体外细胞疾病模型及其制备方法
【专利摘要】本发明提出了一种体外细胞疾病模型及其制备方法和一种筛选药物的方法，所述制备体外细胞疾病模型的方法包括采用激光显微切割系统对细胞的预定部位进行线性切割，以便获得所述体外细胞疾病模型。本发明实施例所提出的制备体外细胞疾病模型的方法可制备特定细胞结构乃至单个细胞疾病模型，而对非造模区域无损伤，方法操作简单，所得体外细胞疾病模型能够真实全面的反应疾病的发病机制或过程。
【专利说明】
体外细胞疾病模型及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及体外细胞疾病模型、制备体外细胞疾病模型的方法以及筛选药物的方法。
【背景技术】
[0002]体外细胞疾病模型对于疾病的发病机制研究和筛选药物都具有极其重要的作用。现有的制备体外细胞疾病模型的方法包括药物诱导、基因修饰、诱导多能干细胞(iPSCs)技术等，然而这些技术不能全面或真实的反应疾病的发病机制或过程。
[0003]进而，制备体外细胞疾病模型的方法仍有待进一步开发。
【发明内容】
[0004]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出了一种具有制备特定区域细胞乃至单个细胞疾病模型的方法，该方法操作简单，能够真实全面的反应疾病的发病机制或过程。
[0005]在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备体外细胞疾病模型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括:采用激光显微切割系统对细胞的预定部位进行线性切割，以便获得所述体外细胞疾病模型。本发明实施所提出制备体外细胞疾病模型的方法，既避免了细胞在微流体系统中生长受限的问题，又避免了微流体培养板造价昂贵的问题，既避免了将高功率的激光器整合到共聚焦显微镜的光路系统而造成的技术要求高和仪器不稳定的问题，又避免了药物诱导不能实现局部区域诱导的问题，既避免了基因修饰存在的非真实性反应疾病发病机制的问题，又避免了 iPSCs技术存在的不能全面反应疾病发病机制的问题。本发明实施例所提出的方法可制备特定区域细胞乃至单个细胞疾病模型，而对非造模区域无损伤，方法操作简单，所得体外细胞疾病模型能够真实全面的反应疾病的发病机制或过程。
[0006]根据本发明的实施例，上述制备体外细胞疾病模型的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
[0007]根据本发明的实施例，所述细胞预先在玻璃底皿或铺有多聚赖氨酸的盖玻片上培养预定时间。玻璃材质的底皿对激光的通透性好，多聚赖氨酸处理适于细胞的贴壁生长，进而利用激光显微切割系统对细胞进行切割时，更有利于周围细胞不被冲起，不会影响周围细胞。
[0008]根据本发明的实施例，所述体外细胞疾病模型是细胞损伤疾病模型。本发明实施例所提出的方法适用于细胞损伤疾病模型构建，根据本发明的实施例，应用本发明实施例所提出的方法制备的细胞损伤疾病模型的细胞损伤指标显著。
[0009]根据本发明的实施例，所述细胞损伤疾病模型是神经元细胞退化疾病模型。根据本发明的实施例，利用本发明实施例所提出的方法制备的神经元细胞退化疾病模型，神经元细胞退化指标显著，本发明实施例所提出的方法更加适于制备神经元细胞退化疾病模型。
[0010]根据本发明的实施例，所述对细胞的预定部位进行线性切割是通过如下操作实现的:(I)通过调整Focus参数来调整激光切割平面，直至在所述玻璃底皿或所述盖玻片的无细胞区域的底面划出清晰印迹，所述Focus参数为50?60; (2)通过调整Power参数来调整激光切割能量，直至在非实验细胞区实现第一预定部位的线性切割而不影响周边细胞，所述Power参数为40?50; (3)在步骤(2-1)和(2-2)中获得的Focus和Power的激光参数下，在实验细胞区的第二预定部位实现线性切割。本发明实施例所提出的方法在上述操作下，实现了对实验细胞区预定部位精准的切割，切割能量恰当，不影响周边细胞。
[0011 ]根据本发明的实施例，所述第二预定部分是所述细胞的特化结构，任选地，所述特化结构是伪足。根据本发明的实施例，当所述细胞具有伪足结构时，本发明实施例所提出的制备体外细胞疾病模型的方法可实现在细胞的胞体和伪足的连接区进行精准线性切割，进而获得细胞损伤疾病模型，所获得的细胞的损伤指标显著。
[0012]根据本发明的实施例，所述第二预定部分是所述神经元细胞的轴突(突出)。根据本发明的具体实施例，当所述细胞为神经元细胞时，本发明实施例所提出的方法可实现神经元轴突(突出)的精准切割。根据本发明的具体实施例，所述神经元既可指从神经球得到的多个神经细胞又可指单个神经元细胞，当神经球的周边爬出大量轴突时，激光可对整个细胞球和周边轴突进行精准切割，当神经元细胞单个生长时，激光可对单个神经元的轴突进行精准切割。本发明实施例所提出的方法制备的神经元退化疾病模型的神经元细胞退化指标显著，具体表现在具有退化小泡的神经轴突的比例显著升高，断裂轴突的比例显著升尚O
[0013]在本发明的第二方面，本发明提出了一种体外细胞疾病模型。根据本发明的实施例，所述体外细胞疾病模型是通过前面所述的方法制备的。本发明实施例所提出的体外细胞疾病模型，疾病指标显著，可全面真实地反应疾病机制或过程，可用于相关药物的筛选。
[0014]在本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，根据本发明的实施例，所述筛选药物的方法包括:将候选药物与前面所述的体外细胞疾病模型接触;通过监控所述接触前后，所述细胞表型或功能的变化，判断所述候选药物是否能够用于治疗或预防细胞损伤疾病。本发明实施例所提出的筛选药物的方法可用于筛选具有治疗或预防细胞损伤疾病的药物。根据本发明的实施例，前面所述的体外细胞疾病模型具有疾病的典型指标，如细胞表型或功能变化指标，如果将候选药物作用于前面所述的体外细胞疾病模型，细胞表型或功能指标变好，则候选药物具有治疗或预防细胞损伤疾病的用途。本发明实施例所提出的筛选药物方法的可行性和可信度高。
[0015]在本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括:将候选药物与前面所述的体外细胞疾病模型接触，所述体外细胞疾病模型是神经元细胞退化疾病模型；以及监控在所述接触前后，具有退化小泡的轴突的比例或断裂轴突的比例，其中，所述退化小泡的轴突的比例降低或断裂轴突的比例降低是药物具有治疗或预防神经元退化用途的指示。本发明实施例所提出的筛选药物的方法可用于筛选具有治疗或预防神经元退化疾病的药物。根据本发明的实施例，前面所述的神经元退化疾病模型具有神经元退化疾病的典型指标，如退化小泡的轴突的比例升高或断裂轴突的比例升高，如果将候选药物作用于前面所述的体外细胞疾病模型，如退化小泡的轴突的比例降低或断裂轴突的比例降低，则候选药物具有治疗或预防神经元退化疾病的用途。本发明实施例所提出的筛选药物方法的可行性和可信度高。
【附图说明】
[0016]图1是根据本发明实施例的神经元经过激光切断前后的效果图；
[0017]图2是根据本发明实施例的神经元经过激光切断后不同时间点的突出相差图；
[0018]图3是根据本发明实施例的神经元经过激光切断后，不同时间点具有退化小泡的神经突出的比例；
[0019]图4是根据本发明实施例的神经元经过激光切断后，不同时间点断裂突出的比例；以及
[0020]图5是根据本发明实施例的以制备神经元细胞退化疾病模型为例，制备体外细胞疾病模型的方法流程图。
【具体实施方式】
[0021]下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0022]在以下实施例中，以制备神经元细胞退化疾病模型为例详细描述制备体外细胞疾病模型的方法
[0023]实施例1制备方法
[0024]本发明将神经元培养在玻璃底皿的细胞培养皿中，这种培养皿可以是普通的激光共聚焦观察的培养皿，如Nunc?Glass Bottom Dishes(Thermo Scientific);或者直接将多聚赖氨酸处理的60 X 60mm的盖玻片铺到6孔板中培养细胞，再将盖玻片转移到铝制的chamber中，加入合适的培养基用于激光切割。将神经前体细胞球(神经球)接种到培养皿中诱导分化，在经过4-5天的分化后，神经球的周围爬出很多轴突，进而对整个神经球的轴突进行激光切割，从而得到与胞体分离的神经元轴突(或突出)；也可以将神经前体细胞消化成单细胞，接种到培养皿中，分化出胞体较为均匀的神经元细胞，进而对单个神经元或多个神经元的轴突(或突出)进行切割。
[0025]将培养皿置于激光显微切割系统(PALM MicroBeam system，Zeiss)的载物台上，调整焦距并找到合适的视野。调整切割激光:(I)调整激光切割平面:在培养皿的无细胞区域画出切割线，沿着画好的切割线开始激光切割并在软件上调整focus的参数，直至能在玻璃底划出淡淡的印记，focus—般在50-60之间；(2)调整激光能量强度:待调整好切割平面后，将视野移动到非实验的细胞区，横跨细胞画出切割线，沿着画好的切割线开始激光切割并不断调节软件上的power值，直至能切断被画线的细胞而不冲起周围细胞为宜，Power参数一般为40?50之间较好。(3)待激光调试完毕，将视野移动到实验区，画出切割线，在(I)和(2)所得到的focus和power值下，沿着画出的切割线进行激光切割，即可将神经轴突(或突出)与胞体进行分离，远离胞体的轴突很快会发生退化。
[0026]本实施例中使用的激光显微切割系统，不需要对共聚焦显微镜的光路系统进行改装，保证了切割的稳定性并且不对共聚焦显微镜产生影响，而切割的位置只要在适当的位置做好标记，可以很方便的在共聚焦显微镜中找到切割区域并进行观察。激光切割诱导的退化不同于药物或转入有害基因诱导的退化，本实施例中的方法可以在软件中选择适合的画线工具，画出各种形状，激光即可沿着画好的形状轨迹进行切割，也就是说，本实施例的方法可以对局部区域的神经细胞诱导退化，而这个区域的大小可以根据发明人的意愿进行控制。
[0027]实施例2
[0028]实施例1的方法的检测兼容性好，经过激光切割的神经元(玻璃底培养皿中)可以继续进行培养，进而观察神经退化的进程;也可以置于共聚焦显微镜下进行实时观察。
[0029]其中，神经元经过激光切断后，效果图如图1所示，其中标尺为20微米，不同时间点的突出相差图如图2所示，其中标尺为20微米，不同时间点具有退化小泡的神经突出的比例如图3所示，不同时间点断裂突出的比例如图4所示。综合图1?图4结果可以看出，本发明实施例的方法获得的神经元退化指标显著。
[0030]另外，为了方便理解，以制备神经元细胞退化疾病模型为例，发明人将制备体外细胞疾病模型的方法流程图表示在图5中。
[0031]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0032]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1.一种制备体外细胞疾病模型的方法，其特征在于，包括: 采用激光显微切割系统对细胞的预定部位进行线性切割，以便获得所述体外细胞疾病模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞预先在玻璃底皿或铺有多聚赖氨酸的盖玻片上培养预定时间。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体外细胞疾病模型是细胞损伤疾病模型。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞损伤疾病模型是神经元细胞退化疾病模型。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对细胞的预定部位进行线性切割是通过如下操作实现的: (1)通过调整Focus参数来调整激光切割平面，直至在所述玻璃底皿或所述盖玻片的无细胞区域的底面划出清晰印迹，所述Focus参数为50?60; (2)通过调整Power参数来调整激光切割能量，直至在非实验细胞区实现第一预定部位的线性切割而不影响周边细胞，所述Power参数为40?50;以及 (3)在步骤(2-1)和(2-2)中获得的Focus和Power的激光参数下，在实验细胞区的第二预定部位实现线性切割。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二预定部分是所述细胞的特化结构， 任选地，所述特化结构为伪足。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二预定部分是所述神经元细胞的轴关O8.—种体外细胞疾病模型，其特征在于，是通过权利要求1?7任一项所述的方法制备的。9.一种筛选药物的方法，其特征在于，包括: 将候选药物与权利要求8所述的体外细胞疾病模型接触； 通过监控所述接触前后，所述细胞表型或功能的变化，判断所述候选药物是否能够用于治疗或预防细胞损伤疾病。10.一种筛选药物的方法，其特征在于，包括: 将候选药物与权利要求8所述的体外细胞疾病模型接触，所述体外细胞疾病模型是神经元细胞退化疾病模型；以及 监控在所述接触前后，具有退化小泡的轴突的比例或断裂轴突的比例， 其中，所述退化小泡的轴突的比例降低或断裂轴突的比例降低是药物具有治疗或预防神经元退化用途的指示。
【文档编号】C12Q1/02GK105861482SQ201610209539
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】刘兴国, 包飞翔, 石红岩, 龙祺
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院