预防鸡坏死性肠炎的植物乳杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种植物乳杆菌Lac16，其保藏名称为Lactobacillus plantarum Lac16，保藏号为：CCTCC NO：M 2016259。其能预防鸡坏死性肠炎的发生；抑制产气荚膜梭菌生长，从而缓解产气荚膜梭菌攻毒后对肉鸡生产性能下降、缓解肠粘膜结构损伤的影响；还能提高鸡巨噬细胞免疫功能，能促进肉鸡生长。CCTCC NO： M 201625920160511
【专利说明】
预防鸡坏死性肠炎的植物乳杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种有抑制产气荚膜梭菌效果的植物乳杆菌的筛选及其应用。
【背景技术】
[0002] 坏死性肠炎(Necrotic enteritis，NE)主要是由A型或C型革兰氏阳性厌氧菌产气 荚膜梭菌致病引起的禽类急性肠道传染病，是家禽养殖业中危害最大的肠道疾病之一。坏 死性肠炎首次报道于英国（Parish et al, 1961)，随后被全球各国相继报道。鸡坏死性肠炎 的发生主要以肠道严重出血、肠道黏膜损伤、溃疡、坏死等为主要特征（Guo S et al， 2015)，该病一年四季均可发生，尤以炎热多雨的夏季多发，多发生于2~6周龄肉鸡、3~6月 龄的商品蛋鸡(Cooper KK et al. ,2013,2010)。急性型鸡坏死性肠炎的发生可导致鸡群突 然大量死亡，病理解剖后可发现肠道粘膜有大量弥漫性坏死灶;慢性型鸡坏死性肠炎不易 被鉴别，虽然不会导致鸡群突然死亡，但会导致鸡只食欲降低、肠道消化吸收功能下降、饲 料转化效率降低、体重下降，从而导致鸡群生长受阻等，这种慢性型鸡坏死性肠炎给家禽养 殖业造成的经济损失更大(Savva CG et al.，2013)。数十年来低剂量抗生素作为生长促进 剂(AGPs)-直被广泛应用于动物养殖生产中（Van et al.，2009;Pattison et al. ,2002; Vigre et al .,2008;Der Sluis et al .,2000)，同时作为抗菌药物又控制着多种禽类细菌 性疾病的发生。但是，随着一系列抗生素的负面影响被报道后，许多国家已逐渐降低或明令 禁止使用抗生素作为饲料添加剂应用于动物养殖生产中（Wade et al.，2015 ;Uzal FA et al .,2014; Shimizu et al .,2002 ;Myers et al .,2006)，其结果是导致许多如坏死性肠炎 等肠道性疾病大范围、流行性的发生（Si W et al.，2007;Nauerby et al.，2003;Pedersen et al.，2003)。据报道，抗生素被禁止作为AGPs应用于家禽养殖生产后，鸡坏死性肠炎的发 病急剧上升。目前，由坏死性肠炎造成的全球家禽养殖业的经济损失已由2000年的20亿美 元上升至2015年的60亿美元（Naylor et al.，1998;Nagahama et al.，2002)，坏死性肠炎 已成为全球畜禽业养殖中最重要的经济疾病之一，严重阻碍了家禽业的健康发展，同时也 危害着人类健康。因此，通过非抗生素的方法防治鸡坏死性肠炎越来越受到人们的关注。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种预防鸡坏死性肠炎的植物乳杆菌及其应用； 该植物乳杆菌可抑制产气荚膜梭菌生长、提高鸡巨噬细胞免疫功能，并可缓解产气荚膜梭 菌攻毒后对肉鸡生产性能下降和肠粘膜结构损伤的影响，预防鸡坏死性肠炎的发生。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明一种植物乳杆菌Lacl6,其保藏名称为:植物乳杆 菌Lacl6Lactobacillus plantarum Lacl6,其保藏号为：CCTCC Ν0:Μ 2016259。
[0005] 本发明还同时提供了上述植物乳杆菌Lacl6的用途:预防鸡坏死性肠炎的发生。
[0006] 作为本发明的植物乳杆菌Lacl6的用途的改进:植物乳杆菌抑制产气荚膜梭菌生 长，从而缓解产气荚膜梭菌攻毒后对肉鸡生产性能下降和肠粘膜结构损伤的影响。
[0007] 作为本发明的植物乳杆菌Lacl6的用途的进一步改进:植物乳杆菌能提高鸡巨噬 细胞免疫功能。
[0008]作为本发明的植物乳杆菌Lacie的用途的进一步改进:促进肉鸡生长。
[0009 ]本发明以Lac 16菌株总DNA为模板，使用通用引物：
[0010] 上游引物（Pl) :5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'
[0011] 下游引物(P6) :5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'。
[0012] 进行PCR扩增获得1510bp的16s rDNA部分序列。通过Blast与GenBank收录的细菌 16s rDNA基因序列比对，发现Lacl6菌株与植物乳杆菌的同源性为99%。
[0013] 本发明植物乳杆菌Lacl6的用途:抑制产气荚膜梭菌生长、有效预防鸡坏死性肠炎 的发生，并促进肉鸡生长。
【附图说明】
[0014] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0015] 图1为待筛选乳杆菌对Cp抑菌试验；
[0016] 图2为植物乳杆菌Lacl6菌落形态；
[0017]图3为植物乳杆菌Lacl6对鸡巨噬细胞HDll炎症相关基因及iNOS基因表达的影响； [0018]图4为植物乳杆菌Lacl6对Cp攻毒后肉鸡回肠绒毛粘膜结构影响；
[0019]图5为植物乳杆菌Lacl6对Cp攻毒后肉鸡回肠微绒毛结构影响；
[0020]左图为回肠微绒毛整齐度（5μπ0;右图为回肠肠道屏障（1\^8、0);1\1:紧密连接； AB:粘合带;D:桥粒。
【具体实施方式】
[0021 ]实施例1、植物乳杆菌Lacl6的获得 [0022]丨、制备稀释液：
[0023]取杭州郊区某菜地土壤1克加入90mL无菌水中，再用无菌水稀释为ΠΛΙΟ'ΙΟ一2， 10-3、10-4、10-5、10-6共七个浓度梯度。
[0024] 2、培养：
[0025]取各浓度的稀释液IOOul分别涂布于MRS固体培养基（蛋白胨10g/L，酵母浸出物 5g/L，牛肉膏10g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰 0 · 2g/L，吐温80 1 · 0mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，其余为双蒸水;pH值用冰乙酸调至6 · 2 ~6.6，121°C灭菌20分钟)平板，灭菌玻璃棒涂布后倒置放在35 °C恒温箱内培养。
[0026] 3、菌株的分离、纯化：
[0027]在MRS培养基于35°C培养48h，即有单菌落出现。用接种针挑取单个菌落，在MRS培 养基(配方如上）平板表面连续划线培养，选择那些形态不一样的菌落，重复几次后便可形 成单独孤立的菌落，因而获得6株纯培养乳酸菌。
[0028] 4、不同时间抑菌效果测定：
[0029]将6株菌落活化后分别置于50mL MRS液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L， 牛肉膏10g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.2g/L， 吐温80 1.0mL/L，葡萄糖20g/L，其余为双蒸水;pH值用冰乙酸调至6.2~6.6，121°C灭菌20 分钟）中培养，初始接种浓度为I .OX IO6CFUAiL，24h后调整各菌液至1.0 X IO9CFUAiL备用。
[0030] 含l%(w/v)葡萄糖的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂 20g/L，其余为双蒸水，pH值用5mol/L NaOH溶液调至7.2~7.4)平板高温灭菌（121°(：灭菌20 分钟）后，冷却至40~50 °C后，按照1 % (v/v)的接种量加入致病性A型产气荚膜梭菌菌液(培 养15h的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens CVCC2030，Cp))，倒平板，放置无菌室约 lh，倒置放于4°C冰箱中lh，将牛津杯（内径6mm、外径8mm)放置在平板表面，然后按照每孔 200μ1的加样量加入被筛选菌株菌液，在35 °C培养箱培养，每隔3h取样，测定24h内的抑菌圈 直径变化，每个平皿设3个重复。挑选出产气荚膜梭菌抑制效果最佳的菌落，命名为Lacl6。 Lac 16对产气荚膜梭菌抑制效果最为明显（图1 )，24h抑菌环平均直径为15.58mm。
[0031] 5、菌种鉴定：
[0032] (1)形态特征
[0033 ]在液体培养基中呈均匀混浊并伴有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开。在MRS琼脂平 板上Lacl6菌落很小，为0.5mm左右，菌落呈点状凸起，呈圆形，表面光滑，细密，乳白色，图2 为植物乳杆菌Lac 16的菌落形态。
[0034] (2)16S rRNA序列分析
[0035] 对分离筛选到的菌株Lacl6进行进一步的16S rRNA序列分析与比对。根据细菌16S rDNA的保守序列设计一对引物并由上海生工合成：
[0036] 上游引物（Pl) :5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'
[0037] 下游引物（P6) :5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'。
[0038]以筛选得到的菌株为模板进行PCR扩增。反应条件：95°C预变性5min，94°C变性 50s，52°C退火lmin，72°C延伸Imin 30s，反应30个循环。
[0039]目的片断按照常规方法(5&111131'〇〇1^，6七31.，2001)进行克隆和序列测定，测定结果 与GenBank中所登录的16S rRNA序列（登录号：NC_004567、NC_012984和NC_020229等）进行 比对分析，基因同源性达到99%以上。根据《Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology》(Holt，et al. ,1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)，通过形 态特征和16S rRNA序列分析，确定菌株Lacl6为植物乳杆菌。
[0040] 将其进行保藏，保藏名称为:植物乳杆菌1^〇161^〇1：(^3〇;[11118口1311丨31'11111]^1(316， 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学;保藏日期：2016年5月 11 日，保藏号：CCTCC Ν0:Μ 2016259。
[00411按1 % (v/v)的比例将保藏并活化的植物乳杆菌Lacl6接种于50mL MRS液体培养基 中，35°C培养24小时后，获得含108cfu/mL的植物乳杆菌Lacl6培养液。
[0042] 将上述植物乳杆菌Lacl6培养液于90°C处理30min，得灭活植物乳杆菌Lacl6。
[0043]实施例2、植物乳杆菌Lacl6对鸡巨噬细胞系HDll免疫功能的影响 [0044] 鸡巨噬细胞系HDll按浓度5X IO5个/mL接种至12孔细胞培养板，每孔ImL F12完全 培养基(88%F12基础培养基+10%鸡血清+1 %青链霉素+1 %非必需氨基酸（IOOx))，设置对 照组、Lac 16组、Cp组(产气荚膜梭菌)和Lac 16+Cp组;具体为：
[0045] 对照组:不添加灭活乳酸菌处理，只用F12完全培养基分别培养3、6、12小时后弃去 培养液，用室温灭菌PBS洗涤3次后，添加 Fl 2完全培养基继续培养3h后收样。
[0046] Lacl6组：添加 Iml含108cfu/mL灭活植物乳杆菌Lacl6的F12完全培养基分别处理 3h、6h和12h后收样；
[0047] Cp组(产气荚膜梭菌）：不添加灭活乳酸菌处理，只用F12完全培养基分别培养3、6、 12小时后弃去培养液，用室温灭菌I 3BS洗涤3次后添加 Iml含108cfu/mL产气荚膜梭菌活菌的 F12完全培养基处理3h后收样；
[0048] Lacl6+Cp组：添加108cfu/mL灭活植物乳杆菌Lacl6分别处理3h、6h和12h后，弃培 养液，室温灭菌I 3BS洗涤3次后添加 Iml含108cfu/mL产气荚膜梭菌活菌的F12完全培养基处 理3h后收样；
[0049]每组3个重复孔，41°C、5%⑶2培养6h至细胞贴壁。之后弃去F12完全培养基，灭菌 PBS洗涤3次后各加 ImL F12完全培养基:对照组和Cp组不添加乳酸菌处理，Lacl6组和Lacl6 +Cp组添加108cfu/mL灭活植物乳杆菌Lacl6,分别预处理3h、6h、12h后将培养基去掉，灭菌 PBS洗涤3次后各加 ImL F12完全培养基，Cp组和Lacl6+Cp组添加108cfu/mL产气荚膜梭菌活 菌处理3h后收集细胞，（修改），进行总RNA提取、反转录和qPCR，检测细胞因子（儿-6、1?1 γ、IL-lO、TGF-0)和iNOS基因的表达情况。
[0050] 与对照处理相比，如图3所示，灭活植物乳杆菌Lacl6可上调细胞因子11^-6、1?1 γ、IL-10、TGF-f3和iNOS基因表达(P〈0.05)，产气荚膜梭菌可提高IFN-γ的基因表达(P〈 0.05)，抑制iNOS的基因表达(P〈0.05)。与Cp组相比，用乳杆菌Lacl6预处理后再加 Cp后显著 降低IFN-γ的基因表达，提高IL-10和TGF-β及iNOS的基因表达(P〈0.05)，提示植物乳杆菌 Lacl6可显著提高鸡巨噬细胞系HDll的免疫功能，缓解Cp感染引起的促炎反应，并提高抗炎 功能，增强对CP的清除能力，保护细胞。
[0051 ]实施例3、植物乳杆菌Lacl6菌剂的制备方法：
[0052]按1 % (v/v)的比例将植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，35°C培养24小时后，4 °C、5000rpm/min离心，取菌沉淀，50°C恒温干燥6~8小时，与玉米淀粉按4:1 (w:w)混合而制 成干菌粉，每克菌粉活菌数为1.0 X IO8Cfu。
[0053] 实施例4、植物乳杆菌Lacl6促进肉鸡生长
[0054]科宝500肉鸡购自浙江大学正大肉鸡发展中心，试验地点为浙江杭州市蛋鸡试验 场。采取单因子设计方案:试验选取1日龄健康且体重无显著差异(P>〇.05)的健康科宝500 肉鸡315羽，随机分为3个试验组，每个试验组6个重复，每个重复35羽。Control组和Cp组只 饲喂基础饲粮，Lac+Cp组在基础饲粮的基础上添加植物乳杆菌Lacl6制剂I OOOmg/kgXp组 和Lac+Cp组在14~20日龄期间连续7天口服A型产气荚膜梭菌（1.0 ml/只/天，108cfu/mL)建 立诱导坏死性肠炎模型。试验期为21天。试验21d后进行相应的检测，具体如下所述。
[0055]表1、植物乳杆菌Lacl6对Cp攻毒后肉鸡生产性能的影响
[0057]同列肩注不同字母者表示差异显著0〈〇.〇5)(11 = 6)，反之差异不显著(？>〇.〇5)。 下同。
[0058] 由表1可知，Cp组肉鸡平均体重低于Control组和Lacl6+Cp(P〈0.05)，平均日增重 和饲料转化效率均低于Control组(PM).05) lacie+Cp组肉鸡平均体重、平均日增重、平均 日采食量和饲料转化效率与对照组相似，均高于Cp组(P>0.05)，提示所添加的植物乳杆菌 Lacl6制剂有助于缓解Cp攻毒后对肉鸡生产性能下降的影响。
[0059]表2、植物乳杆菌Lac 16对Cp攻毒后肉鸡器官指数的影响
[0061 ] 如表2可知，Cp组肉鸡脾脏指数高于Control组和Lac+Cp组(P>0.05)，Lac+Cp组肉 鸡脾脏指数与Control组相近；Cp组肉鸡法氏囊指数显著高于Control组和Lac+Cp组(P〈 0.05)，Lac+Cp组法氏囊指数低于Control组(P>0.05)。上述结果提不，植物乳杆菌Lac 16有 助于减轻Cp感染引起的肉鸡免疫器官的肿大。
[0062]实施例5、植物乳杆菌Lacl6预防肉鸡坏死性肠炎的发生 [0063] Control组、Cp组、Lac+Cp组的设置方式同实施例4。试验21d后进行相应的检测。 [0064]如图4可发现，Control组肉鸡回肠绒毛排列规则有序、表面正常、无损伤;Cp组肉 鸡回肠绒毛变短、排列稀疏、结构破坏、表面损伤严重（图中，箭头所指代表回肠损伤）； Lacl6+Cp组肉鸡回肠绒毛排列规则、绒毛变粗、表面无明显损伤。上述结果提示，植物乳杆 菌Lacl6可有效减轻Cp感染引起的肉鸡回肠绒毛的损伤。
[0065] 如图5可发现，Contro 1组和Lac 16+Cp组肉鸡回肠微绒毛排列整齐、紧密，Lac 16+Cp 组回肠微绒毛变长，而Cp组肉鸡回肠微绒毛稀疏，微绒毛长短不一（左图）。与Control组相 比，Cp组肉鸡回肠紧密连接(TJ)、粘合带(AB)变短、变淡，细胞间紧密连接出现缝隙，粘合带 间隙变宽，桥粒(D)变淡、间隙变宽；与Contro 1组和Cp组相比，Lac 16+Cp组肉鸡回肠紧密连 接(TJ )、粘合带(AB)变长、变粗，细胞间紧密连接无缝隙，粘合带间隙充满物质、桥粒(D)变 粗(右图）。上述结果提示，植物乳杆菌Lacl6可大幅度减轻Cp感染引起的肉鸡回肠微绒毛损 伤、并增强细胞间连接(紧密连接、粘合带、桥粒等）。
[0066] 对比实验、将以下植物乳杆菌(表3)按照实施例1所述方法进行抑菌效果测定的实 验。所得结果如表3所述。
[0067] 表3、不同乳酸菌对产气荚膜梭菌抑制效果
[0069]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 植物乳杆菌Lacl6,其特征是，保藏名称为：植物乳杆菌Lacl6Lactobacillus plantarum Lacl6,其保藏号为：CCTCC NO:M 2016259。2. 如权利要求1所述的植物乳杆菌Lacl6的用途，其特征是:预防鸡坏死性肠炎的发生。3. 如权利要求1所述的植物乳杆菌Lacl6的用途，其特征是:抑制产气荚膜梭菌生长。4. 根据权利要求3所述的植物乳杆菌Lacl6的用途，其特征是：缓解产气荚膜梭菌攻毒 后对肉鸡生产性能下降、缓解肠粘膜结构损伤的影响。5. 如权利要求1所述的植物乳杆菌Lacl6的用途，其特征是:提高鸡巨噬细胞免疫功能。6. 如权利要求1所述的植物乳杆菌Lacl6的用途，其特征是:促进肉鸡生长。
【文档编号】A61P1/00GK105861399SQ201610431406
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】李卫芬, 王佰魁, 俞国乔, 吴艳萍, 毛予龙, 黄怡, 付爱坤, 王阳, 王冰, 王一冰
【申请人】浙江大学