水稻褐飞虱为害诱导型启动子区域的分离及表达模式鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及褐飞虱为害诱导型水稻启动子的分离及表达模式鉴定。筛选得到一个在水稻绿色组织特异性表达，且表达水平受褐飞虱为害上调的基因。通过PCR的方法从水稻基因组中分离该基因的启动子区域，将这个启动子命名为PTG3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用PTG3与GUS报告基因构建融合表达基因，通过农杆菌介导的方法转化水稻中花11。对获得的转基因水稻苗在接种褐飞虱若虫前后的GUS组织化学染色和定量RT-PCR检测，确定PTG3启动子在褐飞虱为害的条件下可以显著提高下游基因的表达水平，该特征在水稻抗虫基因工程育种中具有潜在应用价值。
【专利说明】
水稻褐飞虱为害诱导型启动子区域的分离及表达模式鉴定
技术领域
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻褐飞虱为害诱导型启动子区域 的分离及表达模式鉴定。所述的褐飞虱为害诱导型启动子区域为一个DNA片段，它能够在 褐飞虱取食诱导条件下特异性增强基因的表达水平。
【背景技术】
[0002] 植物在生长过程中，会受到多种虫害如褐飞虱、二化螟及粘虫等的侵害。褐飞虱 是水稻的主要害虫之一，它刺吸水稻可能导致两种后果：（1)褐飞虱刺吸水稻茎、叶组织 韧皮部汁液，导致水稻水份大量丧失，引起稻株瘫痪倒伏，同时褐飞虱还可以作为中间寄 主传播病毒病害，严重时水稻会减产甚至失收。（2)水稻对其产生抗虫防御反应（Erd et al.，2012)，产生杀虫物质或毒性蛋白（娄永根等，1997)，杀死害虫或阻止其对水稻进行为 害。利用抗性基因资源改良植物的抗虫性，是预防虫害同时又保护环境的根本出路。
[0003] 采用转基因技术将抗性基因导入植物是目前改良农作物抗虫性的主要途径之一。 但是目前的基因工程体系存在一些不足，很重要的一点是转化载体中使用的启动子大多是 组成型表达启动子，如玉米Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子。这不仅给植物体带来 代谢负担，使植物在不需要发生抗虫反应时大量表达外源蛋白，造成了浪费；严重的还造 成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡（Karlowski et al.，2003 ;Miyao et al. , 2003 ；Durrant and Dong, 2004)〇
[0004] 为了解决以上问题，
【申请人】试图使用特异性启动子调控目标基因的表达。启动子 是一段对基因表达起调控作用的DNA片段。启动子在原核生物和真核生物中均存在，它是 一段对基因转录的时间、空间和表达量起调控作用的DNA序列。在原核和真核生物中，启动 子的结构有所不同。真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有其识别的不同启动子。RNA聚 合酶II负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，结构最为复杂。人们比较了上百个聚合 酶II识别的真核启动子的序列，发现了一些共同的结构。如1)帽子位点，即转录起始位点， 其碱基大多为A，两侧各有若干个嘧啶核苷酸，其中A为转录起点。2) TATA框，又称Hogness 框或Goldberg-hogness框，其一致序列为：TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和 C碱基对的序列组成。TATA框决定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的 部位。3) CAAT框，其一致序列为GGC⑴CAATCT。该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转 录效率的急剧降低，CAAT框可能控制着转录起始的频率。4)增强子（enhancer)，又称为远 上游序列，一般都在-IOObp以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。 另外，不同的启动子上还有其他不同的顺式（cis)调控元件，它们是反式（trans)调控因子 或转录调控蛋白的结合位点。不同的反式调控因子/转录调控蛋白特异性的与顺式调控元 件结合，对基因的表达时间，空间或表达量进行特异性的调控。
[0005] 特异性的启动子一般分为两类，一类是受诱导表达的特异启动子，称之为诱导型 启动子，另一类是组织特异性表达的启动子，称之为组织特异型启动子。诱导型的启动子对 外界的某些物质，如虫害、病原物、化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表 达。组织特异型的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。特异性的启动子可避免基因过 量表达对植物体产生伤害。因此，利用水稻来源的褐飞虱取食诱导表达的启动子驱动抗性 基因的表达，是改良水稻抗虫性的最佳选择之一。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是克隆一个水稻基因0s01g73940启动子PT(J^ DNA片段，对水稻中分 离克隆的褐飞虱抗性启动子Pra区段进行功能验证，该片段包含对褐飞虱产生应答反应的 元件，探索利用这个启动子调控抗性基因的表达，从而改良水稻的抗虫性。
[0007] 根据本
【申请人】所在的作物遗传改良国家重点实验室褐飞虱取食水稻的全基因组 表达芯片数据及水稻品种明恢63和珍汕97全基因组全生育期表达谱芯片数据，挑选出一 个主要在绿色组织表达，在胚乳中不表达或者表达量低，并且受褐飞虱取食诱导表达上调 的基因0s01g73940。通过比较在褐飞虱高抗水稻品种RH和褐飞虱敏感水稻品种TNl中诱 导后基因的表达情况，找出褐飞虱为害诱导特异性表达的基因。确定该基因的第一个起始 密码子ATG，针对其上游2Kb左右的区间设计引物，选择褐飞虱取食后在RH和TNl中基因 表达上调倍数较高的水稻品种的基因组作为模板，克隆该基因启动子片段并命名为P ra。将 戸"；3构建到启动子验证载体DX2181b (图1)上，形成终载体DX2181b-P TC3 (图2)。通过农杆 菌介导法将DX2181b-PTS3导入粳稻品种中花11，对获得的转基因苗接种褐飞虱若虫，并对 GUS组织化学染色和表达量进行检测，确定Ptc3启动子的表达模式。在褐飞虱为害后，转基 因植株中⑶S表达水平上调明显，证明该启动子片段确实为一个褐飞虱诱导型启动子。
[0008] 在本发明的实施例部分，
【申请人】阐述了验证Pra启动子的分离过程以及其功能特 点。
【附图说明】
[0009] 序列表SEQ ID NO :1是本发明分离Ptc3启动子的核苷酸序列。
[0010] 图1 :是本发明应用的启动子验证载体DX2181b结构示意图。
[0011] 图2 :是本发明制备的重组表达载体DX2181b-PTG3的T-DNA插入区的结构示意 图。
[0012] 图3 :载体pEASY_T3vector结构示意图
[0013] 图4 :PT(；3转基因植株在褐飞虱为害和JA处理24h后⑶S报告基因转录水平检测。 附图标记说明：图4中的A)图是转基因植株接种褐飞虱若虫24h后的形态；图4中的B)图 是转基因植株经过茉莉酸（JA)处理24h后的形态。
[0014] 图5 :是Prc3转基因植株在褐飞虱为害和经过JA处理24h后的⑶S化学组织染色 检测结果。
【具体实施方式】
[0015] 本发明的前期研究工作结果显示在褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal)取食水稻 的条件下，可特异性的诱导水稻内源基因0s01g73940的表达。前期研究还发现，该基因启 动子上含有与水稻转录因子WRKY71的结合位点WRKY710S，推测在水稻对病原微生物的防 卫反应中起重要作用。
[0016] 以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期研究工作结果的基础 上验证TG3启动子（P tc3)功能的方法和结果。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术 人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做 出各种修改，以使其适用各种用途和条件。
[0017] 实施例1 :PTS3启动子的结构分析
[0018] 米用启动子分析软件 TSSP (http://www. softberry. com)，PROSCAN (http:// bimas. dcrt. nih. gov/molbio/proscan), PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)中的 Signal Scan 分析工具（http://www. dna. affrc. go. jp/ PLACE/signalscan.html)，TESS (http ://searchlauncher.bcm. tmc. edu/seq-search/ gene-search.html), Match I. 0(http ://www. gene-reRUIation, com/CRi-bin/pub/ pr〇Rrams/match/bin/match. cgi)以及 AliBata2. I(http://www. Rene-reRulation. com/ pub/programs/alibata2/index, html)等分析 0s01g73940 基因启动子的结构。发现在 0s01g73940启动子的上游-540bp处是TATA框，-552bp是与转录频率有关的CAAT框。
[0019] 实施例2 :0s01g73940基因启动子Ptc3的褐飞虱诱导功能区分析
[0020] 1··分离0s01g73940基因启动子区域
[0021] 用OsOlg73940基因启动子特异性的PCR引物Ptc3-F和Pts3-R(引物序列见表1或 SEQ ID NO :2和3所示）扩增0s01g73940基因启动子的完整DNA片段Ptc3，序列长度为 1953个碱基，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。PCR引物Ptc3-F含有限制性内切酶 Hind III位点，引物Ptc3-R含有限制性内切酶Pst I位点。PCR扩增获得的DNA片段克隆 到PEASY-T3Vector载体（Transgene公司，图3)。采用SP6和T7通用引物（上海生工生物 工程有限公司）和美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒（Big Dye Kit)对启动子 片段的克隆进行测序验证。
[0022] 表1本发明中所涉及的引物
[0024] a:下划线代表该引物所加酶切位点。
[0025] 2. ·遗传转化载体的构建
[0026] 水稻遗传转化所使用的载体为DX2181b (图1)，由本实验室叶荣建博士改造，是 验证启动子功能的专用载体。DX2181b携带无启动子的报告基因⑶S(β-glucuronidase， β-葡萄糖醛酸酶）及GFP (Green Fluorescent Protein，绿色焚光蛋白）。转化载体的构 建采用常规酶切连接的方法（Sambrook and Russell, 2001)。主要步骤是：用限制性内切 酶Hind III和Pst I酶切上述Ptc3启动子片段和遗传转化载体DX2181b。酶切完毕，用氯 仿：异戊醇（体积比为24:1)抽提纯化，然后用DNA回收试剂盒回收目的片段。用启动子的 酶切片段和纯化后的DX2181b载体做连接反应，使其置于报告基因 GUS的上游（图2)。通 过酶切筛选阳性克隆，并通过Hind III和Pst I酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆。 将获得的重组质粒命名为DX2181b-PTG3,将该重组质粒电转化导入农杆菌菌株EHA105(Sun et al.，2004)中。
[0027] 3. ·水稻的遗传转化
[0028] 采用农杆菌介导的遗传转化方法（Lin and Zhang，2005)将EHA105菌株携带的 DX2181b_PTG3 载体导入梗稻品种中花 Il(ZHll) (Oryza sativa L ssp.Japonica，中国农业 科学院作物科学研究所公开使用的常规品种），获得转基因植株用PCR的方法进行GUS基因 阳性检测（引物序列见表1)，共获得阳性独立转化植株31株。
[0029] 实施例3 :利用转基因植株检测启动子Prc3的表达模式
[0030] 1.转基因植株的阳性检测
[0031] 将供试的转基因水稻T。代阳性植株的种子，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养 基上发芽以筛选阳性的T 1代植株。具体筛选过程如下
[0032] 1)配制1/2MS培养基并添加潮霉素，使潮霉素的终浓度为50mg/L。
[0033] 2)将需要鉴定的水稻种子去壳，在无菌工作台上进行消毒处理，步骤如下：75% 酒精清洗1分钟，〇. 15%的HgCl2浸泡20分钟，再用灭菌水洗涤数次清除残留HgCl 2。
[0034] 3)将消毒处理好的种子移至含有潮霉素的1/2MS上进行发芽，一周后观察，如果 发芽正常为阳性种子，未发芽的为阴性种子。
[0035] 2.幼苗期褐飞虱接种及JA处理
[0036] 褐飞虱为害接种：取潮霉素发芽阳性植株转移至生根管中，待水稻植株长到三叶 期移栽到温室面包盆内，每个材料种3株（一行）为1个重复，每个材料设3次重复。褐飞 虱诱导处理的材料用网罩起来避免褐飞虱幼虫逃逸，对照不进行处理正常生长，待水稻植 株移栽一周后进行接虫。接入褐飞虱幼虫虫口密度设为7-10头/株，网罩内面包盆灌水量 不要太多，高于土壤表面〇. 5cm即可，接虫24h后对植株地上部分进行取样。
[0037] 茉莉酸（JA)喷施处理：取潮霉素发芽阳性植株移栽至生根管中，待水稻植株长到 三叶期移栽到温室水培生根管内，每个材料的3个植株放于一根生根管内为1个重复，每个 材料设3次重复。JA处理与对照分开放置，水稻植株缓苗一周后进行诱导。水稻植株进行 水培液培养（Yoshida et al.，1976):进行诱导处理的品种，使用的水培液含有100 μmol/ mL的JA，同时将配制好的含JA的水培液装入小型喷雾器中，以喷雾法进行诱导，确保药剂 充分喷洒覆盖在所有处理的稻株表面，每隔2h喷施1次，共喷施3次。对照用水培处理，24h 后对地上部分进行取样。
[0038] 水稻样品总RNA的抽提采用Trizol法，具体步骤如下：
[0039] 1)取水稻组织于液氮中研磨成粉，然后转移至含有Iml Trizol (购自Invitroge 公司）试剂的I. 5ml离心管中，用手轻摇勾，静置IOmin使样品与Trizol试剂充分反应；
[0040] 2)加入200 μ 1氯仿并轻轻上下颠倒摇匀后静置lOmin，使其充分反应；
[0041 ] 3) 4°C，12000rpm，冷冻离心 15min ;
[0042] 4)吸取450 μ 1上清至另一个新的I. 5ml离心管；
[0043] 5)加入450 μ 1异丙醇，轻轻混匀，室温静置IOmin ;
[0044] 6)在 4°C，12000rpm，冷冻离心 15min 后，弃上清；
[0045] 7)加入75 %乙醇700 μ 1并轻轻上下颠倒数次；
[0046] 8)4°C，7500rpm冷冻离心5min，弃上清并吸干残余乙醇后，静置5min左右；
[0047] 9)加入灭菌DEPC水20 μ 1，然后置于55°C水浴锅中lOmin，使RNA充分溶解，后立 即置于冰上5min，最后保存在-70°C备用。
[0048] 利用S叩erScnpd III RT反转录酶（购自Invitrogen公司）反转录获得cDNA，其 主要步骤如下：
[0049] 1)测RNA浓度，取2 μ g RNA与DEPC水配制成5 μ 1溶液；
[0050] 2)加入DNase I IOXBuffer 0·5μ1 和DNase I 0.54 1，37。(：培养箱15111丨11去除 DNA
[0051] 3) 70°C，lOmin，灭活 DNase I
[0052] 4)加入01丨8〇((11')1以1和(1犯130.5以1后，65°(：处理51^11后立即置于冰上21^11， 用手指轻弹后稍作离心
[0053] 5)加入如下所述的试剂或DEPC水：
[0054] 5 X !:s Binlcr 2 μL 0.1 M ΙΤΓΓ 0.5 μΙ RRI 0.25 μL SSIII 0.25 μ] DIiPC 水 0.5 μ I
[0055] 在 50°C 30min。70°C -75°C，5-10min 灭活，冰上 2min，离心，-20°C保存。
[0056] 实时荧光定量PCR使用ABI7500(Life TechnologiesTM)检测系统，使用试剂盒 为 FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) (Roche)。反应体系：IOOng/μ L cDNA 1 μ L，Mixture 5 μ L，10 μ mol/L 左右引物各 0· 2 μ L (所有引物序列见表1)，CldH2O 3. 6 μ L。 反应程序为：95°C 10min，95°C 10s，60°C 36s，40 个循环。
[0057] 定量PCR分析结果表明，Prc3启动子在褐飞虱取食24h后可诱导性提高报告基因 的表达水平。P tc3转基因水稻在褐飞虱接种24h后，3个独立的转基因家系GUS报告基因转 录水平平均增加2. 78倍，最高增加4. 38倍。与CaMV35S启动子相比较，在未处理条件下， Prc3驱动⑶S基因平均表达水平是CaMV35S启动子的1/27 ;接虫诱导24h后平均表达水平 可达CaMV35S启动子的1/7 (图4中的A图）。JA激素处理24h后比未处理24h Pts3调控 的⑶S基因表达量平均上调2. 68倍，最高为3. 17倍。与CaMV35S启动子相比较，在未处理 的条件下，GUS基因平均表达水平是CaMV35S启动子的1/30 JA处理24h后平均表达水平 可达CaMV35S启动子的表达水平的1/7 (图4中的B图）。
[0058] 3.⑶S组织染色定性检测
[0059] 将褐飞虱为害和JA处理24h的转基因植株的叶片和叶鞘样品剪成合适大小，浸没 于⑶S染色液中，抽真空后置于37°C恒温培养箱内染色过夜。随后，用无水乙醇脱色2次， 每次lh，最后用75%乙醇脱色至叶片绿色脱尽，然后用莱卡解剖镜观察拍照。检测结果如 图5所示。转基因植株在褐飞虱为害和JA处理24h后，GUS染色有不同程度的增加，该定 性检测结果与定量分析结果基本一致。
[0060] 综合以上研究结果，启动子Ptc3是一个褐飞虱为害和JA处理特异性诱导的启动 子，预期可以在水稻抗虫和抗病基因工程中具有较好应用前景。
[0061] 本发明涉及的水稻遗传转化过程、培养基及相关试剂配制方法如下：
[0062] 1.试剂和溶液缩写
[0063] 本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下： 6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基氨基噪呤）；CN(Carbenicillin，駿节青霉素）； KT(Kinetin，激动素）；NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸）；IAA(Indole-3_acetic acid，吲噪乙酸）；2, 4_D (2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid，2, 4-二氯苯氧乙酸或简称 2, 4_D) ;AS(Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋 白）；HN(Hygromycin B，潮霉素）；DMS0(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚讽）；N6max(N6大量 元素成分溶液）；N6mix(N6微量元素成分溶液）；MSmax(MS大量元素成分溶液）；MSmin(MS 微量元素成分溶液）
[0064] 2.溶液配方
[0065] I) N6培养基大量元素母液（按照10倍浓缩液10 X配制）：
[0066] 硝酸钾（KNO3) 28.3克 磷酸二氢钾（KH2PO4) 4.0克 硫酸铵（(NH4)2SO4) 4.63 克 硫酸镁（MgS04_7H20) 1.85 克 氯化钙（CaCl2QH2O) 1.66 ?
[0067] 将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。
[0068] 2) Ν6培养基微量元素母液（按照100倍浓缩液100 X配制）
[0069] 碘化钾（KI) 0.08 硼酸（H3BO3) 0.16 硫酸锰（MnSO4WH2O) 0.44 g 硫酸锌（ZnSO4JH2O) 0.15 ^
[0070] 将上述试剂在20-25摄氏度下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。
[0071] 3)铁盐（Fe2 · EDTA)贮存液（按照100X浓缩液配制）
[0072] 将3. 73克乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA · 2H20)和2. 78克FeSO4 · 7H20分别溶解， 混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70°c温浴2小时，4°C保存备用。
[0073] 4)维生素贮存液（按照100X浓缩液配制）
[0074] 烟酸（Nicotinicacid) 0.1 克 维，(Thiamine.HGI) 0,:1 克 维( Pyridoxine HCI) 0.1 ? 甘氨酸（Glycine) 0.2克 肌醇（Inositol) 10 克
[0075] 加蒸馏水定容至1000毫升，4°C保存备用。
[0076] 5) MS培养基大量元素母液（MSmax母液）（按照10 X浓缩液配制）
[0077] 硝酸铵CNH4NO3) 16.S克 硝酸钾 19.0克 磷酸二氢钾 1.7克 硫酸镁 3.7克 氯化钙 4.4克
[0078] 将上述试剂在20-25Γ温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
[0079] 6) MS培养基微量元素母液（MSmin母液）（按照100 X浓缩液配制）
[0080] 硫酸锰（MnSO4 ·4Η20) 2_23 克 硫酸锌（ZnSO4 ·7Η20) 0.86 克 硼酸⑴3Β03) 0_62克 碘化钾（KI) 0.083克 钼酸钠 CNa2MoO4QH2O) 0.025 克 硫酸铜（CuS04.5H20) 0.0025 克 氯化钴（CoCIr6H2O) 0.0025 克
[0081] 将上述试剂在20-25Γ温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
[0082] 7) 2, 4-D贮存液（1毫克/毫升）的配制：
[0083] 称取2, 4-D 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加 10毫升蒸馏水溶 解完全后定容至100毫升，于20-25Γ温度下保存。
[0084] 8) 6-BA贮存液（1毫克/毫升）的配制：
[0085] 称取6-BA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶 解完全后定容至100毫升，20-25°C温度保存。
[0086] 9)萘乙酸（NAA)贮存液（1毫克/毫升）的配制：
[0087] 称取NAA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加 10毫升蒸馏水溶解 完全后定容至100毫升，4°C保存备用。
[0088] 10)叼丨噪乙酸（IAA)贮存液（1毫克/毫升）的配制：
[0089] 称取IAA 100毫克，用1毫升IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解 完全后定容至100毫升，4°C保存备用。
[0090] 11)葡萄糖贮存液（0· 5克/毫升）的配制：
[0091] 称取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4°C保存备用。
[0092] 12) AS贮存液的配制：
[0093] 称取AS 0. 392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1. 5毫升离心管内，4°C保存备 用。
[0094] 13) IN氢氧化钾贮存液
[0095] 称取氢氧化钾5. 6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，20_25°C温度保存备用。
[0096] 3.用于水稻遗传转化的培养基配方
[0097] 1)诱导培养基
[0098] N6ma>(母液（取已经制备好的IOx浓缩液，下同） 100毫升 N6mix母液（取已经制备好的IOOx浓缩液，下同) 10毫升 Fe2+EDTA贮存液（取已经制备好的IOOx浓缩液，下同） 10毫升 维生素贮存液（取已经制备好的IOOx浓缩液，下同） 10毫升 2,4-D贮存液（取上述制备好的） 2.5毫升 脯氨酸（ProIine) 0.3克 CH 0.6 克 蔗糖 30克 Phytagel 3 ft
[0099] 加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9,煮沸并定容至1000毫升，分 装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口后按常规方法灭菌（121°C下灭菌25分钟，下述的 培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同）。
[0100] 2)继代培养基
[0101] N6max 母液 ClOx ) 100毫升 N6mix 母液（IOOx ) 10毫升 Fe21EDTA 贮存液（.IOOx ) 10毫升 维生素贮存液ClOOx ) 10毫升 2, 4-D贮存液 2.0毫升_ 脯氨酸 0.5克 CH 0:，6克 蔗糖 30党 Phytagel 3.克
[0102] 加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9,煮沸并定容至1000毫升，分 装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。
[0103] 3)预培养基
[0104] W6max 母液（IQx ) 12.5毫升 NGmix l：M (IOOx ) 1,25毫升
[0105] Fe2+EDTA 贮存液（IOOx ) 2.5毫升 维生素贮存液（IOOx) 2.S毫升 2,4-D贮存液 0.75毫升 CH 0.15 iAl 蔗糖 5克 琼脂粉 1.7S克
[0106] 加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6,封口，按上述方法灭菌。
[0107] 使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒 入培养皿中（25毫升/皿）。
[0108] 4)共培养基
[0109] N6max !：M (l〇x ) 12.5'd:/l· N6mix i'M (IOOx > 1.25'^ ii' Fe2+EDTACM^f(IOOx) 2.5 毫升 维生素贮存液（IOOx) 2.5毫升 2.4- D贮存液 0.75毫升 CH 0.2 克 蔗糖 5克 琼脂粉 1.751AL
[0110] 加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6,封口，按上述方法灭菌。
[0111] 使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒 入培养皿中（25毫升/每皿）。
[0112] 5)悬浮培养基
[0113] N6max母液（IBx) 5毫升 N6mix (IOOx ) 0.5'd/l· Fe2+EDTA 贮存液（IOOx ) 0.5毫升 维生素贮存液（IOOx) 1毫升 2.4- D贮存液 0.2毫升 CH 0.(38 ',V 蔗糖 2宾
[0114] 加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5. 4,分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按 上述方法灭菌。使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
[0115] 6)选择培养基
[0116] N6max母液（IOx ) 2S毫升 N6mix 母液（IOOx ) 2.5毫升 Fe2+EDTA 贮存液（IOQx ) 毫升
[0117] 维生素 C存液（IOOx) 2,5毫升 2, 4-D贮存液 0.625毫升 CH 0.155? 蔗糖 7.5克 琼脂粉 1.:75兖
[0118] 加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6. 0,封口，按上述方法灭菌。
[0119] 使用前溶解培养基，加入250微升HN (50毫克/毫升）和400微升CN (250毫克/ 毫升）分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。（注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400 晕克/升，第二次及以后选择培养基羧节青霉素浓度为250晕克/升）。
[0120] 7)预分化培养基
[0121] N6max母液（IOx ) 25毫升 N6mix IiM (IOOx ) 2.5'?/?· Fe2+EDTA 贮存液（IOOx ) 2.5毫升 维生素贮存液（IOOx) 2.S毫升 CH 0.15'? 蔗糖 7.5克 琼脂粉 1.75克
[0122] 加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9,封口，按上述方法灭菌。
[0123] 使用前溶解培养基，250微升HN (50晕克/毫升）250微升CN (250晕克/毫升）， 分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。
[0124] 8)分化培养基
[0125] N6max 母液（IOx ) 100毫升 N6mix Ι：]·???： (IOOx ) lQ-'r； I i' Fe2+EDTA IS存液 ClOOx ) 10毫升 维生素贮存液（IOOx) 10毫升 6-BA贮存液 2毫升 KT贮存液 2毫升 NAA贮存液 0.2毫升 IAA贮存液 0.2毫升 CH I iZiL 蔗糖 30克 Phytagei 3 ?
[0126] 加蒸馏水至900毫升，IN氢氧化钾调节pH值到6. 0。
[0127] 煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（50毫升/瓶），封口，按 上述方法灭菌。
[0128] 9)生根培养基
[0129] MSmax l:j:液（1?Χ) 50'i ?γ MSmix 丨I).液（100Χ) 5'H Fe2+EDTA贮存液（IOOX) 5毫升 维生素贮存液（100X) 5毫升 蔗糖 20克 Phytagel 3 it
[0130] 加蒸馏水至900毫升，用IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。
[0131] 煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中（25毫升/管），封口，按上述 方法灭菌。
[0132] 4.农杆菌介导的遗传转化步骤
[0133] 4.1愈伤诱导
[0134] 1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯 化汞（HgCl2)种子表面消毒20分钟；
[0135] 2)用灭菌水洗种子8次；
[0136] 3)将种子放在诱导培养基上；
[0137] 4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1°C。
[0138] 4. 2愈伤继代
[0139] 挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温 度 25±1°C。
[0140] 4. 3预培养
[0141] 挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度 25±1°C。
[0142] 4.4农杆菌培养
[0143] 1)在带有对应抗性选择的LA培养基（LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等， 分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等（译），科学出版社，2002,北京）上预培养农杆菌 EHA1052 天，温度 28°C ;
[0144] 2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。
[0145] 4. 5农杆菌侵染
[0146] 1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
[0147] 2)调节农杆菌的悬浮液至0D6。。= 0. 8-1. 0 ;
[0148] 3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
[0149] 4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20。。。
[0150] 4. 6愈伤洗涤和选择培养
[0151] 1)灭菌水洗涤愈伤7-8次；
[0152] 2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素（CN)的灭菌水中30分钟；
[0153] 3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
[0154] 4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。
[0155] 4. 7 分化
[0156] 1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；
[0157] 2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26°C。
[0158] 4. 8 生根
[0159] 1)剪掉分化时产生的根；
[0160] 2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。
[0161] 4. 9 移栽
[0162] 1)洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天 保持水分湿润。
[0163] 2)转化粳稻品种中花11，得到转基因单株T。代植株。
[0164] 参考文献
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【主权项】
1. 一种受褐飞虱为害诱导的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所不。2. -种在褐飞虱为害条件下，提高外源基因在转基因水稻中表达水平的方法，其特征 在于，利用序列表SEQ ID NO :1所示的启动子，与外源基因构建植物表达载体，通过农杆菌 介导的遗传转化方法，将所构建的表达载体导入水稻受体中，在褐飞虱为害诱导的条件下， 该外源基因在转基因水稻中表达量将显著上升。3. 权利要求1所述的启动子在提高外源基因在转基因水稻中表达中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK105861501SQ201510033997
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】陈浩, 关丽梅
【申请人】华中农业大学