向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法
【专利摘要】本发明公开了一种向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，并找出了最佳比例，属于微藻技术领域。本发明通过向天然海水中添加比例为1：10?1：50的消化液作为实验组培养基，BG11、天然海水、消化液作为对照组，在连续光照的条件下进行培养，培养至微藻停止生长时，离心分离收获藻体。结果表明在添加了消化液的天然海水中培养的微藻的生长速率明显高于在BG11、纯海水中培养的微藻，而且用添加了消化液的天然海水作培养基提高了微藻的油脂产率，降低了微藻的培养成本，值得推广使用。
【专利说明】
向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微藻生物技术领域，特别是指一种向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消 化液培养微藻的方法。
【背景技术】
[0002] 随着经济与社会的迅速发展，人类对煤、石油、天然气等化石燃料的需求量越来越 高。然而化石燃料的大规模使用严重加剧了能源危机和全球气候变化，因此，寻求一种新的 可再生能源是迫切需要的。微藻由于具有细胞繁殖快、生长周期短、固碳能力强、光合效率 高、环境适应性强、不占用农业耕地等特点而被广泛用作生产生物柴油的原材料。然而由于 微藻培养成本高的问题制约了微藻产油的大规模商业化生产。因此，寻求一种低成本的微 藻培养基成为研究的热点和焦点。
[0003] 许多研究者已经研究了利用废水来培养微藻。Ting Cai等人在人工海水中添加了 不同比例的工业废水厌氧消化液来培养集胞藻，其中当消化液的比例为3%时，集胞藻获得 最大的生物质产率（150· 9±8·6mgL-ld-l)和油脂产率（19·9± 1 · 2mgL-ld-l) (Cai et al ·， 2013) <Jo〇-Young Jung等人用不同比例的天然海水和BGll培养斜生栅藻，其中当天然海水 的比例为10%时获得最大的生物量（l.lg/L)和脂肪酸甲酯产量（9%)(Jung et al.， 2015)。然而配制人工海水和BGl 1需要消耗大量的淡水资源。相比而言，海水，储量丰富，覆 盖了地球表面的71%，含有有利于海洋生物生长的丰富的矿物质，主要是Na+，Cl-，Mg2+， S042-，Ca2+。其中海水以高盐度著称，这有利于刺激微藻油脂的积累，因此利用海水培养微 藻具有很大的发展前景。然而直接利用海水培养微藻又是不可取的，因为微藻生长除了需 要矿物质，还需要氮、磷等丰富的营养物质。而海水中氮、磷等营养物质的含量相当低，不足 以满足微藻生长的需要。餐厨垃圾厌氧消化液是餐厨垃圾中的有机质经过厌氧消化而得， 里面仍然含有丰富的氮、磷等营养物质。如果直接排放，会造成严重的环境污染。如果将餐 厨垃圾厌氧消化液添加到海水中作为培养基来培养微藻，海水可以作为微藻油脂积累的诱 导剂，消化液可以作为微藻生长的营养源，从而达到微藻生长和油脂积累的双赢目的。而且 海水储量丰富，成本较低，消化液同时也得到了处理。所以用添加了餐厨垃圾厌氧消化液的 天然海水培养微藻是一种经济环保有效的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液来培养微藻的方法。该 方法可以很好的解决微藻培养成本高的问题，同时兼顾提高微藻的油脂含量。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
[0006] -种向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其特征为包括如下 步骤：
[0007] (1)将小双色藻SDEC-6置于BGll培养基中进行富集培养；
[0008] (2)配制混合培养基，所述混合培养基是由比例为1:10-1:50的餐厨垃圾厌氧消化 液与天然海水组成；
[0009] (3)将步骤（1)制得的藻细胞种子液接种到步骤(2)制得的混合培养基中，接种后 的生物质密度为〇. 06-0.07g/L;
[0010] (4)将步骤（3)制得的反应装置置于人工气候室中培养，培养条件为：温度25±1 °C，81ymol photons/m2/s连续光照。
[0011] 本发明具有以下有益效果：
[0012] (1)本发明向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻，天然海水储量丰富， 成本较低，微藻获得了比较理想的生长速率，因此本发明大大降低了微藻培养的成本。
[0013] (2)本发明向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻，获得了较高的微藻 的油脂产率，可以作为一种较好的培养方式。
[0014] (3)本发明向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻，找出了餐厨垃圾厌 氧消化液的最佳添加比例来培养微藻，同时餐厨垃圾厌氧消化液同时也得到了处理，环保 经济。
【附图说明】
[0015] 图1为小双色藻SDEC-6在添加了不同比例消化液的天然海水中的生长曲线。
[0016] 图2为小双色藻SDEC-6在添加了不同比例消化液的天然海水中的油脂积累特性。
【具体实施方式】
[0017] 以下通过实施例的方式对本发明做进一步阐述。
[0018] 1、藻株，选取培养的微藻种类为小双色藻SDEC-6，筛选自济南泉城公园，并保存于 中国淡水澡种库。
[0019] 2、天然海水，选取自黄海（山东日照海域），经0.45μπι醋酸纤维酯滤膜抽滤后可直 接使用，测得其初始水质为:TN:10-50mg/L，NH3-N:l-10mg/L，TP :0.01-lmg/L，pH:8-10，Na: 10000-15000mg/L，Mg:1000-1500mg/L，Ca:800-1000mg/L，K:200-500mg/L，Si:60-90mg/L。
[0020] 3、餐厨垃圾厌氧消化液，选取自济南十方环保公司，经六层纱布过滤后，再以 4500-6000r/min的速度离心8-10min后可用，测得其初始水质为412000-300011^/1，順3-N:2000-3000mg/L，TP:10-50mg/L，COD:5000-8000mg/L，pH:8-10。
[0021] 实施例1:小双色藻SDEC-6的生长特性 [0022] 1、藻体培养过程：
[0023] (1)将小双色藻SDEC-6置于BGll培养基中进行富集培养，BGll培养基成分如下： NaN031.5g/L,K2HP0440mg/L,MgS04 · 7H20 75mg/L,CaC12 · 2H20 36mg/L,Citric acid 6mg/L,Ferric ammonium citrate 6mg/L,EDTANa21mg/L,Na2C0320mg/L,A5solution ImL/ L.A5solution:H3B032.86g/L,MnC12 · 4H20 1,86g/L,ZnS04 · 7H20 0.22g/L,Na2Mo04 · 2H20 0.39g/L,CuS04 · 5H20 0.08g/L,Co(N03)2 · 6H20 0.05g/L〇
[0024] (2)将步骤（I)获得的藻类种子液稀释十倍后于680nm处其吸光度为0.172,其干重 为0.06-0.07g/L。
[0025] (3)将步骤(2)中获得的种子液接种到消化液比例为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 的混合培养基中，并以BGl 1、天然海水和消化液为培养基分别作为对照实验，在人工气候室 中进行恒温培养，培养过程中每天取样测定生物量并进行水质分析。
[0026] (4)待步骤(3)中的藻体停止生长，对藻液进行离心收获，倒掉上清液，得到藻泥。
[0027] (5)对步骤(4)中的藻泥进行冷冻干燥，获得干藻粉。
[0028] 2、藻体生物量测定：
[0029] 每日同一时间取20mL藻液在5000r/min条件下离心10min分层，藻泥取出后置于恒 温干燥箱中60°C下恒温烘干称重测定生物量浓度(g/L)。上清液经0.45μπι醋酸纤维酯滤膜 超滤用于分析氮磷浓度。总氮的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（HJ636-2012)，氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法(HJ535-2009)，总磷的测定采用钼酸铵分光光 度法(GB11893-89)。
[0030] 3、生物量测定结果：
[0031] (1)如图1所示，在单纯的消化液中小双色藻SDEC-6未能生长;在单纯的海水中由 于营养物质太低，小双色藻SDEC-6生长比较缓慢。在消化液添加比例为1/10-1/50的天然海 水中，小双色藻SDEC-6均有生长。
[0032] (2)如表1所示，在消化液添加比例为I/10-1 /50的天然海水中，小双色藻SDEC-6的 生物量明显高于在BG11中的生物量;其中在消化液添加比例为1 /30的天然海水中，小双色 藻SDEC-6的生物量可以达到0.35g/L，平均生物质产率为23.33mg/L/d，比生长速率为 0.18(1'
[0033] 4、结果分析：
[0034]添加1/20-1/40消化液的天然海水可以作为一种比较理想的替代培养基来培养小 双色藻SDEC-6获得生物质，这是因为在此添加比例范围内中的氮磷浓度比较适合小双色藻 SDEC-6的生长，而且海水中的NaCl可以增加混合培养基中的盐浓度从而刺激藻类的代谢活 动加速藻类的生长，同时海水中的高盐度可以避免其他微生物的入侵。
[0035] 表1小双色藻SDEC-6在不同培养基中的最终干重、平均生物质产率、比生长速率。
[0037]实施例2:小双色藻SDEC-6的油脂积累特性 [0038] 1、油脂含量测定：
[0039] 称取约0.1 g实施例1中得到的干藻粉于50mL离心管中，加入IOmL氯仿/甲醇(v/v = 2:1)溶液，用超声破碎仪处理IOmin(频率20%)，然后4000r/min离心10min，离心完溶液分 两相，将上清液转移到60mL分液漏斗中，整个提取过程重复两次。根据油脂提取液的体积， 投加0.9%的氯化钠溶液(加入体积为油脂提取液的1/5，约4-5mL氯化钠溶液），充分摇匀 lmin，并静置15min。测量低相溶液的体积，并取5mL低相溶液于IOmL玻璃试管中，用氮气吹 干，将玻璃管置于60°C烘箱中烘至恒重(约30min)。
[0040] 穴油脂僉畺彳+管.
[0041]
[0042]式中：LW-基于干重下的油脂含量，g/g
[0043] ml-藻粉干重，g
[0044] m2-带油脂的IOmL玻璃管干重，g
[0045] m0一IOmL玻璃管干重，g
[0046] V-低相油脂的体积，mL [0047] 3、油脂含量结果分析：
[0048]如图2所示，添加不同比例消化液的天然海水中的小双色藻SDEC-6的油脂含量均 明显高于在BGll中的油脂含量，这是由于海水中的盐度有利于刺激藻细胞中油脂的合成。 其中消化液的添加比例为1/40时小双色藻SDEC-6的油脂含量达到最高（50.13% )，是BGl 1 中油脂含量的1.72倍。当消化液的添加比例为1/30时小双色藻SDEC-6的油脂产率达到最高 (13.36mg/L/d)，是BGll中油脂产率的2.20倍。因此，由油脂积累数据可知，添加了餐厨垃圾 厌氧消化液的天然海水可以作为一种低成本的替代培养基培养小双色藻SDEC-6,所获得的 油脂远远高于在BGll和天然海水中的油脂含量。
[0049] 对比例《用生活污水稀释餐厨垃圾厌氧消化液培养色球藻的方法》（申请号 201610034390.3)中采用餐厨垃圾厌氧消化液为培养基主体，通过添加不同比例的生活污 水来培养色球藻，获得一定的生物质产率和油脂积累，结果表明，将餐厨垃圾厌氧消化液稀 释100倍时，其藻体的生物质产率(0.0258CT 1)和比生长速率（105.5mg/L/d)达到最大值，将 餐厨垃圾厌氧消化液稀释10倍时，油脂含量(38.65% )和油脂产率（11.79mg/L/d)达到最大 值。本发明采用天然海水为培养基主体，通过添加不同比例的餐厨垃圾厌氧消化液来培养 微藻，添加餐厨垃圾厌氧消化液比例为1/30时，其藻体的生物质产率(0.0260CT 1)和比生长 速率（180mg/L/d)达到最大值，添加餐厨垃圾厌氧消化液比例为1/40时，油脂含量 (50.13 % )达到最大值，添加餐厨垃圾厌氧消化液比例为1/30时，油脂产率（13.36mg/L/d) 达到最大值。经过比较得出，本发明采用的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微 藻的方法可以明显提高藻体的生物质产率、比生长速率以及油脂含量和油脂产率。而且天 然海水储存量极大，容易获取，降低了培养成本，同时有助于微藻产油的大规模商业化生 产。
[0050] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其特征为包括如下步 骤： (1) 将小双色藻SDEC-6置于BG11培养基中进行富集培养； (2) 配制混合培养基，所述混合培养基是由比例为1:10-1:50的餐厨垃圾厌氧消化液与 天然海水组成； (3) 将步骤（1)制得的藻细胞种子液接种到步骤(2)制得的混合培养基中，接种后的生 物质密度为0.06-0.07g/L; (4) 将步骤(3)制得的反应装置置于人工气候室中培养，培养条件为:温度25±?Γ，81μ mol photons/m2/s连续光照。2. 根据权利要求1所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其 特征在于，步骤(2)中的所述天然海水为通过抽滤去除过其中藻类的。3. 根据权利要求2所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其 特征在于，所述天然海水所用的抽滤滤膜为0.45μπι醋酸纤维酯滤膜。4. 根据权利要求3所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其 特征在于，所述天然海水中各营养物质和矿物质的浓度分别为4^1〇-5〇11^/1，順3-^1-10mg/L,TP:0.01-lmg/L,pH:8-10,Na:10000-15000mg/L,Mg:1000-1500mg/L,Ca:800-1000mg/L,K:200-500mg/L,Si:60-90mg/L〇5. 根据权利要求1所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其 特征在于，步骤(2)中的所述餐厨垃圾厌氧消化液为通过六层纱布过滤并离心的。6. 根据权利要求5所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其 特征在于，对所述餐厨垃圾厌氧消化液离心的速度为4500-6500r/min，持续时长为8-10min〇7. 根据权利要求6所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其 特征在于，所述的餐厨垃圾厌氧消化液的初始水质为：了12000-300011^/1，順34 :2000-3000mg/L，TP:10-50mg/L，COD:5000-8000mg/L，pH:8-10。8. 根据权利要求1所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液培养微藻的方法，其 特征在于，所述步骤(2)中所述混合培养基中的餐厨垃圾厌氧消化液的最佳添加比例为1: 20-1：40〇9. 根据权利要求1所述的向天然海水中添加餐厨垃圾厌氧消化液的方法，其特征在于， 所述步骤(4)的培养周期为12天。
【文档编号】C12N1/12GK105861312SQ201610323024
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】裴海燕, 张立杰, 胡文容, 蒋丽群, 韩飞, 成娟
【申请人】山东大学