加了其渗透量。
[0163] 表2次血红素肽Caco-2细胞透过性
[0164]
[0165] 实施例11代谢酶稳定性
[0166] 血清稳定性：大鼠（SD大鼠，吉林大学实验动物中心）尾静脉取血后，将血样 在37°C静置2h，然后3000rpm离心10min，分离上层血清。取100 μ 1血清和次血红素肽 (0· ImM)混合，37°C孵育，分别于0、6、12、18、24h加入200 μ1 TFA(12% )终止反应（涡旋 60s)，1000 Orpm离心5min，取上清用IM NaOH调pH 5~7,以HPLC测定肽含量。
[0167] 小肠匀浆稳定性：取新鲜分离的大鼠（SD大鼠，吉林大学实验动物中心）12指肠至 回肠段约20cm，用50ml冷生理盐水冲洗内容物，剪成小段置于PBS中（5ml，pH7. 5)，冰浴 勾衆（200rpm，2min)，4°C离心（10000rpm，10min)，收集上清，紫外280nm测定总蛋白浓度。 取100 μ 1血清和次血红素肽（0. 5mM)混合，37°C孵育，分别于0、20、40、60、120、180、240、 360、480min加入200 μ1 TFA(12%)终止反应（涡旋608)，10000邝111离心51^11，取上清用 IM NaOH调pH 5~7,以HPLC测定肽含量。
[0168] 人体胃肠道内含有丰富的消化酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋 白酶、外肽酶、内肽酶等，口服多肽吸收入血液之前，须经历上述代谢酶的作用。多肽的口 服生物利用度低，很大原因在于酶催化下的快速降解，降低了透过肠道屏障的有效药物浓 度。因此，本文设计合成特定位点环化的次血红素肽，以增强其代谢稳定性，并在体外模拟 生理环境，考察修饰后肽链的抗酶水解能力。如图5所示，DhHP-6在血清中的降解速率明 显比在小肠勾衆中慢，24h仍剩余80%。DhHP-6在小肠代谢酶的作用下迅速水解，半衰期 仅为lOmin。通过对代谢产物的解析，推测其主要降解途径是羧肽酶从肽链C端逐步切割。 DhHP-6在血清中的代谢途径与在肠匀浆中类似，但降解的速率较慢，可能由于血清中蛋白 酶或酰胺酶的浓度（活力）低导致。将肽链C端与N端次血红素环化，环化物显示出超强 的酶解稳定性，8h后仍有98%剩余，比原形药的半衰期增加2个数量级。环状结构使肽链 无法被蛋白内/外切酶所识别结合，进而催化酰胺键水解，因此环肽抵抗酶解的性能非常 优秀。
【主权项】
1. 一种次血红素分子与肽链的偶联方法，所述方法包括以下步骤： 1) 使次血红素的两个羧基脱水形成酸酐， 2) 使所述酸酐与肽链的游离氨基形成酰胺键。2. 权利要求1的偶联方法，其特征在于，在步骤1)中，以DIC或乙酸酐为活化剂，使次 血红素的两个羧基脱水形成酸酐。3. -种制备环化的次血红素肽的方法，所述方法包括： 1) 在固相载体上，按照Fmoc固相合成法从C端（羧基端）至N端（氨基端）顺序地偶 联经保护的 Fmoc-Lys (Mtt) -OH、Fmoc-X-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc- β -Ala-OH，得到经保护的 NH2- β -Ala-His (Trt) -X_Lys (Mtt)-固相载体， 其中X代表具有扭转酰胺键的任一氨基酸， 2) 偶联次血红素，其中用权利要求1的偶联方法将次血红素与步骤1)中的 ΝΗ2- β -Ala-His (Trt) -X-Lys (Mtt)-固相载体进行偶联， 3) 选择性地切割Mtt侧链保护基，暴露出游离氨基，然后在缩合剂的作用下，使所述游 离氨基与次血红素的羧基缩合成环，得到c(Dh-0 -Ala-His (Trt)-X-Lys)-固相载体， 4) 脱除保护基团，并将所得的c(Dh-0-Ala-His(Trt)-X-Lys)从固相载体上切割下 来，得到含有环化的次血红素肽c (Dh- β -AHXK)的溶液。4. 权利要求3的方法，其特征在于，所述缩合剂为PyBop/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt。5. 权利要求3的方法，其特征在于，用1 %的TFA选择性切割Mtt侧链保护基。6. 权利要求3的方法，其特征在于， 所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -AHPK)，其中P为脯氨酸； 所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -AHGK)，其中G为甘氨酸； 所述环化的次血红素的结构为c (Dh- β -AH- (d) Ε-Κ)，其中（d) Ε为D-谷氨酸；或 所述环化的次血红素的结构为c (Dh- β -AH- (Me) E-K)，其中（Me) E为N-甲基谷氨酸。7. 用权利要求3的方法制备的环化的次血红素肽，其结构如下：c (Dh- β -AHXK)，Dh代 表次血红素 ，β -A代表丙氨酸，H代表组氨酸，X代表具有扭转酰胺键的任一氨基酸，K代表 赖氨酸，c表示环化，环化发生在Dh的羧基与Κ侧链ε -氨基。8. 权利要求7的环化的次血红素肽，其中： 所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -ΑΗΡΚ)，其中Ρ为脯氨酸； 所述环化的次血红素的结构为：c (Dh- β -AHGK)，其中G为甘氨酸； 所述环化的次血红素的结构为c (Dh- β -AH- (d) Ε-Κ)，其中（d) Ε为D-谷氨酸；或 所述环化的次血红素的结构为c (Dh- β -AH- (Me) E-K)，其中（Me) E为N-甲基谷氨酸。9. 权利要求7或8的环化的次血红素肽制备用于预防和/或治疗疾病的药剂中的用 途，所述疾病可以使用抗坏血酸过氧化物酶或者具有抗坏血酸过氧化物酶活性的化合物治 疗，优选地，所述疾病选自糖尿病、白内障、心脑血管疾病、衰老、炎症，优选地，所述药剂是 口服药剂。10. -种药物组合物，其包含权利要求7或8的环化的次血红素肽和可药用载体。
【文档编号】A61P27/12GK105859840SQ201510032620
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】董庆光, 李惟, 陈妍
【申请人】长春百益制药有限责任公司