一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的制备方法及其应用。经过如下五个步骤制成：一是线性聚甲基丙烯酸羟乙酯(Hydroxyethyl methacrylate,PHEMA)的合成；二是半互穿网络水凝胶HEMA?co?DEAAm的制备；三是丙烯基修饰水凝胶；四是固定木瓜蛋白酶。通过本方法制得的温敏性水凝胶含有相互贯穿的多孔结构，具有大的比表面积，对温度变化能快速响应，是一种比较理想的固定化酶的载体。利用载体上的甲基丙烯酸甲酯双键结构与酶分子上巯基的点击反应进行酶的固定化。所以，其反应选择性高，只固定含巯基的酶；反应条件温和，反应温度在37℃左右；反应得到的固定化酶活性是传统方法戊二醛固定化酶的5.5倍，且稳定性较好，可回收重复利用。
【专利说明】
一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种新型温敏半互穿网络水凝胶的制备方法，尤其是一种温敏型多孔 半互穿网络水凝胶的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 酶的固定化（Immobilization of enzymes)是运用化学(共价键结合法、交联法） 或物理（吸附法、包埋法）等方法，使水溶性的酶与非水溶性的载体相结合，制备既保持酶 活，又可重复利用酶的新型功能材料。固定化酶在保持酶本身所具有的高选择性、高效率及 条件温和特点的同时，还呈现许多的优点，如贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使 用等。近年来，固定化酶在化学、医药、食品、环境工程以及工业生产等领域具有广泛的应 用，成为目前的研究热点。然而，固载酶载体材料的结构及性能直接影响固定化酶的性能。 因此，制备结构优异的载体材料至关重要。
[0003] 目前从文献看来，固载酶载体材料有无机材料、高分子材料、生物质材料等。近期， 材料学的新成果逐渐应用在酶固载材料领域。其中，智能材料是前沿和热点。智能固载酶材 料从类型上分，有pH响应型、温度响应型、磁性响应型等，从材料形态上分，有凝胶固体、载 体树脂等。其中，温敏性水凝胶在固定化酶方面具有比较好的优势。温敏水凝胶的特点是其 结构中含有一定比例的亲水基团和疏水基团，当外界温度发生变化时，这些基团的亲疏水 性以及氢键作用就会相应的发生变化。大多数的温敏水凝胶的亲水性会随着温度的增加而 增加，但是具有最低临界溶解温度（Lower critical solution temperature,LCST)的水凝 胶的亲水性却随着温度升高而降低，这种水凝胶处于低于LCST的温度时，亲水基团与水分 子通过氢键结合，增强凝胶在水中的溶解度;温度升高时，疏水基团间的相互作用加强，氧 键变弱，凝胶收缩。温敏水凝胶的LCST可以通过调节亲疏水基团的比例来改变，通常，亲水 基团含量越高，水凝胶的LCST越高，例如聚N，N-二乙基-2-丙烯酰胺(PDEAAM)、由聚环氧乙 烷(PEO)和聚环氧丙烷(PPO)组成的嵌段共聚物均具有温度敏感性，LCST接近于人体温度。 所以，可以通过控制反应温度来控制酶催化反应的进行与否。同时，LCST大都接近室温，反 应条件简单容易控制。所以，开展该项工作很有意义。
[0004] 近年来，以当代高新技术为依据设计合成新型载体、开发新型固定化方法以及两 者的有机结合是近年來许多学者所致力于的研究方向，开发的新型固定化方法必须遵循以 下原则:酶的固定化尽量较为温和，以最大限度的降低或避免酶活性损失，而温敏水凝胶作 为一种新的固定化酶的方式引起广大研究者们的广泛关注。Gotoh等分别以NIPAm和N，N-二 乙基丙稀酰胺(DEAAm)为单体，在温度高于LCST的条件下利用自由基聚合法制备了温敏性 的多孔PNIPAm和PDEAAm水凝胶。Zhang等以PEG为制孔剂制备了PNIPAm大孔温敏型水凝胶， 通过改变PEG用量可以调节水凝胶的结构。Alves等以异丙基丙酰胺、海藻酸钙制备了 pH/温 度敏感的Semi-IPN水凝胶。Guo等以羧甲基壳聚糖和聚(N-异丙基丙烯酰胺）制备了Semi-IPN水凝胶聚合物，并研究了该聚合物的药物释放性能。Cheng等利用制孔剂制备了PNIPAm 大孔水凝胶，并进行牛血清蛋白控释研究，药物的控释速率和控释率更高。胡林等利用等离 子填孔接枝聚合技术将PNIPAm接枝到聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜孔上，然后与交联PNIPAm水凝 胶组合制成了一种温度感应控制释放膜系统，该系统具有良好的温度响应性。Lee等利用 PNIPAm与几种不同的离子单体聚合，以不同分子量的PEG为制孔剂制备了一系列水凝胶，研 究了咖啡因在水凝胶中的释放机理。由给定的已知文献可知，利用DEAAm与线性甲基丙烯酸 羟乙酯为原料制备多孔半互穿网络水凝胶并用甲基丙烯酸甲酯双键结构进行修饰的研究 尚无人完成，具有一定的创新性，研究工作具有重要意义。
[0005] 本发明基于DEAAm为原料与线性甲基丙烯酸羟乙酯制备多孔半互穿网络水凝胶， 利用该新型基质材料和巯基反应固定巯基酶，具有极强的选择性和极好的温度响应性。从 固定木瓜蛋白酶所获结果可知，固定化木瓜蛋白酶可重复利用，活性回收率6.5 %，温度响 应范围为35~39°C，热稳定性85%，具有优异的性质。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的制备方法， 以及用这种新型凝胶固定木瓜蛋白酶的应用。
[0007] 解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的制 备方法，按如下步骤进行：
[0008] ( I )PHEMA的合成：将5mg的引发剂偶氮二异丁腈（2,2'-厶2〇1^8(2-methylpropionitrile)，AIBN)、2mL 的单体甲基丙稀酸轻乙酯（Hydroxyethyl methacrylate，HEMA)加到4mL的溶剂二甲基亚讽(Dimethyl sulfoxide ,DMS0)中，在氮气环 境下60 °C水浴中回流8h，得到PHEMA淡黄色液体。用乙醚沉淀，过滤，烘干得到PHEMA粉末。
[0009] (2)网络半互穿水凝胶的制备:将0.1 g的制孔剂聚乙二醇PEG20000、1.8mL的N，N-二乙基丙稀酰胺(N，N-diethyl-Acrylamide，DEAAm)、0.04g的交联剂N，N-亚甲基双丙稀酰 胺(Methylene-Bis-Acrylamide ,Bis)和0·075g的PHEMA粉末溶于6mL的DMSO中，在氣气环境 下水浴回流6h，得到凝胶。
[0010] (3)丙烯酸酯修饰凝胶:将凝胶置于蒸馏水中浸泡14天，称量Ig浸泡后的凝胶，溶 于IOmL的N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF)中，加入0 ·01~0 · 05g的甲醇 钠，搅拌条件下滴加〇. I Ig的氨基乙醇，在150°C左右搅拌回流4h。反应结束后，冷却至80°C， 加入0.005g的对苯二酚，滴加0.18g的甲基丙烯酸甲酯，水浴回流lh，得到透明凝胶状固体。 反应结束后，用水洗涤固体数次，得到温敏型多孔半互穿网络水凝胶。
[0011] 一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的应用，所述应用为:将温敏型多孔半互穿网 络水凝胶用于固定含巯基的酶。
[0012] 本发明的有益效果是通过本方法制得的温敏性水凝胶含有相互贯穿的多孔结构， 具有大的比表面积，对温度变化能快速响应，是一种比较理想的固定化酶的载体。利用载体 上的甲基丙烯酸甲酯双键结构与酶分子上巯基的点击反应进行酶的固定化，具有反应选择 性高，反应条件温和，方法易于操作的优点，反应得到的固定化酶活性是传统方法通过戊二 醛固定化酶的5.5倍，且其稳定性较好，可回收利用。
【附图说明】
[0013] 附图1为本发明的新型温敏半互穿网络水凝胶制备技术路线图，图中，①引发剂 AIBN②溶剂DMSO③交联剂Bis④制孔剂PEG20000⑤DEAAm单体⑥CH3ONa⑦NH2C2H4OH⑧对苯 二酚⑨甲基丙烯酸甲酯
[0014]附图2为本发明的新型温敏半互穿网络水凝胶红外光谱图。
[0015]附图3为本发明的新型温敏半互穿网络水凝胶的13C核磁谱图。
[0016]附图4为本发明的新型温敏半互穿网络水凝胶的1H核磁谱图。
[0017]附图5为本发明的新型温敏半互穿网络水凝胶的电镜扫描图。
【具体实施方式】
[0018] 本发明下面结合实施例并参照附图作进一步阐述：
[0019] 先购得如下原料：甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、二甲基亚砜 (DMSO)、聚乙二醇（roG20000)、N，N-二乙基丙烯酰胺（DEAAm)、N，N-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)、甲基丙烯酸甲酯、氨基乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇钠、对苯二酚。本实施例用g作 重量单位，mL为体积单位。
[0020] 实施例1
[0021 ] 1.多孔半互穿温敏水凝胶的制备方法，其特征是按如下步骤进行：
[0022] (I)PHEMA的合成：将5mg的引发剂AIBN、2mL的单体HEMA加到4mL的溶剂DMSO中，通 氮气，在60 °C中水浴回流8h。反应结束后，用乙醚沉淀，过滤，烘干的PHEMA粉末。合成反应原 理如下：
[0024] (2):多孔网络半互穿水凝胶的制备：将O.lg的制孔剂PEG20000、1.8mL的DEAAm、 〇. 〇4g的交联剂Bis和0.075g的PHEMA溶于6mL的DMSO中，通氮气，水浴回流6h。反应结束后， 得到凝胶。合成反应原理如下：
[0026] (3)丙烯酸酯修饰凝胶:将凝胶置于蒸馏水中浸泡14天，称取Ig浸泡后的凝胶，溶 于IOmL的DMF中，加入0.01~0.05g甲醇钠，搅拌并滴加0.1 lg的氨基乙醇，在150°C左右搅拌 回流4h。反应结束后，冷却至80 °C，加入0.005g对苯二酚，缓慢滴加 O . 18g的甲基丙烯酸甲 酯，水浴回流lh。反应结束后，用水洗涤数次，得到温敏型多孔半互穿网络水凝胶。
[0028] 将温敏型多孔半互穿网络水凝胶进行红外、13C核磁共振、1H核磁共振、扫描电镜扫 描。结果如下:红外图谱如图2所示，其中，3080-2870(^ 1为凝胶碳碳双键处甲基亚甲基C-H 的伸缩振动吸收峰，1469-1380011+1为甲基C-H弯曲振动吸收峰，895cm-1为亚甲基C-H弯曲振 动吸收峰，ΙδδΟαιΓ 1为C = O的伸缩振动吸收峰。凝胶中，360001^1处无特征峰，表明甲基丙稀 酸甲酯修饰水凝胶成功，即新型温敏型多孔半互穿水凝胶合成成功。 13C核磁图谱(NMR)如图 3/H核磁图谱(匪R)如图4,由其可知温敏型多孔半互穿水凝胶合成成功。扫描电镜图如图 5,可知水凝胶内为相互贯穿的多孔结构，孔洞大小和分布比较均匀。
[0029] 实施例2
[0030] 将实施例1制备的温敏型多孔半互穿网络水凝胶用于固定含巯基的酶，按如下步 骤进行：
[0031] 巯基点击反应固定木瓜蛋白酶:称取0.1 g制得的温敏型多孔半互穿网络水凝胶， 将其加入到酶溶液中，加热至30°C，凝胶开始吸收酶溶液发生溶胀，酶分子在凝胶内部与凝 胶发生交联反应，制得固定化酶。将制得的固定化木瓜蛋白酶保存在O.lmol/L磷酸盐缓冲 液的(pH=7)4°C保存。
[0033]经实验对比，得出所制得的固定化酶的酶活性是使用戊二醛交联所得的固定化酶 的5.5倍左右。
[0034] 实施例3
[0035] 一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的制备方法，按如下步骤进行：
[0036] (I)PHEMA的合成:将5mg引发剂AIBN、2mL单体HEMA加到4mL溶剂DMSO中，通氮气，在 60 °C中水浴回流8h。反应结束后，用乙醚沉淀，过滤，烘干得到PHEMA粉末。
[0037] (2)多孔网络半互穿水凝胶的制备：将0.1 g的制孔剂PEG20000、1.8mL的DEAAm、 〇. 〇4g的交联剂Bis和0.075g的PHEMA溶于6mL的DMSO中，通氮气，水浴回流6h。反应结束后， 得到凝胶。
[0038] (3)丙烯酸酯修饰凝胶:将凝胶置于蒸馏水中浸泡14天，称取Ig浸泡后的凝胶，溶 于IOmL的DMF中，加入0.01~0.05g的甲醇钠，搅拌并滴加0.1Ig的氨基乙醇，在温度1下搅拌 回流4h。反应结束后，冷却至温度2，加入0.005g的对苯二酚，滴加0.18g的甲基丙烯酸甲酯， 水浴回流lh。反应结束后，用水洗涤数次，得到温敏型多孔半互穿网络水凝胶a~f。
[0039] 表1温度对凝胶特性的影响
[0041 ]由表1可知，温度1为150 °C、温度2为80 °C时，所得水凝胶最优。温度过高时，会产生 大量副产物使产率较低，而温度较低时，会有大量反应物剩余。所以，温度过高还是过低都 会使水凝胶杂质过多而降低水凝胶的效用。
【主权项】
1. 一种温敏型多孔半互穿网络水凝胶的制备方法，其特征是，按如下步骤进行： (1 )PHEMA的合成：将5mg的引发剂偶氮二异丁腈（2,2'-厶2〇1^8(2-methylpropionitrile)，AIBN)、2mL 的单体甲基丙稀酸轻乙酯（Hydroxyethyl methacrylate，HEMA)加到4mL的溶剂二甲基亚讽(Dimethyl sulfoxide，DMS0)中，在氮气环 境下60 °C水浴中回流8h，得到PHEMA淡黄色液体。用乙醚沉淀，过滤，烘干得到PHEMA粉末。 ⑵网络半互穿水凝胶的制备：将〇. lg的制孔剂聚乙二醇PEG20000、1.8mL的N，N-二乙 基丙稀酰胺(N，N-diethyl-Acrylamide，DEAAm)、0.04g的交联剂N，N-亚甲基双丙稀酰胺 (Methylene-Bis-Acrylamide，Bis)和0 · 075g的PHEMA 粉末溶于 6mL的DMS0 中，在氣气环境下 水浴回流6h，得到凝胶。 (3)丙烯酸酯修饰凝胶：将凝胶置于蒸馏水中浸泡14天，称量lg浸泡后的凝胶，溶于 101111^的1^，1^-二甲基甲酰胺（1^，1^-0;[11161:1171;1^〇1'1]1&1111(16,0]\〇 7)中，加入0.01~0.058的甲醇钠， 搅拌条件下滴加〇. 11 g的氨基乙醇，在150°C左右搅拌回流4h。反应结束后，冷却至80 °C，加 入0.005g的对苯二酚，滴加0.18g的甲基丙烯酸甲酯，水浴回流lh，得到透明凝胶状固体。反 应结束后，用水洗涤固体数次，得到温敏型多孔半互穿网络水凝胶。2. 如权利1所述方法制备的温敏型多孔半互穿网络水凝胶的应用，其特征在于，所述应 用为:将温敏型多孔半互穿网络水凝胶用于固定含巯基的酶。
【文档编号】C08F8/00GK105860098SQ201610248637
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】郭明, 黄婧欣
【申请人】浙江农林大学