中红侧沟茧蜂MmedCOⅠ基因及其应用
【专利摘要】本发明涉及拟寄生物检测领域，具体提供了中红侧沟茧蜂MmedCOⅠ基因序列(如SEQ ID No.1所示)，且基于该序列设计了针对该序列的特异性扩增引物，并提供了一种快速检测中红侧沟茧蜂寄生棉铃虫幼虫的分子水平的方法，有利于实现快速准确统计寄生蜂产卵量或寄主幼虫寄生率，该发明能在寄主幼虫被寄生24小时后有效的检测出寄主幼虫被寄生的情况，缩减了检测时间，同时避免了因寄主幼虫不正常死亡造成的统计误差，提高了统计的准确性。
【专利说明】
中红侧沟茧蜂MmedCO I基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及拟寄生物检测领域，具体地说，涉及一种中红侧沟茧蜂MmedCO I基因 及其应用。
【背景技术】
[0002] 中红侧沟苗蜂Microplitis mediator (Haliday)是一种幼虫寄生蜂，其寄主范围 广泛，涉及鳞翅目夜蛾科和尺蛾科等40多种昆虫，包括棉铃虫（Helicoverpa armigera)、 粘虫（Mythimna separata)和小地老虎（Agrotis ypsilon)等重大农业害虫，在害虫综合 治理策略中扮演着重要的角色。中红侧沟茧蜂在田间对寄主幼虫具有较高的寄生效果，调 查发现中红侧沟茧蜂对棉铃虫各世代的平均自然寄生率可达22. 9%。
[0003] 在寄生蜂寄生行为研究中，寄生蜂寄生寄主幼虫的寄生率是研究的重要内容，通 常采用传统的统计方法计算寄生率，即记录寄主幼虫被寄生蜂寄生后寄生蜂的结茧情况。
[0004] 然而这种方法需要将寄主幼虫持续饲养直至寄生蜂结茧，从而增加了调查时间和 成本。另外，寄生蜂在寄主幼虫体内需要发育较长的时间，寄主幼虫在发育过程中的不正常 死亡，最终会影响统计结果。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种中红侧沟茧蜂细胞色 素 C氧化酶亚基I基因 （MmedCO I )及其应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供中红侧沟茧蜂MmedCO I基因，所述 MmedCO I基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 本发明还提供了用于扩增前述基因序列核心片段的特异性引物，所述特异性引物 为：
[0008] MmedCOI-F :5'-ATTCGTTTGGAATTAGGTATACCAGGTAG-3' ；
[0009] MmedCOI-R :5'-ACAGTTCATCCAGTTCCAACACCAAC-3'。
[0010] 本发明还提供了一种快速检测中红侧沟茧蜂寄生棉铃虫幼虫的方法，所述方法利 用前述特异性引物对棉铃虫幼虫组织中的DNA进行PCR扩增，通过检测是否得到扩增产物， 判断棉铃虫幼虫是否被中红侧沟茧蜂寄生。
[0011] 进一步地，所述方法包括如下步骤：
[0012] (1)将棉铃虫幼虫用组织研磨器充分研磨，提取组织中全部DNA ; _3] (2)以上述DNA为模板，利用前述特异性引物，进行PCR反应；
[0014] (3)取PCR反应扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测；
[0015] (4)根据电泳条带中是否出现中红侧沟茧蜂MmedCO I基因片段的特征条带 (275bp)，判断棉铃虫幼虫是否被中红侧沟茧蜂寄生。
[0016] 更进一步地，所述PCR反应的反应条件为：94°C预变性4min;94°C变形30s，58°C 退火3〇8,72°0延伸458,40个循环；721：终延伸51^11。
[0017] 更进一步地，所述PCR反应的反应体系为：
[0018] 灭菌水 17. 25 μ L，10 X EasyTaqbuffer 2. 5 μ L，dNTPs (2. 5mM) 2 μ L，MmedCOI-F 引 物 1 μ L，MmedCOI-R 引物 1 μ L，基因组 DNA 1 μ L，EasyTaqDNA 聚合酶(λ 25 μ L。
[0019] 本发明还提供了前述中红侧沟茧蜂MmedCO I基因在鉴定中红侧沟茧蜂中的应 用。
[0020] 本发明还提供了前述中红侧沟茧蜂MmedCO I基因在计算中红侧沟茧蜂寄生棉铃 虫寄生率中的应用。
[0021] 所述应用具体为：
[0022] 单头提取中红侧沟茧蜂寄生后的棉铃虫幼虫组织中全部DNA，PCR检测DNA样品中 是否能够扩增出中红侧沟茧蜂CO I基因特征条带，阳性检出结果除以检测样品总数即为 中红侧沟茧蜂寄生寄主幼虫的寄生率。
[0023] 本发明还提供了含有前述特异性引物的检测试剂盒。
[0024] 所述试剂盒包括：
[0025] Taq DNA聚合酶，聚合酶缓冲液（Buffer)，dNTPs，灭菌水（CldH2O)，特异性引物F/ R0
[0026] 本发明的有益效果在于：
[0027] 本发明首次提供了中红侧沟茧蜂MmedCO I基因序列，且基于该序列设计了针对 该序列的特异性扩增引物，并提供了一种快速检测中红侧沟茧蜂寄生棉铃虫幼虫的分子水 平方法，有利于实现快速准确统计寄生蜂寄生寄主幼虫的寄生率，该发明能在寄主幼虫被 寄生24小时后有效的检测出寄主幼虫被寄生的情况，缩减了检测时间，同时避免了因寄主 幼虫不正常死亡造成的统计误差，提高了统计的准确性。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例3中MmedCOI-F/MmedCOI-R引物对中红侧沟茧蜂及其寄主与 非寄主幼虫DNA扩增产物的凝胶电泳图。
[0029] 图2为本发明实施例3中MmedCOI-F/MmedCOI-R引物对中红侧沟茧蜂不同浓度 DNA样品扩增产物的凝胶电泳图。
[0030] 图3为本发明实施例4中MmedCOI-F/MmedCOI-R引物检测棉铃虫幼虫DNA样品中 MmedCO I基因扩增产物的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032] 实施例1中红侧沟茧峰CO I基因的获得
[0033] 登陆NCBI网站下载获得已登录的膜翅目昆虫CO I基因核酸序列，以该序列为 "Query"序列，通过BioEdit软件的本地BLAST功能，检索本实验室前期构建的中红侧沟茧 蜂转录组数据库，获得CO I基因同源序列，命名为Mmed CO I。
[0034] 目的基因序列与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对，发现目的基因与昆虫CO I 家族成员具有高度的序列相似性，其中，与Cotesia vestalis CO I氨基酸序列的一致性 为79%。因此判断Mmed CO I基因为CO I基因。
[0035] 实施例2用于扩增Mmed CO I基因的特异性引物
[0036] 特异性引物的设计是通过下载棉铃虫、粘虫、甜菜夜蛾等寄主和非寄主昆虫的CO I基因同源序列，利用clustalX2.0软件进行同源比对，根据比对结果查找2个以上碱基不 同的区域作为正反向引物的3'端序列，为了增加引物的特异性，引物长度在20碱基以上， Tm值高于55°C，同时扩增产物片段大小控制在100_300bp左右，根据以上原则共设计出3 对引物，PCR检测发现仅一对引物具有特异性：
[0037] MmedCOI-F :5'-ATTCGTTTGGAATTAGGTATACCAGGTAG-3' ；
[0038] MmedCOI-R :5'-ACAGTTCATCCAGTTCCAACACCAAC-3'。
[0039] 仅利用该对引物能够从中红侧沟茧蜂DNA样品中扩增出275bp的目的条带，经测 序，该目标条带的核酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0040] 实施例3特异性引物的特异性及灵敏性检验
[0041] 特异性检测：
[0042] 分别提取小地老虎、黄地老虎、粘虫、棉铃虫、甜菜夜蛾和中红侧沟茧蜂的基因组 DNA，通过PCR方法检测是否有非特异性条带，如图1所示。结果表明，只有中红侧沟茧蜂 DNA样品出现特异性条带，测序结果表明该条带为靶标序列。
[0043] 灵敏性检测：
[0044] 将中红侧沟茧蜂的DNA样品稀释为不同浓度，检测不同浓度的DNA样品PCR产物， 如图2所示。结果表明即使中红侧沟茧蜂DNA样品含量为0.0 lng也能有效检测到靶标序 列。
[0045] 实施例4 一种快速检测中红侧沟茧蜂寄生棉铃虫幼虫的方法
[0046] 将寄生蜂滞育苗置于培养箱中催化，培养条件为：温度28±2°C，湿度70±10%， 光照16:8(L:D)h。寄生蜂羽化后用10%的蜂蜜水作为补充营养。接种时在称量瓶中放入 棉铃虫2龄幼虫10头，并放入棉铃虫人工饲料，接入1头雌蜂，3次重复。接蜂24h后每个 重复各取出5头棉铃虫幼虫提取DNA检测。
[0047] 将单头棉铃虫幼虫置于I. 5ml离心管中，用组织研磨器将组织充分研磨，参照组 织基因组提取试剂盒（天根）说明书提取组织中的DNA。
[0048] PCR 反应体系为：灭菌水 17. 25 μ L，IOXEasyTaqbuffer 2. 5 μ L， dNTPs (2. 5mM) 2 μ L，MmedCOI-F 引物 1 μ L，MmedCOI-R 引物 1 μ L，基因组 DNA 1 μ L， EasyTaqDNA聚合酶0. 25 μ L。反应程序为：94°C预变性4min，94°C变形30s，58°C退火30s， 72°C延伸45s，40个循环，72°C反应后延伸5min。
[0049] PCR反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，图3 中M泳道为DNA marker BM2000, 1号泳道为阳性对照（寄生蜂DNA为PCR反应模板）2-16 号泳道为检测组（寄生后棉铃虫幼虫DNA为PCR模板），17号泳道为阴性对照（未被寄生 的棉铃虫幼虫DNA为PCR模板）。从图3可以看出，利用MmedCO I基因特异性引物能成功 从寄生蜂DNA中扩增出靶标序列片段，同时检测组中也能扩增出相同大小的核酸片段，阴 性对照无扩增条带。挑取1号、2号、7号和12号泳道对应的序列片段连接至T3载体并测 序，测序结果为表明扩增产物均为MmedCO I序列片段。以上结果表明15头棉铃虫幼虫中 10头被中红侧沟茧蜂寄生。
[0050] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 中红侧沟茧蜂MmedCO I基因，其特征在于，所述MmedCO I基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。2. 用于扩增权利要求1所述基因核心片段的特异性引物，其特征在于，所述特异性引 物为： MmedCOI-F :5'-ATTCGTTTGGAATTAGGTATACCAGGTAG-3' ； MmedCOI-R :5'-ACAGTTCATCCAGTTCCAACACCAAC-3'。3. -种快速检测中红侧沟茧蜂寄生棉铃虫幼虫的方法，其特征在于，所述方法利用权 利要求2所述的特异性引物对棉铃虫幼虫组织中的DNA进行PCR扩增，通过检测是否得到 扩增产物，判断棉铃虫幼虫是否被中红侧沟茧蜂寄生。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 将棉铃虫幼虫用组织研磨器充分研磨，提取组织中全部DNA ; (2) 以上述DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物，进行PCR反应； (3) 取PCR反应扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测； (4) 根据电泳条带中是否出现中红侧沟茧蜂MmedCO I基因片段的特征条带，判断棉铃 虫幼虫是否被中红侧沟茧蜂寄生。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应条件为：94°C预 变性4!1^11;941：变形3〇8,581：退火3〇8,721：延伸458,40个循环；721：终延伸51^11。6. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系为25 μ L体 系： 灭菌水 17. 25 μ L，10 X EasyTaqbuffer 2. 5 μ L，dNTPs (2. 5mM) 2 μ L，MmedCOI-F 引物 1 μ L，MmedCOI-R 引物 1 μ L，基因组 DNA 1 μ L，EasyTaqDNA 聚合酶 0· 25 μ L。7. 权利要求1所述的中红侧沟茧蜂MmedCO I基因在鉴定中红侧沟茧蜂中的应用。8. 权利要求1所述的中红侧沟茧蜂MmedCO I基因在计算中红侧沟茧蜂寄生棉铃虫寄 生率中的应用。9. 含有权利要求2所述特异性引物的检测试剂盒。
【文档编号】C12N15/11GK105861512SQ201510033226
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】王山宁, 张永军, 郑瑶, 彭勇, 路子云, 郭予元
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所