一种猪icsi受精卵制备用操作皿的制作方法
【专利摘要】本发明设计一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，包括在Φ60mm的一次性细胞培养皿上依次制作设定尺寸的操作液微滴、用于制动的PVP微滴、注射针处理微滴、和精液培养微滴，所述精液培养微滴包括呈H型结构的第一精液培养微滴、精液筛选桥和第二精液培养微滴，利用精液筛选桥的作用，选取大量高质量精子。达到在短时间内实现大量猪ICSI操作目的，减少猪ICSI操作过程选择精子的时间，减少卵母细胞在空气中暴露的时间，提高猪ICSI胚胎的存活率。
【专利说明】
一种猪I CS I受精卵制备用操作皿的制作方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]单精子卵胞楽内注射技术(IntracytoplasmicSperm Inject1n，简称:ICSI，也有称之为:胞质内单精子注射技术)，对于转基因猪和克隆猪的研究，以及用于研究异种器官移植的供体具有广阔的应用前景，猪作为生物技术研究和应用中的一个理想动物模型，日益受到众多研究者的青睐。然而，仅仅依靠通过采集体内胚胎是远远不够的，因此，建立合理的体外胚胎生产技术是非常必要的，而长期困扰猪体外胚胎生产体系改进的一个主要因素是多精入卵的发生率较高。作为一种家畜胚胎工程新技术，采用ICSI可以解决猪的多精入卵问题。ICSI是在操作皿上，通过显微操作系统，将选取的精子直接注射入体外培养成熟且已经消化掉颗粒细胞的卵母细胞内完成。因此，操作皿的制作方法直接关系到猪ICSI受精卵制备的效率及ICSI胚胎的早期发育。
[0003]实验室进行猪ICSI的受精卵制备过程中，种猪精子人工采集并经过初步稀释后，在17°C环境中大约可保存一周时间，但精子在采集、运输、保存的过程中，受不可避免的种猪质量、外界环境温度微量变化、运输过程中的晃动等多种不利因素影响，储存的精子中，都会有一定比例的死亡精子，且随着保存时间的延长，死亡精子所占比率会快速递增，在此期间质量好的精子还会主动吸附到死亡精子而形成一团，这就给ICSI操作带来非常不利影响，为了解决这个问题，传统方法是操作者ICSI之前，耗费大量时间对精子进行预处理;或者是ICSI过程中对精子进行选择。然而不管采用哪种方法，其处理过程均会耗费大量时间和人力物力，比如对精子预处理时，需耗用大量液体进行死精子的筛选处理，一旦处理不够彻底，将造成死精子及精液中杂质黏进注射针管壁现象，从而大大降低了 ICSI成功率，增加了受精卵制备成本。
[0004]常规ICSI操作皿包括:ICSI皿、PVP圆形微滴、PVP条形微滴和缓冲培养基微滴，进行ICSI操作的过程是吸取一定量含有精子的培养基加到PVP条形微滴中制动后即完成ICSI。现代技术中，在制备转基因猪时，由于需要注射大量的猪ICSI胚胎，若采用传统ICSI方法，势必大大增加操作者选择优良精子的时间，从而定增加了操作人员的工作强度且降低了工作效率。中国发明专利《一种ICSI操作皿制作方法KCN104480063A)所公开的，是专门针对部分男性人类严重少精、梗阻性无精症患者的ICSI操作皿制作方法，该方法所依据的原理是:将精子培养基条形微滴由传统方法的1.0yL，增量100倍为0.1mL，培养基内极少数质量好的精子会向长宽各为(1.8?2.2)cm、(0.4?0.6)cm的条形微滴边缘移动，再从移动中的质量好的精子中选取一个，并用带精子的显微穿刺针将精子注射至卵子内即完成ICSI操作皿制作，采用该方法虽能在短时间内找到并吸取质量较好精子完成ICSI操作，减少卵子在培养箱外暴露时间，最大限度的减少温度、湿度和CO2浓度变化对卵子纺锤体等超微结构的损伤。但并不能简单的将该方法移植到猪ICSI的受精卵制备用操作皿制作中，其原因是:猪ICSI的目的是用来进行转基因猪制备，而制备转基因猪所需要移植的胚胎数要远远大于人，因此，猪ICSI时，需要操作者制备大量ICSI胚胎，需要同时选取大量高质量的精子，若采用《一种ICSI操作皿制作方法》(CN104480063A)所公开的方案，同样存在效率低下问题;其二是《一种ICSI操作皿制作方法》(CN104480063A)所公开的方案中，培养基内仅有极少数质量好的精子向条形微滴边缘移动，同时需要依靠熟练操作者细心的观察才能发现其中质量最好精子，而猪ICSI操作过程中需要一次注入大量含精子培养基，再让培养基中的高质量精子自动分选出来，方能达到缩短操作者选择精子的时间，提高猪ICSI操作质量，并从一定程度上降低了操作人员的工作强度，提高了工作者的工作效率，达到省时省力即可筛选优质精子的目的。
【发明内容】
[0005]本发明是针对【背景技术】所提出问题，设计一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，达到在短时间内实现大量猪ICSI操作目的，减少猪ICSI操作过程选择精子的时间，减少卵母细胞在空气中暴露的时间，提高猪ICSI胚胎的存活率。
[0006]为了达到所述目的，本发明所采用的技术方案是:
一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，其特征在于:所述制作步骤及制作条件如下:
步骤一:用6118011200微升移液器吸取150仙的1^-199，在0 60111111的一次性细胞培养皿的圆心沿X轴正负向做一个长2 ± 0.2cm、宽0.5 ± 0.1?11的长方形^11-199操作液微滴(4)，所述操作液微滴(4)用于放置猪卵母细胞并进行ICSI操作;设定所述一次细胞培养皿的圆心为原点；
步骤二:在按步骤一完成的操作液微滴(4)的上侧和下侧平行位置，各做一个与操作液微滴(4)平行且长宽尺寸相等的浓度为7%?9%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴(4)上侧的是上PVP微滴(3 )、位于位于操作液微滴(4)下侧的是下PVP微滴(5 )，所述上PVP微滴(3 )和下PVP微滴(5)均用于精子的制动操作；
步骤三:分别在按步骤二中完成的上PVP微滴(3)的上侧和下PVP微滴(5)的下侧，各做三个10 土 1.0yL的浓度为7%?9%的PVP注射针处理微滴，其中:位于上PVP微滴(3)上侧的三个微滴是上注射针处理微滴(2)、位于下PVP微滴(5)下侧的三个微滴是下注射针处理微滴
(6)，所述上注射针处理微滴(2)和下注射针处理微滴(6)均用于显微注射针注射前的润洗以及，猪ICSI操作过程中管壁粘有精子时的注射针处理；
步骤四:在按步骤一完成的操作液微滴(4)的X轴负向紧靠培养皿的边缘部位，沿Y轴正负方向做一个高I 土 I.0cm、宽0.4 ±0.1cm的第一精液培养微滴(1.1)，所述第一精液培养微滴(1.1)用于放置精子;再在所述第一精液培养微滴(I.I)的中部沿X轴正向，用受精液做一长I ± 0.lcm、宽0.1 ± 0.05cm的用于精子游动的精液筛选桥(1.2)；最后在所述精液筛选桥(1.2 )的右端，沿Y轴正负方向做一高2 ± 0.2cm、宽0.5 ± 0.1 cm的第二精液培养微滴(1.3)。其有益效果是:大量位于第一精液培养微滴(1.1)的精子，经沿又窄又长的精液筛选桥
(1.2)正向游动，最后能够顺利到达第二精液培养微滴(1.3)的部分精子即为高质量的可用备选精子。
[0007]步骤五:将石蜡油覆盖在按步骤一?步骤四制作完成的所有微滴及精液筛选桥
(1.2)上; 步骤六:用显微注射针直接在第二精液培养微滴(1.3)中吸取质量较好的精子，再注射在上PVP微滴(3 )或下PVP微滴(5 )中进行制动，再在上PVP微滴(3 )或下PVP微滴(5 )中吸取制动后的精子，在操作液微滴(4)中进行注射，注射操作之前，先将注射针置于上注射针处理微滴(2)或下注射针处理微滴(6)共六个微滴中的任一个微滴中进行润洗，注射时，用固定针将卵母细胞的极体处于12点或者6点钟位置，注射针从卵母细胞的3点钟方向进去，注入精子后，轻轻反复回吸胞质，保证精子注射卵母细胞内，注射完成后轻轻退针，完成一个猪ICSI胚胎的制备。其有益效果是:注射操作之前，先将注射针置于六个10tiL8%PVP微滴中的任一微滴中进行润洗，以保证注射时注射针管壁的平滑，避免精子粘在注射针的管壁不能够顺畅的注射入卵母细胞中。
[0008]所述步骤一中TCM-199操作液微滴(4)的配方为:添加7.Syg/mL细胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES缓冲的TCM-199 ；
所述步骤四中受精液的配方为:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 ,20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方称重后，溶于纯水中。
[0009]本发明一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法所依据的原理是:本发明中猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法中所做的精子微滴由第一精液培养微滴(1.1)、精液筛选桥(1.2)和第二精液培养微滴(1.3)三部分组成，其中精液筛选桥(1.2)可以作为活力较强精子筛选的通道，活力较强的精子通过精液筛选桥(1.2)较窄的通道快速游出到第二精液培养微滴(1.3)中并很快移动至微滴边缘，操作者在微滴边缘即可快速吸取大量质量较好的精子用于制动并进行注射，减少了筛选死精子的时间，同时避免死精子及精液中杂质黏进注射针管壁的危险。
[0010]采用本发明中提供的技术方案可以得到如下的效果:
本发明提供了一种新的猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，使用过程中，操作者能够快速、方便的吸取质量较好的精子，减少了操作者选择精子的时间，提高操作者的注射效率，减少卵母细胞在空气中暴露的时间，提高注射后猪ICSI受精卵的存活率和卵裂率。
[0011]在制备转基因猪时，由于需要注射大量的猪ICSI胚胎，采用本发明中提供的方法制作猪ICSI操作皿，可以大大缩短操作者选择精子的时间，从一定程度上降低了操作人员的工作强度，提高了工作者的工作效率。
【附图说明】
[0012]图1是本发明一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法示意图。
[0013]图1中标记:1.1一第一精液培养微滴，1.2—精液筛选桥，1.3—第二精液培养微滴，2—上注射针处理微滴，6—下注射针处理微滴，3—上PVP微滴，5—下PVP微滴，4 一操作液微滴。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图对技术方案的实施作进一步的详细描述，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内，本技术方案中未详细述及的，均为公知技术。
[0015]参见图1，本发明一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，其制作步骤及制作条件如下:
步骤一:用6118011200微升移液器吸取150仙的1^-199，在0 60111111的一次性细胞培养皿的圆心沿X轴正负方向做一个长2cm、宽0.5cm的长方形TCM-199操作液微滴4，所述操作液微滴4用于放置猪卵母细胞并进行ICSI操作;设定所述一次细胞培养皿的圆心为原点；
步骤二:在按步骤一完成的操作液微滴4的上侧和下侧平行位置，各做一个与操作液微滴4平行且长宽尺寸相等的浓度为8%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴4上侧的是上PVP微滴3、位于位于操作液微滴4下侧的是下PVP微滴5，所述上PVP微滴3和下PVP微滴5均用于精子的制动操作；
步骤三:分别在按步骤二中完成的上PVP微滴3的上侧和下PVP微滴5的下侧，各做三个1yL的浓度为8%的PVP注射针处理微滴，其中:位于上PVP微滴3上侧的三个微滴是上注射针处理微滴2、位于下PVP微滴5下侧的三个微滴是下注射针处理微滴6，所述上注射针处理微滴2和下注射针处理微滴6均用于显微注射针注射前的润洗以及，猪ICSI操作过程中管壁粘有精子时的注射针处理；
步骤四:在按步骤一完成的操作液微滴4的X轴负向紧靠培养皿的边缘部位，沿Y轴正负方向做一个高lcm、宽0.4cm的第一精液培养微滴1.1，所述第一精液培养微滴1.1用于放置精子;再在所述第一精液培养微滴1.1的中部沿X轴正向，用受精液做一长lcm、宽0.1cm的用于精子游动的精液筛选桥I.2;最后在所述精液筛选桥1.2的右端，沿Y轴正负方向做一尚2cm、宽0.5cm的第二精液培养微滴1.3。这时大量位于第一精液培养微滴1.1中的精子，经沿又窄又长的精液筛选桥1.2正向游动，最后能够到达第二精液培养微滴1.3的精子即为高质量的可用备选精子。
[0016]步骤五:将石蜡油覆盖在按步骤一?步骤四制作完成的所有微滴及精液筛选桥1.2 上；
步骤六:用显微注射针直接在第二精液培养微滴1.3中吸取质量较好的精子，再注射在上PVP微滴3或下PVP微滴5中进行制动，再在上PVP微滴3或下PVP微滴5中吸取制动后的精子，在操作液微滴4中进行注射，注射操作之前，先将注射针置于上注射针处理微滴2或下注射针处理微滴6共六个微滴中的任一个微滴中进行润洗，注射时，用固定针将卵母细胞的极体处于12点或者6点钟位置，注射针从卵母细胞的3点钟方向进去，注入精子后，轻轻反复回吸胞质，保证精子注射卵母细胞内，注射完成后轻轻退针，完成一个猪ICSI胚胎的制备。注射操作之前，先将注射针置于其中任意一个10uL8%PVP微滴中进行润洗，以保证注射时注射针管壁的平滑，避免精子粘在注射针的管壁不能够顺畅的注射入卵母细胞中。
[0017]所述步骤一中TCM-199操作液微滴4的配方为:添加7.Syg/mL细胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES缓冲的TCM-199 ；
所述步骤四中受精液的配方为:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 ,20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方称重后，溶于纯水中。
[0018]本发明一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法所依据的原理是:本发明中猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法中所做的精子微滴由第一精液培养微滴1.1、精液筛选桥1.2和第二精液培养微滴1.3三部分组成，其中精液筛选桥1.2可以作为活力较强精子筛选的通道，活力较强的精子通过精液筛选桥1.2较窄的通道快速游出到第二精液培养微滴1.3中并很快移动至微滴边缘，操作者在微滴边缘即可快速吸取大量质量较好的精子用于制动并进行注射，减少了筛选死精子的时间，同时避免死精子及精液中杂质黏进注射针管壁的危险。
[0019]本发明所用操作皿为美国NEST公司生产:型号705001。
[0020]本发明中所用显微注射针为美国Sunlight Medical公司生产，型号H07047BH。
[0021]在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底” “内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0022]此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0023]在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”、“固连”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体;可以是机械连接，也可以是电连接;可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0024]在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
【主权项】
1.一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，其特征在于:所述制作步骤及制作条件如下: 步骤一:用Gilson200微升移液器吸取150yL的TCM-199，在Φ60πιπι的一次性细胞培养皿的圆心沿X轴正负向做一个长2 ± 0.2cm、宽0.5 ± 0.1 cm的长方形TCM-199操作液微滴⑷，所述操作液微滴(4)用于放置猪卵母细胞并进行ICSI操作;设定所述一次细胞培养皿的圆心为原点； 步骤二:在按步骤一完成的操作液微滴(4)的上侧和下侧平行位置，各做一个与操作液微滴(4)平行且长宽尺寸相等的浓度为7 %?9%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴(4)上侧的是上PVP微滴(3)、位于位于操作液微滴(4)下侧的是下PVP微滴(5)，所述上PVP微滴(3)和下PVP微滴(5)均用于精子的制动操作； 步骤三:分别在按步骤二中完成的上PVP微滴(3)的上侧和下PVP微滴(5)的下侧，各做三个10 土 I.0yL的浓度为7 %?9 %的PVP注射针处理微滴，其中:位于上PVP微滴(3)上侧的三个微滴是上注射针处理微滴(2)、位于下PVP微滴(5)下侧的三个微滴是下注射针处理微滴(6)，所述上注射针处理微滴(2)和下注射针处理微滴(6)均用于显微注射针注射前的润洗以及，猪ICSI操作过程中管壁粘有精子时的注射针处理； 步骤四:在按步骤一完成的操作液微滴(4)的X轴负向紧靠培养皿的边缘部位，沿Y轴正负方向做一个高I ± I.0cm、宽0.4 ±0.1 cm的第一精液培养微滴(1.1)，所述第一精液培养微滴(1.1)用于放置精子;再在所述精液培养微滴(1.1)的中部沿X轴正向，用受精液做一长I±0.lcm、宽0.1 ±0.05 cm的用于精子游动的精液筛选桥(1.2)；最后在所述精液筛选桥(I.2)的右端，沿Y轴正负方向做一高2 ±0.2cm、宽0.5 ±0.Icm的第二精液培养微滴(1.3)；步骤五:将石蜡油覆盖在按步骤一?步骤四制作完成的所有微滴及精液筛选桥(1.2)上； 步骤六:用显微注射针直接在第二精液培养微滴(1.3)中吸取质量较好的精子，再注射在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中进行制动，再在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中吸取制动后的精子，在操作液微滴(4)中进行注射，注射操作之前，先将注射针置于上注射针处理微滴(2)或下注射针处理微滴(6)共六个微滴中的任一个微滴中进行润洗，注射时，用固定针将卵母细胞的极体处于12点或者6点钟位置，注射针从卵母细胞的3点钟方向进去，注入精子后，轻轻反复回吸胞质，保证精子注射卵母细胞内，注射完成后轻轻退针，完成一个猪ICSI胚胎的制备； 所述步骤一中TCM-199操作液微滴(4)的配方为:添加7.5yg/mL细胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES缓冲的TCM-199 ； 所述步骤四中受精液的配方为:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 , 20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方称重后，溶于纯水中。
【文档编号】C12N5/073GK105861423SQ201610242170
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】张立苹, 郑新民, 肖红卫, 刘西梅, 毕延震, 李莉, 华再东, 华文君, 任红艳
【申请人】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所