一株控制柑橘和葡萄采后病害的盔形毕赤酵母的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株控制柑橘和葡萄采后病害的盔形毕赤酵母，属于水果采后病害生物防治领域。经鉴定为盔形毕赤酵母（Pichia manshurica），命名为Pichia manshurica Y4，保藏编号：CGMCC 2.5415。使用时将盔形毕赤酵母活化、培养，离心得到菌体，菌体用无菌水稀释制备成1.0×108个/mL的菌悬液。用喷壶喷洒至水果外表皮，再风干，放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。经该菌处理的柑橘绿霉病发病率及葡萄黑曲霉病、灰霉病发病率显著降低。因此，盔形毕赤酵母可以代替化学杀菌剂防治柑橘和葡萄的采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。CGMCC No. 2.541520160331
【专利说明】
一株控制柑橘和葡萄采后病害的盔形毕赤酵母
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一株蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4，该菌株可以控制柑橘采后绿霉病及匍甸米后黑曲霉病、灰霉病，属于水果米后病害生物防治领域。
【背景技术】
[0002]水果因采后腐烂造成的严重损失早已成为全球性问题，根据保守估计，在发达国家有10-20%的新鲜水果损失于采后的腐烂，而缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，其腐损率有的高达40-50%，我国的水果腐烂一般在20-30%。
[0003]我国是世界上最大的水果生产和销售大国，水果种类繁多，产量占世界水果产量的80%。由于水果生产地远离都市，而且成熟期又相对集中，因此在贮藏和运输期间由于腐烂、失水和营养流失等现象造成了大量采后损失。根据早前资料显示，我国每年水果腐烂超过8000万吨，因此造成的经济损失达750亿元，占整个产值的30 %以上，现在数值应该会更尚O
[0004]导致水果采后损失及品质恶化的因素有很多，包括由于水分和营养消耗造成的失重和枯萎等品质裂变；由于采后逆境造成的生理代谢失调；由于采后成熟衰老造成的水果组织结构的崩溃和由于病原物侵染造成的腐烂等。其中病原菌侵染造成的腐烂被认为是导致水果采后损失的主要原因。
[0005]引起水果贮藏期间腐烂的霉菌种类很多，但每种水果占优势的致病菌一般有2-3种。例如，(I)葡萄采后由真菌引起的病害主要为黑曲霉属(AspergilIus sp)引起的黑曲霉病及由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病，其中由葡萄灰霉菌(B.cinerea)引起的灰霉病是葡萄生产中危害最大的病害，全球年均造成减产20 %?40 %，严重的可达60 %以上。葡萄灰霉菌不仅会引起田间损失，而且残存在葡萄上的病原菌在贮藏期同样可以潜伏侵染，引起葡萄贮藏过程中的腐烂、脱粒及褐变，使贮藏期缩短，品质降低，是葡萄贮藏中的重要病原菌之一。(2)柑桔采后腐烂主要有以意大利青霉(Penici I Iium i tali cum)引起的青霉病和指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病，其中以指状青霉引起的腐烂尤为严重，此类病原菌分布广泛，以腐生在有机物上的方式，将所产生的大量分生孢子扩散在空气之中，从而扩散到果实上，引起果实腐烂，损失极大。水果采后病害发生的原因是非常复杂的，此外采前田间带病、采后机械损伤、贮藏温湿度条件管理不当造成的生理失调等都是促成发病的因素。
[0006]病原真菌对采后水果的危害不仅在于导致水果在导致水果大量腐烂损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生多种次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如葡萄上的两种主要致病菌曲霉属(Aspergillus sp)产生的赭曲霉毒素A(OTA)、灰葡萄孢(B.cinerea)产生的葡双醛霉素(botrydial)等。其中OTA具有多种毒性，尤其具有肾毒性，且有一定致畸、致癌、致突变性，被认为是巴尔干地方性肾病的主要因素之一，因此对动物和人体健康会造成很大的潜在危害。
[0007]长期以来，控制果蔬采后病害的主要措施是使用杀菌剂。根据最新数据统计，杀菌剂在农作物病害防治市场约占26%份额，2011年销售金额高达133亿美元。化学杀菌剂具有成本低、简单方便、作用机理明确、效果明显等优点。常用的控制水果采后病害的化学杀菌剂种类很多。如控制葡萄病害的化学杀菌剂主要有烯酰吗啉、多菌灵、科定、科佳、嘧霉胺、20%苯醚甲环唑水分散粒剂等。柑桔贮藏期间绿霉病的防治主要依靠化学药剂抑霉哇、噻菌灵、嘧菌酯、特克多、邻苯酚钠、仲丁胺以及苯并咪唑类杀菌剂等。
[0008]但过去十多年，公众和科学界对于食品和环境中农药(尤其杀菌剂)残毒问题的关注日益增加。杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有害于人类健康。美国国家科学院(NAS)的报道(1987)指出在用于食物的全部农药中，杀菌剂构成60%的致瘤危险。此外，高频率地使用单一种类的杀菌剂会使病原菌产生抗药性问题，使杀菌剂的防治效果大大降低。据早前美国加利福尼亚的调查，抑霉哇(Imaziall)作为苯并咪哇类、仲丁胺药物的换代产品，连续在柑橘上使用5年以后，已经出现了指状青霉的抗抑霉哇菌株。而且据国内调查，单独使用多菌灵多年的地区，指状青霉对其产生了严重的抗性，使柑橘腐烂率回升，同时抗药性菌株对甲基托布津、苯来特、涕必灵等三种苯并咪唑类杀菌剂具有交叉抗性。因此，在很多发达国家和地区，一些化学杀菌剂已经开始被限制使用，如，克菌丹(Captan)和苯菌灵(benomyl)等几种杀菌剂已经被美国环保机构所禁用。
[0009]从2001年，我国加入世贸组织后，国际之间水果贸易将日趋活跃，水果市场的竞争也会更加激烈，部分发达国家利用“绿色壁皇”为我国农产品(包括葡萄和柑橘)出口设置了重重障碍。因此，研究并利用更安全、更环保，能替代化学杀菌剂的物质或生物来防治果蔬采后病害，是果蔬采后贮藏保鲜的一个新的研究方向。当前国际上越来越重视用有益微生物进行水果采后病害生物防治的研究，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方向之一。，这些研究对减少果蔬产品中农药的残留、保护环境、人体健康和增加果蔬产品的经济效益，都具有深刻的意义。
[0010]近年来，生物防治已引起了世界各国的关注，拮抗微生物的应用被证明是一种行之有效的方法。其中酵母菌由于拮抗效果好、不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点成为研究热点。Chalitz等从梓檬表面分离得到一株汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)，对柑橘绿霉病、青霉病等有显著的防治效果。Torres等报道Pantoeaagglomerans对柑橘Penici 11 ium digitatum有很好的防治效果。Arras报道了 Candidafamata对柑橘绿霉病具有显著的防治效果，并探讨了其作用机制。目前部分拮抗菌已经商业化或者半商业化应用，主要包括嗜油假丝酵母Canida oleophi Ia，季也蒙假丝酵母Canida gui IIiermondi，季也蒙毕赤氏酵母Pichia guiIIiermondi和阿比达斯隐球酵母Cryptococcus albidus几种。产品主要集中在西方发达国家，如1995年美国首次开发应用于水果采后病害的生物防治系列产品B1Save 100、110和Aspire;随后，南非也研发通过了Avogreen和Yield Plus两种生防制剂，目前我国还没能实现生物防腐的商业化应用。主要原因是缺乏高效的生防菌株。
[0011]本发明中的盔形毕赤酵母被认为是最安全的酵母之一，研究证明，其能显著降低柑橘采后病害的发生，进而达到水果贮藏保鲜的目的。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供一株分离自葡萄园的能够高效控制柑橘采后绿霉病及葡萄采后黑曲霉病、灰霉病的蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4，可以广泛的用于柑橘和葡萄采后病害的生物防治，减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。
[0013]本发明采用的技术方案
[0014]本发明所提供的防治柑橘采后绿霉病以及葡萄采后灰霉病和黑曲霉病的酵母菌株是从江苏省镇江市句容的葡萄园中分离到的，在NYDA固体培养基平板上和麦芽汁液体培养基中28 °C培养，进行形态学观察;对该菌株的5.8S rDNA-1TS区序列分析，进行分子生物学鉴定，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0015]蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4，现保藏于位于中国的北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为:CGMCC N0.2.5415，保藏日期为2016年3月31日，建议的分类命名为蓝形毕赤酵母Pichia manshurica。
[0016]利用盔形毕赤酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜:将盔形毕赤酵母活化、发酵培养，离心得到菌体;将菌体用无菌水稀释制备成1.0 X 18CFlVmL的菌悬液;用喷壶喷洒至水果外表皮，再风干;放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温下存放。
[0017]本发明的优点:
[0018](I)本发明所使用的蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4为本实验室筛选，其措抗效力强，对人体无害。
[0019](2)本发明所使用的蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y^l]]菌谱广，可以控制葡萄和柑橘采后多种由致病菌导致的病害损失。
[°02°] (3)本发明所使用的蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4比先前相关专利中描述的拮抗菌生防效果好。
[0021 ] (4)本发明使用蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
[0022]通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
【附图说明】
[0023]图1为本发明盔形毕赤酵母的5.8SrDNA-1TS区序列进化关系图。
[0024]图2为盔形毕赤酵母对柑橘绿霉病的抑制效果。注:CK:无菌蒸馏水，即对照组;Pm:1 X 108cells/mL的蓝形毕赤酵母菌悬液。不同字母代表差异显著(P〈0.05)。
[0025]图3为盔形毕赤酵母对葡萄灰霉病和黑曲霉病的抑制效果。注:CK:无菌蒸馏水，即对照组;Pm:1 X 108cells/mL的蓝形毕赤酵母菌悬液。不同字母代表差异显著(P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0026]实施例1:蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4菌株微生物学特性如下:
[0027]1.形态学特征
[0028](I)NYDA培养基(牛肉膏0.8 %，酵母浸出物0.5 %，葡萄糖I %，琼脂2 %，121°C湿热灭菌20min)上28°C培养48h，菌落呈圆形、边缘光滑、较湿润、易挑起。细胞形态呈长椭圆形，单个分散。
[0029](2)在NYDB液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，芽殖。
[0030]2.分子生物学鉴定
[0031]对筛选菌株盔形毕赤酵母的5.8S rDNA-1TS区序列分析，在GenBank上检索，确定为蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图1。
[0032]将该酵母蓝形毕赤酵母(Pichia manshurica)Y4，现保藏于位于中国的北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为:CGMCC N0.2.5415，保藏日期为2016年3月31日，建议的分类命名为蓝形毕赤酵母Pichia manshurica。
[0033]实施例2:盔形毕赤酵母对柑橘绿霉病的控制效果
[0034]一)试验方案
[0035]供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致，表面无擦伤或机械损伤和病虫伤害。用无菌打孔器在水果赤道处打3个孔，柑橘的表面伤口为5mm(直径)X3mm(深)。每个伤口处等量加入30yL以下处理液:(I) I X 18ce 11 s/mL的盔形毕赤酵母菌悬液；(2)无菌蒸馈水。2h后，再向柑橘伤口处分别接种30yL I X 105spores/mL的指状青霉(P.digitatum)孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养(湿度95%)，置于室温(20°C)。每处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过若7天的培养，记录果实发病率，以此评价盔形毕赤酵母的抑菌效果。
[0036]发病率的计算公式如下:
[0037]发病率(%)=发病的果实/果实总数X 100%
[0038]二)试验结果
[0039]按照上述步骤试验，统计水果的腐烂率结果如下:
[0040]对柑橘绿霉病的抑制效果
[0041]如图2中所示，对照组果实的发病率约为99.6%，经盔形毕赤酵母处理的柑橘发病率为45.3 %。即柑橘人为接种指状青霉孢子悬浮液前应用盔形毕赤酵母，与对照相比，经盔形毕赤酵母处理的柑橘发病率显著低于对照(P〈0.05)，因此说明盔形毕赤酵母在20°C下能够有效控制由指状青霉造成的柑橘采后绿霉病。
[0042]实施例3:盔形毕赤酵母对葡萄灰霉病和黑曲霉病的控制效果
[0043]一)试验方案
[0044]将活化后酵母接种在装有50mLNYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，葡萄糖10g，蒸馏水100mL)的三角瓶中，28°C、180r/min摇床培养20h。取菌液8000r/min离心lOmin，弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为I X 18个/mL的菌悬液，对照组为无菌水。在果实腰部用打孔器打I个直径为3m(宽)X3mm(深)的孔，然后在每孔分别注15yL的以上浓度的酵母菌悬液，对照水果注入15yL无菌水。2h后，再向葡萄伤口处分别接种1yL IX105spores/mL的灰葡萄孢霉(B.cinerea)孢子悬浮液或5 X104spores/mL的黑曲霉(Aspergi I Ius niger)孢子悬浮液。瞭干后将果实装入塑料筐内，保鲜膜封口保持95 %的湿度，在室温下贮藏，5d后统计果实的发病腐烂率。每处理重复3次，每次重复36个果实。整个试验重复2次。
[0045]发病率的计算公式如下:
[0046]发病率(%)=发病的果实/果实总数X 100%
[0047]二)试验结果
[0048]按照上述步骤试验，统计水果的腐烂率结果如下:
[0049]1、对葡萄灰霉病的抑制效果
[0050]如图3中所示，对照组的发病率为94.4%，经盔形毕赤酵母处理的葡萄发病率为5.6%，因此盔形毕赤酵母在室温下能够有效控制由灰葡萄孢霉造成葡萄的采后灰霉病病害。
[0051]2、对葡萄黑曲霉病的抑制效果
[0052]如图3中所示，对照组的发病率为100%，经盔形毕赤酵母处理的葡萄发病率为
11.1%，因此盔形毕赤酵母在室温下能够有效控制由黑曲霉造成葡萄的采后黑曲霉病病害。
[0053]该结果明显比先前相关专利中描述的拮抗菌生防效果好，例如，中国发明专利《葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂》(申请号200910078858.9)公开了一种罗伦隐球酵母和硼酸钠结合使用防治葡萄病害的技术，经罗伦隐球酵母和硼酸钠处理后的葡萄在室温条件下放置三天后，因灰霉病导致的腐烂率仅比对照降低了 50%左右，且并未表明其对葡萄采后黑曲霉病有抑制作用；中国发明专利《解脂亚罗酵母、在葡萄采后病害防治中的应用及使用方法》(申请号CN201410231417.9)提供了一种解脂亚罗酵母防治葡萄采后病害和降解赭曲霉毒素A的技术，文中介绍了解脂亚罗酵母对葡萄岛青霉有显著的抑制效果，但未表明其对葡萄采后黑曲霉病和灰霉病有抑制作用。
[0054]实施例4:盔形毕赤酵母的保藏
[0055]首选培养基为NYDA培养基，也可以使用马铃薯琼脂培养基:马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15?20克，自来水1000毫升，pH 7.0?9.0，26°C?28°C，培养36h。
【主权项】
1.蓝形毕赤酵母Pichiamanshurica Y4，保藏编号为CGMCC N0.2.5415。2.权利要求书I所述的盔形毕赤酵母菌株的用途，其特征在于可以用其控制柑橘采后绿霉病及葡萄采后黑曲霉病、灰霉病，用于贮藏保鲜。3.权利要求1所述的盔形毕赤酵母进行柑橘和葡萄采后病害防治及贮藏保鲜方法:将盔形毕赤酵母活化，用NYDB培养基培养盔形毕赤酵母，离心得到菌体，用无菌水稀释制备成I X 18 cells/mL的菌悬液;将菌悬液均匀喷洒在水果上，自然风干;放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。4.根据权利要求2所述的盔形毕赤酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的NYDB培养基为:酵母膏5 g，葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，蒸馈水1000 ml，pH自然，.121 °C 灭菌 30min。
【文档编号】C12R1/84GK105861340SQ201610225320
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】张红印, 李万海, 张晓云, 任晓锋, 朱淑云
【申请人】江苏大学