一株抗b亚群禽白血病病毒的细胞系及其应用
【专利摘要】本发明提供一株抗B亚群禽白血病病毒(ALV?B)的细胞系及其应用。将ALV?B env基因插入表达载体，将构建的转移载体在鸡胚成纤维细胞系DF?1中表达，通过Zeocin药物筛选获得有Zeocin抗性、稳定表达ALV?B env基因的鸡胚成纤维细胞系DF?1/B，该细胞系保藏编号为CCTCC No.C201609。对DF?1/B细胞系进行检测和抗病毒感染分析，发现DF?1细胞系中表达的ALV?B env蛋白对ALV?B病毒具有超感染抗性，能抵抗滴度为104TCID50的病毒感染复制量，本发明的DF?1/B细胞系可用于不同亚群禽白血病病毒感染的鉴别诊断，临床诊断价值显著，应用前景广阔。CCTCC NO:C20160920160121
【专利说明】
一株抗B亚群禽白血病病毒的细胞系及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫学领域，具体地，涉及一株抗B亚群禽白血病病毒的细胞系及其应 用。
【背景技术】
[0002] 禽白血病病毒(ALV)属于反转录病毒科禽α型反转录病毒群。禽白血病病毒与肉瘤 病毒紧密相关，常统称为禽白血病/肉瘤病毒。根据细胞感染范围、干扰谱和囊膜抗原特征， 可将禽白血病/肉瘤病毒群进一步区分为A到J等10个亚群，其中六3、(：、04、1亚群见于鸡 等。A、B、J亚群是常见的外源性病毒，C、D亚群是极少报道的外源性病毒，其中E亚群为内源 性病毒。禽白血病病毒囊膜蛋白（env基因编码的病毒糖基化蛋白）是该类病毒的主要表面 蛋白，它决定病毒感染的宿主范围，能诱导产生中和抗体。该蛋白与靶细胞表面特异性受体 识别、结合，是病毒进入细胞，复制所必需的。感染特定亚群ALV后，细胞表面病毒受体能被 该病毒产生的env基因编码的病毒糖基化蛋白封闭，表现出强大的超感染抗性，能限制相应 病毒的再次感染。
[0003] 目前禽白血病对我国养禽业危害严重，并出现了髓细胞瘤型和血管瘤型等多种病 理表现型，在临床表现上还容易与网状内皮组织增生症、马立克氏病等肿瘤性疾病相混淆。 该病主要为垂直传播，控制本病有效的措施是降低种鸡群的感染率和建立无外源性禽白血 病病毒感染的种鸡群，其主要手段是通过对鸡群定期进行外源性ALV检测，及时淘汰带毒阳 性鸡，以净化和消除鸡群中的ALV。在外源性ALV中，以J亚群、A亚群和B亚群禽白血病病毒对 鸡有明显的致病性，对养禽生产的危害也大。
[0004] 国内外对于禽白血病病毒的检测和鉴定方法主要有细胞培养、ELISA、间接免疫荧 光试验、PCR等，其中ELI SA在临床上应用最广，其优点是该法操作相对简便，有商品化的检 测试剂盒可以利用，其不足之处是不能区分内源性和外源性ALV;间接免疫荧光试验比较直 观，但是往往需要用到特异性抗体(单抗）。能够区分不同ALV亚群的PCR引物及其工作体系 已经有报道。
[0005] 在外源性禽白血病病毒的分离上，目前常用的细胞有鸡胚成纤维细胞(CEF)和源 于0系鸡的成纤维细胞系DF-I。美国ADOL实验室基于DFl细胞系，建立了抗J亚群禽白血病病 毒的DF-1/J细胞系。尽管美国ADOL实验室有一些特定的鸡品系，其产生的原代细胞可以分 别限制特定外源性禽白血病病毒生长，但是这些品系鸡的稀有性限制了其效能的发挥。目 前还没有可特异性地限制B亚群禽白血病病毒的细胞系的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一株特异性的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述抗B亚群禽白血病病毒的细胞系的应用。
[0008] 本发明的抗B亚群禽白血病病毒细胞系的构建方法，包括如下步骤：
[0009] (1)利用带KpnI和Not頂每切位点的引物从ALV-B(CD08毒株)基因组PCR扩增env片 段，用限制性内切酶KpnI和No11分别对扩增的env基因及真核表达质粒pcDNA3.1/Zeo(+)进 行双酶切，分别纯化后将B亚群禽白血病病毒env基因片段连接到pcDNA3.1/Ze〇( + )真核表 达质粒，构建成重组质粒pcDNA-env-B;
[0010] (2)转移载体pcDNA-env-B在DF-I鸡胚成纤维细胞系表达的基础上，通过Zeocin药 物多次筛选，得到具有Zeocin抗性、可稳定表达ALV-B env蛋白的鸡胚成纤维细胞系DF-I/ B，即抗B亚群禽白血病病毒的细胞系。
[0011] 本发明筛选得到的抗B亚群禽白血病病毒鸡胚成纤维细胞命名为DF-1/B，于2016 年1月21日在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中 心，简称CCTCC，邮编430072)保藏，保藏编号CCTCC No. C201609。
[0012] 本发明提供了保藏编号为CCTCC No.C201609的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在 制备B亚群禽白血病病毒诊断试剂中的应用。
[0013] 本发明提供了保藏编号为CCTCC No.C201609的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在 制备B亚群禽白血病病毒抗体检测试剂中的应用。
[0014] 本发明保藏编号为CCTCC No.C201609的细胞系可用于制备ALV-B单克隆抗体。 [0015]进一步，本发明提供一种ALV-B单克隆抗体，其由保藏编号为CCTCC No.C201609的 细胞系制备得到。本发明提供了保藏编号为CCTCC No. C201609的抗B亚群禽白血病病毒的 细胞系在制备B亚群禽白血病病毒生物制品中的应用。
[0016] 所述生物制品为疫苗。
[0017] 本发明提供了保藏编号为CCTCC No.C201609的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在 制备抗B亚群禽白血病转基因鸡中的应用。
[0018] 本发明还提供了一种用于检测B亚群禽白血病病毒的试剂，含有保藏编号为CCTCC NO.C201609的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系。
[0019] 本发明的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系可应用于B亚群禽白血病病毒的诊断。
[0020] 本发明提供了一种用于检测抗B亚群禽白血病病毒的细胞系的特异性引物对，其 上下游引物序列为：
[0021 ]上游引物：CGGGGTACCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGATGAGGCGAGCCCTCTTTTTGC;
[0022]下游引物：AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATACTGCTCTTTCGGGCTGCTTA。
[0023]目标片段大小约1845bp。
[0024]含有上述特异性引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。
[0025]本发明从env蛋白超感染抗性出发，将B亚群禽白血病病毒env基因插入pcDNA3.1/ Zeo ( + )真核表达载体构建成转移载体pcDNA-env-B，然后将载体pcDNA-env-B转染鸡胚成纤 维细胞系DF-I，通过药物Zeocin筛选，获得抗Zeocin、稳定表达ALV-B env蛋白的抗B亚群禽 白血病病毒的细胞系。所得到的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系可以稳定传代，长期保存； 能抵抗滴度为10 4TCID5q的病毒感染复制量，特异性强，本发明的DF-1/B细胞系可用于B亚 群禽白血病病毒的诊断。
【附图说明】
[0026]图1为抗B亚群禽白血病病毒的细胞系构建的技术路线 [0027]图2为正常DF-I细胞状态:纤维状，梭形，贴壁生长。
[0028]图3为PCR检测DF-1/B中env基因结果，用本发明设计的引物在DF-1/B中成功检测 到1845bp的env基因，而DF-I中没有。
[0029]图4为间接免疫荧光（IFA)检测env基因表达情况结果，其中图4A为DF-I细胞（阴性 对照)无绿色荧光，图4B为DF-1/B细胞有绿色荧光，说明外源env基因片段在DF-1/B中成功 表达。
[0030] 图5为Western-blot检测env基因的表达结果，DF-1/B中有env蛋白表达，而DF-I中 没有，说明外源env片段在DF-1/B中成功表达。Actin为内参蛋白，env蛋白为目的蛋白。 [0031]图6为抗B亚群禽白血病病毒(ALV-B)实验结果，CD08能在DF-I上正常繁殖，但在 DF-1/B上，⑶08不能正常繁殖，只有在病毒滴度为IO5TCID5q时出现复制，但病毒复制明显受 到抑制，显著低于在DF-I上的复制。结果说明，DF-1/B具有很强的抗ALV-B侵染细胞的能力。 [0032] 图7为抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J CHN06)实验结果，ALV-J在DF-1/B和DF-I上都 能正常繁殖，繁殖情况没有显著差别，说明DF-1/B对ALV-J没有抗性。
[0033]图8为临床病毒分群诊断实例结果，DF-1/B的S/P值显著低于DF-1，说明DF-1/B对 该ALV有抗性。
【具体实施方式】
[0034]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0035]本发明的DF-I细胞系为0系鸡胚成纤维细胞，CD08为B亚群禽白血病病毒，均来自 依托华南农业大学的农业部兽用疫苗创制重点实验室。本发明所用的限制性内切酶Kpn I 和Not I购自NEB公司。pMD18-T载体购自TaKaRa公司、真核表达质粒pcDNA3.1/Zeo( + )购自 Invitrogen公司。ALV-A/B特异性单克隆抗体，美国ADOL实验室馈赠。FITC标记的山羊抗鼠 IgG抗体及HRP标记的山羊抗鼠 IgG抗体均购自Simga公司。SQ Tissue组织DNA提取试剂盒， 胶回收试剂盒DNA Gel Extraction Kit，去内毒素质粒抽提试剂盒Plasmid Miniprep Kit 为OMEGA公司产品。ALV抗原检测试剂盒(Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit)为美 国IDEXX公司产品。高糖DMEM培养基粉、0.25 %胰酶(含EDTA)、胎牛血清为美国GIBCO公司产 品；二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。P0L0deliverer3000转染试剂盒购自上海锐赛生 物技术有限公司。
[0036] 实施例1抗B群禽白血病病毒(ALV-B)细胞系DF-1/B的建立
[0037] 本发明扩增ALV-B env基因的引物由发明人自行设计：
[0038] 上游引物：CGGGGTACCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGATGAGGCGAGCCCTCTTTTTGC
[0039] 下游引物：AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATACTGCTCTTTCGGGCTGCTTA
[0040]反应体系（50yL):LA Taq 25yL、上下游引物各lyL、ddH2021yL、模板2yL。
[0041 ] 反应程序:94°C预变性3min; 94°C变性30s，55 °C退火Imin，72 °C延伸2min，30个循 环;72°C后延伸8min。
[0042]用自行设计的上述引物从ALV-B(CD08毒株)基因组中扩增出env片段，按照胶回收 试剂盒DNA Gel Extraction Kit说明书进行回收;按照NEB公司限制性内切酶KpnI、NotI说 明书分别对真核表达质粒pcDNA3.1/Zeo( + )及pMD18-T-env片段进行双酶切;分别回收酶切 产物，并按照NEB公司T4连接酶说明书对回收产物进行连接，构建重组质粒pcDNA-env-B;转 化感受态细胞DH5a，按照OMEGA公司去内毒素质粒抽提试剂盒说明书，进行重组质粒pcDNA-env-B抽提。质粒送广州英潍捷基(Inv i trogen)公司测序。
[0043]测序正确的质粒按照上海锐赛生物技术有限公司POLOdelivererfOOO转染试剂盒 说明书进行转染。
[0044] 消化前期准备的DF-I细胞，铺六孔细胞培养板，10 % FBS，5 %⑶2、37 °C培养。24h内 进行转染，Corning公司六孔细胞培养板每孔转染体系为：2yg pcDNA-env-B质粒和IOyL脂 质体分别用100gLOpti-METVl?稀释并孵育5min，然后再混合，共同孵育15min，将200yL 质粒-脂质体复合物加入到准备好的六孔细胞培养皿中。转染后5h换细胞培养液(DMEM+ 10%FBS)，24h后将六孔板的一个孔的细胞消化下来，铺24孔板，每孔500yL细胞培养液 (DMEM+15%FBS+200yg/mL zeocin)，每隔3-4天换一次同样体系的细胞培养液，10-15d形成 单细胞集落，三周左右，单细胞集落长大，消化下来置于6孔板内培养，贴壁长满之后转入 25cm 2细胞瓶中培养，此时细胞培养物为(DMEM+10%FBS+200yg/mL zeocin)。用药物zeocin 对细胞连续筛选30代，从核酸及蛋白水平对细胞内的env进行检测，并进行抗病毒实验以及 病毒类型的应用。
[0045]细胞状态:纤维状，梭形，贴壁生长。（如图2所示）
[0046] PCR检测DF-1/B中env基因：抽提DF-1/B的DNA，按照前述扩增env基因的引物、体系 及反应程序扩增env基因，结果如图3所示，env基因扩增片段大小为1845bp。
[0047]间接免疫荧光（IFA)检测env基因表达情况:铺满单层DF-1/B细胞的24孔板内，培 养5d后，底层细胞用PBS洗3次，用4 %多聚甲醛固定20min。再用PBS洗涤3次，加入1:100稀释 的ALV-B单抗，4 °C孵育过夜。PBS洗涤3次，加上1:200稀释的羊抗鼠 IgG-FI TC荧光抗体，37 °C 作用Ih，PBS洗涤3次后，加1滴体积分数50 %甘油覆盖细胞，在荧光显微镜下观察实验结果。 设立一个DMEM阴性对照。结果如图4所示，在荧光显微镜下可观察到DF-1/B细胞的胞浆和表 面有特异荧光，DF-I细胞没有绿色荧光。说明外源env片段在DF-1/B中成功表达。
[0048] Western-blot检测env基因的表达:DF-1/B和对照DF-I培养5d后提细胞总蛋白，用 Bio-Rad垂直电泳仪进行电泳，浓缩胶电压为80V，分离胶电泳电压为100V，电泳缓冲液为1 XTris-甘氨酸电泳缓冲液，待溴酚蓝指示剂达到分离胶底部后停止电泳。切胶转膜后，将 NC膜用I X TBS洗涤3次，每次5min。将NC膜置于含5 %的脱脂奶粉的TBS中，室温封闭2h，I X TBST洗涤3次，每次5min。加蛋白和Act in单抗，4 °C孵育12h。抗体稀释浓度为env(l: 500)， Actin(l: 1000)。一抗孵育之后，将膜用TBST洗涤3次，每次5min，将NC膜置于1:10000HRP标 记的山羊抗鼠 IgG二抗中，37 °C孵育Ih，I X TBST洗涤3次，每次5min。在暗室中，向NC膜上加 入ECL免疫化学发光液孵育5min，用保鲜膜包好NC膜置于感光胶片上，显影，定影，晾干之后 图片扫描，保存。结果如图5所示，DF-1/B中有env蛋白表达，而DF-I中没有。说明外源env片 段在DF-I/B中成功表达。
[0049]本发明筛选得到的抗B亚群禽白血病病毒鸡胚成纤维细胞命名为DF-1/B，于2016 年1月21日在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中 心，简称CCTCC，邮编430072)保藏，保藏编号CCTCC No. C201609。
[0050]实施例2抗B群禽白血病病毒(ALV-B)细胞系DF-1/B的生物学活性实验
[0051 ] 抗病毒实验:分别用DMEM将ALV-B毒株CD08从IOt3到IO5进行倍比稀释。分别消化DF- I/B细胞和DF-I细胞，各接种于一块24孔细胞培养板中，每孔接种ImL细胞悬液，细胞浓度为 1.7X IO5CelWmL0
[0052]将CD08各病毒稀释梯度的毒液分别接种于两板细胞悬液中，每孔接种IOOyL毒液， 每个病毒稀释梯度做三个重复，并做一个已知阳性毒株的对照和DMEM阴性对照，5%⑶2、 10%FBS、37°C培养箱中培养。待接种毒液后第二天，细胞长满单层后，换为1%FBS的细胞维 持液进行培养。连续培养6d，期间持续监测细胞的生长情况，并在第6天收集细胞培养物，冻 融三次后离心收集细胞上清。收集的细胞上清液用同一个批次的ELISA试剂盒进行p27抗原 ELISA检测。结果如图6所示，CD08能在DF-I上正常繁殖，但在DF-1/B上，CD08不能正常繁殖， 只有在病毒滴度为IO 5TCID5q时出现复制，但病毒复制明显受到抑制，显著低于在DF-I上的 复制。结果说明，DF-1/B具有很强的抗ALV-B侵染细胞的能力。
[0053] 用同样的方法将ALV-J毒株CHN06接种DF-1/B细胞和DF-I细胞。结果如图7显示， ALV-J在DF-1/B和DF-I上都能正常繁殖，繁殖情况没有显著差别，说明DF-1/B对ALV-J没有 抗性。
[0054]临床病毒分群鉴别诊断实例:如图8所示，将临床分离的ALV同时接种DF-I和DF-I/ B，培养7天后，冻融三次后离心收集细胞上清，ELISA检测，DF-1/B的S/P值明显低于DF-U 明DF-1/B对该ALV有抗性，初步判断该ALV为ALV-B。抽提接种该ALV的DF-I细胞DNA，扩增 gp85，回收后送测序，证明该毒株确为ALV-B。
[0055]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一株抗B亚群禽白血病病毒的细胞系，其为鸡胚成纤维细胞，名为DF-l/B，其保藏编 号为CCTCC N〇.C201609。2. 权利要求1所述的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在制备B亚群禽白血病病毒诊断试 剂中的应用。3. 权利要求1所述的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在制备B亚群禽白血病病毒抗体检 测试剂中的应用。4. 权利要求1所述的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在制备B亚群禽白血病病毒单克隆 抗体中的应用。5. -种B亚群禽白血病病毒单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCC No. C201609 的抗K亚群禽白血病病毒的细胞系制备得到。6. 权利要求1所述的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在制备B亚群禽白血病病毒生物制 品中的应用。7. 如权利要求6所的应用，其特征在于，所述生物制品为疫苗。8. 权利要求1所述的抗B亚群禽白血病病毒的细胞系在制备抗B亚群禽白血病转基因鸡 中的应用。9. 一种用于检测B亚群禽白血病病毒的试剂，其特征在于，含有权利要求1所述抗B亚群 禽白血病病毒的细胞系。10. -种用于检测抗B亚群禽白血病病毒的细胞系的特异性引物对，其特征在于，其上 下游引物序列为： 上游引物：CGGGGTACCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGATGAGGCGAGCCCTCTTTTTGC; 下游引物:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATACTGCTCTTTCGGGCTGCTTA。
【文档编号】G01N33/569GK105861444SQ201610219254
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】曹伟胜, 饶明章, 廖明, 袁丽霞
【申请人】华南农业大学