猴病毒40衣壳蛋白vp1组装的病毒样颗粒在介导微米颗粒进入细胞中的应用
【专利摘要】本发明公开了猴病毒40衣壳蛋白VP1组装的病毒样颗粒在介导微米颗粒进入细胞中的应用。通过化学修饰使猴病毒40衣壳蛋白VP1组装的病毒样颗粒与无机微米颗粒结合，使其将微米颗粒包覆，可将微米颗粒带入哺乳动物细胞内，实现无机微米颗粒的细胞递送。通过包装不同功能的纳米颗粒，结合不同性质的微米颗粒，建立了一种将微米颗粒导入细胞的方法，并实现了多层级、多功能的纳米构架。在疾病的靶向诊断、靶向运输、高容量药物运载、热疗等方面有潜在应用价值。
【专利说明】
猴病毒40衣壳蛋白VP1组装的病毒样颗粒在介导微米颗粒 进入细胞中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞转导技术领域，更具体涉及猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样 颗粒在介导微米颗粒进入细胞中的应用。
【背景技术】
[0002] 生物纳米颗粒既具有纳米尺寸和结构特性，又具有独特的生物活性功能，在纳米 技术应用方面具有极大的潜力。目前大多数的纳米研究还集中在人造化学纳米结构上，较 少利用天然的生物纳米结构，而生物纳米颗粒具有生产方便，结构均一，生物相容性强等优 点，很适合用于生命健康医药方面。例如病毒作为天然的纳米级生物，具有规则均一的结构 和独特的生物学效应。一些病毒的衣壳蛋白可以自组装成的空心颗粒，不具有病毒核酸，不 能复制，而形态与天然病毒类似。这种笼型颗粒可以作为载体包装各种外源颗粒，包括有机 颗粒，无机颗粒以及小分子，从而作为载体系统运输"货物"到细胞或者活体内。
[0003] 病毒衣壳是通过很多相同蛋白形成的规则层级结构。基于病毒的纳米材料是纳米 科学的一个令人兴奋的研究领域，目前已经成为材料科学、生物化学、病毒物理化学的交叉 研究热点。这类纳米材料的关键要素就是基于病毒蛋白衣壳（外壳）和有机或无机货物的 自组装或可控组装，获得功能化的病毒纳米颗粒（VNP)。VNP可以携带聚合物，酶和其他的 有机货物，同样也可以包裹金属离子。无机颗粒装载在病毒衣壳的纳米材料设计有两条可 行策略：1，无机颗粒包装在衣壳的内部；2,无机材料结合在病毒衣壳的外面。这两种情况 都是衣壳的内部或外部，或者病毒蛋白的某一部分直接形成，包装或者结合无机货物。顺 延噬菌体的研究，也探索了包装无机货物的植物和动物病毒VNP的形成。植物病毒中包括 BMV，CPMV，TMV，CCMV，RCNMV，除了棒状的TMV，其他病毒都是正二十面体结构。而动物病毒 中包装过无机货物的有SV40, Alphavirus和HIV-I等。
[0004] 从材料科学的观点来看，病毒衣壳在VNP中可以扮演不同的角色。如果无机颗粒 在病毒衣壳的外面形成，病毒衣壳做为模版或者脚手架装饰上无机纳米颗粒，则可以获得 表面携带无机材料的中空的胶囊结构，管状结构等。如果一个无机颗粒在病毒衣壳中成核， 病毒衣壳可以作为一个纳米反应器，其内壁可以促进、催化、控制纳米颗粒的生长。第三种 可能认为当病毒衣壳围绕无机纳米颗粒自组装形成时，由于纳米颗粒的成核作用而使得病 毒衣壳自组装。VNP有多种，而我们重点关注VNP作为无机纳米颗粒的细胞运输载体及其 在成像、药物递送、热疗和纳米材料设计等生物医学的广泛应用前景。例如，生物成像是基 于无机颗粒VNP最有希望的应用之一。在体外实验中VNP包装或者结合纳米金能够被可视 化示踪。而VNP包装或者结合量子点则可以通过荧光观察用于体外或体内实验。此外，在 CPMV外部结合量子点的复合物，量子点的局部浓度很高，并且和溶液中游离的量子点比，荧 光量子产率提高了 15%。大量氧化铁纳米颗粒结合在CPMV表面拥有加强的局部磁场强度， 有希望用于磁共振成像。但是上述大部分例子的还没有被完全得证明。病毒颗粒可用于药 物递送，许多装载有机货物的VLP和VNP都已经成功用于药物递送的体外和体内应用，而无 机货物还只是刚刚被考虑到。在包装无机颗粒中，我们可以将药物分子吸附在功能化修饰 (特别是两亲分子）的纳米颗粒表面，并且在VNP解聚的时候释放出来。无机颗粒可以同时 成像和磁性装载。当无机颗粒结合在病毒衣壳外表面时，VNP的内部则可以装载药物分子， 但是目前为止这样的实验还未报道。在肿瘤热疗方面，各种外壳包装磁性纳米颗粒已经越 来越多得被研究了，既可以输送磁性纳米颗粒，也可以根据有机外壳性质来控制其治疗的 响应。
[0005] 病毒衣壳的完美外表面可以促进特异性分子的结合，这可以使其特异性靶向某些 癌细胞，就可以使用包装磁性颗粒的VNP用于热疗。当然，病毒颗粒还可用于构建新型的纳 米器件材料。如将单分散包装纳米金、氧化钴等的VNP自组装到介电特异材料中，制造可以 提高电池容量的金-氧化钴杂合纳米线，制备性能极为优异的纳米电极或电池。
[0006] 细胞膜可允许小分子通过，细胞吸收营养以及和微环境间的所有通讯利用多样的 机制发生在穿透细胞膜的过程中。氧气，二氧化碳，水和小的疏水或非极性分子能够通过浓 度梯度差自由扩散通过细胞膜。如离子，氨基酸等小分子通过膜蛋白栗或离子通道等主动 转运系统通过细胞膜。而纳米级亲水生物大分子通常依靠内吞作用进入细胞，这种方式利 用来源于细胞膜的运输囊泡将货物内化进细胞。对于纳米颗粒的细胞摄入及机制已经有了 比较多的研究。例如设计的纳米颗粒，比如金属簇，碳纳米管，富勒烯和量子点，能够穿透细 胞膜，并且能够进入内皮细胞，肺上皮细胞，肠上皮细胞，肺泡巨噬细胞，其他的巨噬细胞和 神经元细胞等各种细胞。然而，不同实验室对于细胞摄入纳米颗粒所提出的机制有时是不 一致的，甚至完全冲突的。而且，每种纳米颗粒都表现出对于不同细胞内化途径的偏爱。对 纳米颗粒在细胞中的摄入和运输的系统化理解因此变为最重要的事情。
[0007] 纳米颗粒的大小和形状也是支配他们特性的关键参数，所以也决定了细胞摄入的 过程。例如，HeLa细胞摄入纳米金是随着纳米金尺寸的改变而改变的。内化赫塞汀修饰的 纳米金（从2nm到IOOnm)很大程度上决定于其尺寸：内吞最有效率的尺寸范围是25-50nm， 这是在受体介导的内吞过程中，由于膜受体和膜包装过程的多价交联之间的定向平衡而导 致的。细胞内体聚集被发现可以增强其磁性能力，并且具有更好的磁共振成像对比度。纳 米颗粒的形状是另外一个重要的因素，它直接影响摄入的途径。还是用金纳米颗粒来举例， 有实验研究了金纳米棒（NRs)的几何形状方面对于细胞摄入的影响，发现NRs的几何形状 对于细胞摄入有极大的影响：具有相同表面电荷的短纳米棒比长纳米棒更容易进细胞。尺 寸相同的球形纳米颗粒比棒状纳米颗粒更容易进细胞，可能是棒状纳米颗粒需要更长的膜 弯曲时间。
[0008] 氧化铁颗粒可用于磁共振成像、肿瘤热疗等，是一种很有前景的功能材料。按粒 径大小，氧化铁颗粒大致可以分为超顺磁性氧化铁颗粒（superparamagnetic iron oxide， SPIO)、超小型超顺磁性氧化铁颗粒（ultra-small superparamagneticironoxide, USPIO) 和单晶体氧化铁纳米颗粒（monocrystalline ironoxide nanoparticles。MI0N)。2004年， Shapiro等发现微米量级的超顺磁性氧化铁颗粒（micron-sizedsuperparamagnetic iron oxide，MPI0)，可以标记细胞，产生更强的信号对比，达到单个细胞的示踪成像，这引起了众 多科学家的研究兴趣。近年来，基于MPIO的研究及应用获得了显著的成果与突破。但因为 微米量级的超顺磁性氧化铁颗粒MPIO粒子大，包衣惰性强，更加难以导入细胞。MPIO与一 些转染介质结合进入细胞，但效率很低，而且所用转染介质可能会抑制细胞的增殖分化。而 病毒衣壳作为导入载体，有望成为一种新的高效、安全的转导方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供了猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒在介导无机 微米颗粒进入细胞中的应用。通过化学修饰使猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒 与无机微米颗粒结合，使其将微米颗粒包覆，可将微米颗粒带入哺乳动物细胞内，实现无机 微米颗粒的细胞递送。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0011] 猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒在介导微米颗粒进入细胞中的应用，应 用过程如下：
[0012] 1)通过化学修饰使猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒与无机微米颗粒结 合，使其将微米颗粒包覆，获得复合微米颗粒。
[0013] 2)将步骤1)获得的复合微米颗粒与哺乳动物细胞孵育，微米颗粒即可由病毒样 颗粒介导进入细胞。
[0014] 所述的猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒，可利用本领域的已知方法或参 考文献（Small，2009, 5(6) :718-726)以获得猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒，该 病毒样颗粒可根据需要包装量子点或纳米金等本领域的常规示踪颗粒。
[0015] 根据上述应用，利用猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒在介导微米量级磁 性氧化铁颗粒MPIO进入细胞中的应用，具体如下：
[0016] (1)、构建VPl蛋白的表达质粒（PET-VPl)，大肠杆菌（E. coli Rosetta)表达、纯化 VPl，通过电子显微镜表征其五聚体形态。
[0017] (2)、在VPl蛋白包装量子点，再通过蔗糖密度梯度进行纯化，取得包装量子点的 病毒样颗粒（SVQDs)，通过电子显微镜进行表征。
[0018] (3)、将SVQDs与生物素化试剂进行混合，去除多余未结合的生物素，得到 Biotin-SVQDs。将链霉亲和素修饰的MPIO与Biotin-SVQDs混合，通过磁力架纯化出被 SVQDs 包裹的磁珠（MPIOs-VLP-QDs)。
[0019] (4)通过荧光显微系统观察拍照，得到单颗粒显微图像。
[0020] (5)将MPIOs-VLP-QDs与培养好的Vero细胞冰上混合孵育，清洗掉多余的 MPIOs-VLP-QDs，再放入培养箱继续培养。
[0021] (6)分别通过荧光显微镜观察MPIOs-VLP-QDs 4度孵育细胞不同时间颗粒定位。
[0022] (7)在培养皿外放置一个磁铁继续培养，使用荧光显微镜观察MPIOs-VLP-QDs在 细胞中的定位，同时"侵染的细胞用胰酶消化悬浮后，观察磁场对细胞运动方向的控制。
[0023] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0024] 本发明利用猴病毒40的主要衣壳蛋白VPl自组装系统，包装量子点，进而通过生 物素与链霉亲和素相互作用，将病毒衣壳自组装颗粒包裹结合在磁性微米颗粒表面，通过 病毒衣壳进细胞的能力将微米级颗粒带入哺乳动物细胞，从而发展出一种能够携带微米颗 粒入哺乳动物细胞的方法。病毒衣壳蛋白本身具有良好的生物相容性，容易降解。其衣壳 内能够包裹无机纳米颗粒，衣壳上可以通过化学或遗传修饰生物功能分子，再对功能微米 颗粒进行装载，就可构建多层级，多功能的微米功能颗粒，在疾病的革G向诊断、革El向运输、高 容量药物运载、热疗等方面有潜在应用价值。
[0025] 该系统不但能够自身装载纳米颗粒，而且能够与微米颗粒结合并输送进入哺乳动 物细胞。进入细胞后的磁性微米颗粒还能通过外磁场对其进行控制，包括控制细胞内磁性 颗粒的排列，以及悬浮细胞的运动方向。该方法是一种生物相容性好、多层级、多功能化的 颗粒导入系统。
【附图说明】
[0026] 图IVPl蛋白及其五聚体示意图。
[0027] 其中a为VPl蛋白SDS-PAGE电泳图，b为VPl蛋白western blot鉴定图，c为VPl 五聚体电镜示意图。
[0028] 图2为SVQDs电镜示意图。
[0029] 图 3 为 MPIOs-VLP-QDs 示意图。
[0030] 其中a为MPIOs-VLP-QDs模拟示意图，b为MPIOs-VLP-QDs荧光显微镜示意图。
[0031] 图4为MPIOs-VLP-QDs与细胞孵育不同时间后的荧光定位示意图。
[0032] 其中a为MPIOs-VLP-QDs与细胞孵育0小时时的荧光定位图，b为与细胞孵育16 小时后的荧光定位图。
[0033] 图5为外加磁场控制细胞内MPIOs-VLP-QDs颗粒排列方向的荧光图。
[0034] 图6为外加磁场控制内涵MPIOs-VLP-QDs颗粒的悬浮细胞运动方向的荧光图。
【具体实施方式】
[0035] 本发明实施例以猴病毒40衣壳蛋白VPl组装的病毒样颗粒介导MPIO进入细胞为 例，进一步进行说明其操作过程，但本发明的范围不限于下述实施例。本发明所述技术方 案，如未特备说明，均为本领域的常规方案。
[0036] 实施例1 :
[0037] 包装量子点病毒样颗粒制备
[0038] (1)、构建VPl蛋白的表达质粒（PET-VPl)，大肠杆菌（E. coli Rosetta)表达、纯化 VPl，通过电子显微镜表征其五聚体形态。
[0039] 以 pSV21SphI-Nl(J Virol Methods, 1997,64(1) : 1-9)为模板扩增 VPl， BglII-XhoI双酶切后，连入BamHI-SalI双酶切的pQE-30载体（Qiagen公司购买），构建成 PQEVPl ;以pQEVPl为模板，扩增N端融合有Histag的VPl编码基因，通过NdeI-XhoI位点 插入pET32a(+)载体（载体含两个NdeI位点，NdeI充分酶切），构建成pET32a-hisVPl。所 有酶切和PCR操作步骤均按相关产品说明书进行。pQEVPl和pET32a-hisVPl都经测序确定 目的基因序列的正确性。
[0040] 将pET32a_hisVPl用0&(：12法转化入E. coli Rosetta(DE3)感受态细胞，从平板上 挑取单克隆接入5mL LB试管培养基中，加入氨苄青霉素和氯霉素，于37°C恒温、200r/min 培养过夜。次日，按1 %接种量转接于5mL LB试管培养基中（平行4管），加入相应的抗生 素，于37°C恒温、200r/min振荡培养至0D600在0. 4~0. 6之间，其中1管作为空白对照， 另外3管均加 IPTG至终浓度ImM，分别在20°C、25°C和37°C继续诱导培养16h、8h和3h后， 收集菌体，用SDS-PAGE检测VPl的表达情况，发现三个温度下VPl均能表达，且有包涵体产 生，选择25°C作为大量制备蛋白时的诱导温度。
[0041] 将 E.coli Rosetta(DE3) (pET32a-hisVPl)接种于 5mL LB 试管培养基中，加入氨 苄青霉素和氯霉素，于37°C恒温、200r/min培养过夜。次日，转接入500mL LB三角瓶中，加 入相应抗生素，于37°C恒温、200r/min振荡培养至0D600在0. 4~0. 6之间，加 IPTG至终 浓度ImM，25°C继续诱导培养8h后，收集菌体，将菌体沉淀清洗一次后重悬进行超声破碎， 以10000r/min离心30min，将上清液上样于Ni 2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白（图la)， Western blot进行验证（图lb)，并对VPl五聚体进行电镜表征（图lc)。
[0042] (2)、在VPl蛋白中加入量子点（605nm发射光），透析到包装缓冲液中 (IOmMTris-HCl ρΗ7· 2, 250mMNaCl，ImM CaCl2, 5%甘油），再通过蔗糖密度梯度进行纯化，取 得包装量子点的病毒样颗粒（SVQDs)，通过电子显微镜进行表征（图2)。
[0043] 实施例2 :
[0044] MPIOs-VLP-QDs 颗粒的制备
[0045] (1)、将 SVQDs 与生物素化试剂（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin，Thermo 公司， 货号：Pierce Part no. 21343)进行混合（摩尔比I :3)，室温静置30分钟。使用100KD超滤 管和PBS将混合物稀释104倍，以去除多余未结合的生物素。将磁性颗粒（ΜΡΙ0, Dymbeiidsih MyOne?Streptavidin Cl，Thermo Fisher公司，货号：65001)用磁力架吸附在EP管壁上后， 吸去上清，再加入PBS，如此洗涤3次后，将磁性颗粒（MPIO)与Biotin-SVQDs按摩尔比1 : 1000,或者使Biotin-SVQDs绝对过量混合，在漩涡振荡器上缓慢震荡，室温下反应30分钟。 反应后，将样品放在磁力架上吸附，磁珠3分钟，磁性纳米颗粒30min，吸去上清，并用PBS洗 涤两次，得到SVQDs包裹结合磁珠的颗粒（MPIOs-VLP-QDs)。将最终的磁珠悬浮在500 μ L PBS中，放在4°C备用。
[0046] (2)通过荧光显微系统观察拍照，使用60倍油镜镜头，滤光片设置为红色通道和 明场通道，得到MPIOs-VLP-QDs单颗粒显微图像（图3)。
[0047] 实施例3 :
[0048] 细胞导入MPIOs-VLP-QDs颗粒及可控操纵
[0049] (1)培养 Vero 细胞，取出 200 μ L 5mg/mL 的 MPIOs-VLP-QDs，分别加到 Vero 细胞 80-90%铺满率的玻璃底小皿。将小皿放在4°C冰箱孵育I. 5h，之后使用DMEM培养基将小 皿洗三遍，加入5 μ L Hoechst 33258与500 μ LOpti-MEM培养基室温孵育5分钟，将小皿用 DiffiM培养基洗三遍，再加入I. 5mL新鲜DiffiM培养基，置于37°C二氧化碳培养箱继续培养 Mh0
[0050] (2)在MPIOs-VLP-QDs 4°C孵育细胞I. 5h后，使用荧光显微镜，60X物镜观察小皿 中的样品，使用DAPI滤光片组成像Hochest染的细胞核，TRITC滤光片组成像磁性复合颗 粒，明场拍摄细胞形态，结果显示MPIOs-VLP-QDs可以吸附于细胞表面（图4a)。细胞继续 置于37°C二氧化碳培养箱继续培养16h后，显微成像发现MPIOs-VLP-QDs进入细胞并位于 临近细胞核的区域（图4b)。
[0051] 如果在细胞培养过程中，在小皿侧面加一个磁场，在MPIOs-VLP-QDs"侵染"24h后， 细胞内的磁性颗粒及其荧光均按磁场方向定向排列（图5)。将MPIOs-VLP-QDs "侵染"的 细胞用200微升胰酶消化变圆之后，加入2mL DMEM培养基，用移液枪将细胞吹起悬浮，在小 皿一旁加上磁铁，在显微镜下用明场拍摄动态过程，可以看到含有磁性颗粒MPIOs-VLP-QDs 的细胞，可以在外加磁场的控制下，按磁场方向定向运动（图6)。
【主权项】
1. 猴病毒40衣壳蛋白VP1组装的病毒样颗粒在介导微米颗粒进入细胞中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，所述的微米颗粒为无机微米颗粒。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：猴病毒40衣壳蛋白VP1组装的病毒样颗 粒在介导微米量级磁性氧化铁颗粒MPIO进入细胞中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其步骤包括： (1) 、构建VP1蛋白的表达质粒，大肠杆菌表达、纯化VP1，通过电子显微镜表征其五聚 体形态； (2) 、在VP1蛋白包装量子点，再通过蔗糖密度梯度进行纯化，取得包装量子点的病毒 样颗粒SVQDs，通过电子显微镜进行表征； (3) 、将SVQDs与生物素化试剂进行混合，去除多余未结合的生物素，得到 Biotin-SVQDs ； 将链霉亲和素修饰的MPIO与Biotin-SVQDs混合，通过磁力架纯化出被SVQDs包裹的 磁珠 MPIOs-VLP-QDs ; (4) 通过荧光显微系统观察拍照，得到单颗粒显微图像； (5) 将MPIOs-VLP-QDs与培养好的Vero细胞冰上混合孵育，清洗掉多余的 MPIOs-VLP-QDs，再放入培养箱继续培养； (6) 分别通过荧光显微镜观察MPIOs-VLP-QDs孵育细胞不同孵育时间下的颗粒定位； (7) 在培养皿外放置一个磁铁继续培养，使用荧光显微镜观察MPIOs-VLP-QDs在细胞 中的定位，同时将侵染的细胞用胰酶消化悬浮后，观察磁场对细胞运动方向的控制。
【文档编号】C12N15/70GK105861418SQ201510031883
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】崔宗强, 张先恩, 高丁, 张治平
【申请人】中国科学院武汉病毒研究所