注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及注射用高分子普鲁兰多糖?胶原蛋白复合水凝胶及其制备方法。现有制备方法中，交联剂无法通过清洗除去，存在残留毒性的问题，且使用的普鲁兰多糖分子量较小，无法克服水凝胶易降解的问题。本发明将高分子量普鲁兰多糖完全溶解，调节pH，加入交联剂，再混入胶原蛋白溶液反应，之后重复高温高压蒸，除去残留交联剂，平衡后制粒得到产品。本发明具有稳定性好、生物相容性高、抗酶解性能好、可避免外科手术的创伤和减少病人疼痛的优点；引入的胶原蛋白可对水凝胶的细胞粘附性和促细胞生长性产生积极的影响；适合于注射到体内、体内保留时间长、填充效果好，可以广泛应用于组织填充领域。
【专利说明】
注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶及其制备 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种水凝胶，具体涉及一种注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合 水凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水凝胶是一种网状结构的水溶性高分子物质，广泛应用于组织填充领域。普鲁兰 多糖是一种天然、水溶性多糖，该多糖由α-1，4_糖苷键连接的麦芽三糖重复单元经α-1，6_ 糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量一般在4800~2200000之间。普鲁兰因其良好的生物 性能，已被广泛应用于生物材料、化妆品和化工领域。但由于普鲁兰多糖存在降解速度快、 机械强度较低等缺陷，而限制了其应用范围，因此在组织填充的实际应用中，经常通过发酵 生产提高普鲁兰多糖分子量改变交联剂等方法使普鲁兰多糖分子内或分子间发生交联制 备成为普鲁兰多糖水凝胶，从而延长其在生物体内的作用时间。
[0003] 关于普鲁兰多糖交联水凝胶的制备已有专利报道。专利CN 104844810 A公开了一 种交联普鲁兰多糖类人胶原蛋白水凝胶的制备方法。该发明中，采用1，4_丁二醇二缩水甘 油醚作为交联剂在碱性条件下与普鲁兰多糖中的羟基发生反应，再用无热源水和磷酸盐缓 冲液清洗除去未反应的交联剂从而制备得到产品。但在反应过程中，有的丁二醇二缩水甘 油醚只有一个环氧基团参与了反应，这些交联剂无法通过清洗除去，因此还会存在残留毒 性的问题。且该发明中使用的普鲁兰多糖分子量较小，无法克服水凝胶易降解的问题。
[0004] 胶原蛋白是人体皮肤组织的重要组成成分，可保持皮肤弹性。类人胶原蛋白是将 人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA重组于E. coli(大肠杆菌）内，经过高密度发酵、分离、复 性、纯化工艺生产的一种高分子生物蛋白。它具有良好的生物吸收性、细胞粘附性和生物相 容性，并且可明显促进细胞生长，因此非常适合应用于医学、整形等方面。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶及其制 备方法，使用更安全、缓释作用更好。
[0006] 本发明所采用的技术方案为： 注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于： 由以下步骤实现： 步骤一:将普鲁兰多糖溶于双蒸水中，充分搅拌，4°C冰箱过夜使其完全溶解，使混合溶 液中普鲁兰多糖的质量百分比为5%~12%;调节普鲁兰多糖溶液pH至8~11; 步骤二：向普鲁兰多糖溶液体系中加入交联剂，使混合溶液中就交联剂的质量百分比 为1~10%，搅拌均匀； 步骤三:混入胶原蛋白溶液，使混合溶液胶原蛋白的质量百分比是5%~15%，反应温度 50~70 °C，反应时间1~5小时； 步骤四：得到的产物在无热源水或生理盐水中平衡48~120小时后，115°C，30min条件 下重复高温高压蒸以除去残留交联剂； 步骤五:所得产物用制粒机进行制粒得到可注射水凝胶颗粒。
[0007] 步骤一中： 普鲁兰多糖由出芽短梗霉分泌的水溶性细胞外多糖，其分子量为600000 g/mol~ 2560000g/mol； 调节pH选用氢氧化钠，摩尔体积分数为0.1~2 mol/L。
[0008] 步骤二中，交联剂选自1，2,7,8-二环氧辛烷、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐、戊二醛。
[0009] 步骤三中，胶原蛋白的来源为动物胶原蛋白和基因工程菌BL21高密度发酵生产的 类人胶原蛋白。
[0010] 步骤四中，除去残留交联剂的方法选自水洗、生理盐水清洗、高温高压蒸馏。
[0011 ]步骤五中，粉碎处理选自挤压、研磨、切割方式。
[0012] -种如所述的制备方法制得的注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶。 [0013]本发明具有以下优点： 本发明采用高分子普鲁兰多糖和胶原蛋白为原料，混入交联剂制备水凝胶(单纯使用 普鲁兰多糖制备水凝胶时存在降解速度过快、机械强度低的问题，不能完全满足临床应用， 因此我们引入胶原蛋白制备得到更加理想的水凝胶），得到的产品中交联剂残留量低，对生 物体损害较小，且胶原蛋白可提高水凝胶的机械强度，并对产品的细胞粘附性和促细胞生 长性产生积极的影响，从而使该水凝胶作为软组织填充材料表现出更大的优势。
【附图说明】
[0014] 图1为六种水凝胶样品外观。
[0015] 图2为用制粒机制粒后的水凝胶颗粒。
[0016] 图3为制备的水凝胶针剂。
[0017] 图4为用注射器挤出的水凝胶颗粒。
[0018] 图5为4°C和37 °C下水凝胶在PBS重的溶胀率。
[0019] 图6为4°C和37 °C下水凝胶在超纯水的溶胀率。
[0020] 图5和图6的结果显示，水凝胶经过48h溶胀后形貌恢复原样，添加胶原蛋白水凝胶 的溶胀率高于未加胶原蛋白的水凝胶，高分子的普鲁兰多糖减小了水凝胶的溶胀程度，表 明水凝胶的交联效果增强。
[0021] 图7为Gell水凝胶的压缩应力和压缩位移的关系。
[0022]图8为Gel2水凝胶的压缩应力和压缩位移的关系。
[0023]图9为Gel3水凝胶的压缩应力和压缩位移的关系。
[0024]图10为Gel4水凝胶的压缩应力和压缩位移的关系。
[0025]图11为Gel5水凝胶的压缩应力和压缩位移的关系。
[0026]图12为Gel6水凝胶的压缩应力和压缩位移的关系。
[0027] 图13为水凝胶填充材料的抗酶解性能图。
[0028] 图13表示在37°C，六种水凝胶用普鲁兰酶体外降解两个月后的质量残留率。
[0029] 图14为Gell、Gel2、Gel3的扫描电镜图。
[0030] 图15为Gel4、Gel5、Gel6的扫描电镜图。
[0031] 图16为水凝胶填充材料的小鼠急性毒性实验和红细胞溶血率检测图。
[0032]图17为水凝胶填充材料的MTT细胞毒性检验结果。
【具体实施方式】
[0033]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0034] 本发明首次将高分子的普鲁兰多糖通过环氧类化合物等交联制备出可用于组织 填充的可注射水凝胶，并通过向体系中混入胶原蛋白提高其生物相容性等，所得的水凝胶 材料完全适用于组织填充使用。
[0035] 具体是制备方法由以下步骤实现： 步骤一:将普鲁兰多糖溶于双蒸水中，充分搅拌，4°C冰箱过夜使其完全溶解，使混合溶 液中普鲁兰多糖的质量百分比为5%~12%;调节普鲁兰多糖溶液pH至8~11; 步骤二：向普鲁兰多糖溶液体系中加入交联剂，使混合溶液中就交联剂的质量百分比 为1~10%，搅拌均匀； 步骤三:混入胶原蛋白溶液，使混合溶液胶原蛋白的质量百分比是5%~15%，反应温度 50~70 °C，反应时间1~5小时； 步骤四：得到的产物在无热源水或生理盐水中平衡48~120小时后，115°C，30min条件 下重复高温高压蒸以除去残留交联剂； 步骤五:所得产物用制粒机进行制粒得到可注射水凝胶颗粒。
[0036] 步骤一中： 普鲁兰多糖由出芽短梗霉分泌的水溶性细胞外多糖，其分子量为600000 g/mol~ 2560000g/mol； 调节pH选用氢氧化钠，摩尔体积分数为0.1~2 mol/L。
[0037] 步骤二中，交联剂选自1，2,7,8-二环氧辛烷(DE0)、l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐(EDC)、戊二醛。
[0038]步骤三中，胶原蛋白的来源为动物胶原蛋白和基因工程菌BL21高密度发酵生产的 类人胶原蛋白。
[0039] 步骤四中，除去残留交联剂的方法选自水洗、生理盐水清洗、高温高压蒸馏。
[0040] 步骤五中，粉碎处理选自挤压、研磨、切割方式。
[0041 ] 实施例1: 步骤一:称量普鲁兰多糖(分子量为696265g/m〇l)粉末溶于IOml双蒸水中，得到质量分 数为8%的普鲁兰多糖溶液，充分搅拌后，置于4°C冰箱过夜使其充分溶解;用0. lmol/L NaOH 溶液调节普鲁兰溶液pH至8; 步骤二：向上述溶液中加入交联剂DEO混匀，使交联剂的体积浓度为4%; 步骤三：向上述溶液中加入胶原蛋白溶液，使普鲁兰多糖和胶原蛋白的质量比为5:2， 搅拌均匀;置于55°C恒温水浴锅中反应5h制得水凝胶； 步骤四：将制得的水凝胶在无热源水中清洗5天，115°C，30min高温高压蒸3次，用制粒 机制成不同粒径的水凝胶。
[0042] 本实施例中：未加胶原蛋白和加胶原蛋白水凝胶分别命名为:Gell，Gel4。
[0043] 实施例2: 步骤一:称量普鲁兰多糖(分子量为994176g/mol)粉末溶于IOml双蒸水中，得到质量分 数为I 〇 %的普鲁兰多糖溶液，充分搅拌后，置于4 °C冰箱过夜使其充分溶解；用0.8 m 〇 I / L NaOH溶液调节上述溶液的pH至9; 步骤二:其上述溶液中加入交联剂DEO混匀，使交联剂的体积浓度为6%; 步骤三：向上述溶液中加入胶原蛋白溶液，使普鲁兰多糖和胶原蛋白的质量比为7:1， 搅拌均匀;置于65°C恒温水浴锅中反应3h制得水凝胶； 步骤四：将制得的水凝胶在生理盐水中清洗3天，115°C，30min高温高压蒸6次，用制粒 机制成不同粒径的水凝胶。
[0044] 本实施例中：未加胶原蛋白和加胶原蛋白水凝胶分别命名为:Gel2，Gel5。
[0045] 实施例3: 步骤一:称量普鲁兰多糖(分子量为2560000g/mol)粉末溶于IOml双蒸水中，得到质量 分数为12%的普鲁兰多糖溶液，充分搅拌后，置于4°C冰箱过夜使其充分溶解；用2mol/L NaOH溶液调节体系pH至11; 步骤二：向上述溶液中加入交联剂DEO混匀，使交联剂的体积浓度为10%; 步骤三：向上述体系中加入胶原蛋白溶液，使普鲁兰多糖和胶原蛋白的质量比为8:3， 搅拌均匀;置于70°C恒温水浴锅中反应Ih制得水凝胶； 步骤四：将制得的水凝胶在生理盐水中清洗3天，115°C，30min高温高压蒸6次，用制粒 机制成不同粒径的水凝胶。
[0046] 本实施例中：未加胶原蛋白和加胶原蛋白水凝胶分别命名为:Gel3，Gel6。
[0047] 对实施例产物进行溶胀性能、力学性能、样品观察、扫描电镜、抗酶解性、小鼠急性 毒性试验和细胞毒性实验等，结果参见附图1-17。
[0048] 图4为用注射器挤出的水凝胶颗粒，图4表示该水凝胶为可注射水凝胶。
[0049]图5和图6的结果显示，水凝胶经过48h溶胀后形貌恢复原样，添加胶原蛋白水凝胶 的溶胀率高于未加胶原蛋白的水凝胶，高分子的普鲁兰多糖减小了水凝胶的溶胀程度，表 明水凝胶的交联效果增强。
[0050] 图7-12结果表明：普鲁兰多糖分子量的增加和胶原蛋白的修饰提高了水凝胶的机 械强度，六种水凝胶的机械强度均满足组织填充的要求。
[0051] 图13结果显示:两个月后，水凝胶质量残留均达80%以上，说明本水凝胶可达到降 解时间长、体内保持久的要求，适用于组织填充。
[0052]图14和图15的水凝胶的微观结果呈孔状排列，但是孔径分布表现不同，随着普鲁 兰多糖分子量的增大和胶原蛋白的修饰，内部孔径较小，形成紧密。
[0053]图16结果说明：急性毒性采用小鼠腹腔注射材料生理盐水浸提液，以小鼠体重变 化为参考标准，注射三天内，实验组小鼠与对照组小鼠体重变化相当，且第三天实验组小鼠 体重增长大于对照组。
[0054]表一
表一结果说明：药典规定:若材料溶血率<5%，即认定为材料对红细胞无伤害，材料合 格。若样品组与阴性对照组差值为负值，按零计算。可能原因还是材料本身对红细胞的破坏 作用很小，几乎为零，试验过程稍有误差就会出现负值。本实验结果证明本凝胶材料对小鼠 基本无影响，对红细胞无破坏作用。
[0055]图17结果说明：采用BHK细胞MTT法检验材料浸提液的细胞毒性。培养五天后，细胞 存活率均大于90%，且普鲁兰多糖-胶原蛋白水凝胶材料组细胞存活率均超过100%，表明该 材料对细胞生长有明显的促进作用。本实验结果表明：根据国家标准，六组材料毒性等级为 I级，属于可放心使用的组织填充材料。
[0056]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书 而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，其特征在于： 由以下步骤实现： 步骤一:将普鲁兰多糖溶于双蒸水中，充分搅拌，4°C冰箱过夜使其完全溶解，使混合溶 液中普鲁兰多糖的质量百分比为5%~12%;调节普鲁兰多糖溶液pH至8~11; 步骤二：向普鲁兰多糖溶液体系中加入交联剂，使混合溶液中就交联剂的质量百分比 为1~10%，搅拌均匀； 步骤三:混入胶原蛋白溶液，使混合溶液胶原蛋白的质量百分比是5%~15%，反应温度 50~70 °C，反应时间1~5小时； 步骤四：得到的产物在无热源水或生理盐水中平衡48~120小时后，115°C，30min条件 下重复高温高压蒸以除去残留交联剂； 步骤五:所得产物用制粒机进行制粒得到可注射水凝胶颗粒。2. 根据权利要求1所述的注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法， 其特征在于： 步骤一中： 普鲁兰多糖由出芽短梗霉分泌的水溶性细胞外多糖，其分子量为600000 g/mol~ 2560000g/mol； 调节pH选用氢氧化钠，摩尔体积分数为0.1~2 mol/L。3. 根据权利要求1所述的注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法， 其特征在于： 步骤二中，交联剂选自1，2,7,8_二环氧辛烷、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐、戊二醛。4. 根据权利要求1所述的注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法， 其特征在于： 步骤三中，胶原蛋白的来源为动物胶原蛋白和基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人 胶原蛋白。5. 根据权利要求1所述的注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法， 其特征在于： 步骤四中，除去残留交联剂的方法选自水洗、生理盐水清洗、高温高压蒸馏。6. 根据权利要求1所述的注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法， 其特征在于： 步骤五中，粉碎处理选自挤压、研磨、切割方式。7. -种如权利要求1所述的制备方法制得的注射用高分子普鲁兰多糖-胶原蛋白复合 水凝胶。
【文档编号】A61L27/26GK105860151SQ201610226377
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】马晓轩, 张乐, 范代娣, 薛文娇
【申请人】西北大学, 陕西省微生物研究所