一种T7 RNA 聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法
【专利摘要】本发明主要属于高等生物体基因组编辑技术领域，具体涉及一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法。所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子?sgRNA，将T7启动子?sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处，进行切割，完成基因编辑过程。本发明所述方法利用T7启动子表达sgRNA，简化了CRISPR/Cas9系统的设计步骤，使得更多的人能够快速简便使用CRISPR/Cas9这一基因编辑工具研究感兴趣的基因位点。
【专利说明】一种T7 RNA聚合酶介导的CR I SPR/Cas9基因编辑系统的构建方法
技术领域
[0001]本发明主要属于高等生物体基因组编辑技术领域，具体涉及一种T7RNA聚合酶介导的CRI SPR/Cas9基因编辑系统的构建方法。
【背景技术】
[0002]打靶高等动物基因组位点的基因编辑工具的发现和改造对于基因工程和遗传工程的研究应用都有很大意义。高等生物体的基因网络错综复杂，能改造出一个简便且高效的可适用于高等生物体基因组编辑的工具可以为高等生物遗传研究提供很大的帮助。近年来，细菌中发现的II型CRISPR/Cas9系统正被广泛研究以及应用。
[0003]CRISPR/Cas9系统是由Cas9核酸内切酶和单导向RNA(single guide RNA,sgRNA)组成的，sgRNA上有20bp的引导序列，是与基因组靶序列匹配的。
[0004]细菌的II型CRISPR/Cas系统被广泛应用于基因组编辑中，从酿脓链球菌中分离得到的SpCas9核酸内切酶通过人工修饰的单个引导RNA(single-guide RNA，sgRNA)的导向作用可以打靶DNA序列的5 ’-N20-NGG-3 ’(N代表任何脱氧核苷酸碱基)，N20是与sgRNA的5 ’序列相同的20个喊基，NGG是PAM区(protospacer-ad jacent motif) <Xas9核酸内切酶会在PAM附近的区域切害UDNA双链，造成DNA双链断裂。这种可以人为修饰的导向RNA和基因组中PAM的高发率使得Cas9-sgRNA几乎可以打靶所有的基因元件来实现基因组编辑。
[0005]现阶段，普遍使用的基因编辑技术是将Cas9表达盒与sgRNA表达盒放在一个载体上打靶特定位点，这种方法使更换sgRNA上的引导序列变得复杂，需要通过II型酶酶切和引物退火的方式更换载体上sgRNA中20bp引导序列，构建出一个新的打革El载体，该操作过程繁琐，限制了 CRISPR/Cas9系统的普及与应用。
[0006]现有研究中，已经有学者直接化学合成crRNA:tracrRNA，通过将其与Cas9共显微注射到小鼠受精卵中，成功得到了带有功能性的表达盒的基因敲入小鼠。但是化学合成全长crRNA: tracrRNA难度高并且耗资较高，不是适合广泛推广使用。
[0007]针对上述问题，亟需开发一种简便、高效、成本低且适用于高等生物的基因编辑工具。
【发明内容】
[0008]针对上述问题，本发明提供一种涉及T7RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法，所述方法将T7启动子-sgRNA片段、Cas9表达质粒和T7RNA聚合酶表达质粒共转入细胞，T7RNA聚合酶可以催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点出进行切割。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0010]一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，所述方法基于T7RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子-sgRNA，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处进行切割，完成基因编辑。
[0011 ]进一步地，所述构建T7启动子-SgRNA具体为:选取上游引物与下游引物，以Cas9_sgRNA共表达载体为模板进行PCR反应扩增，得到T7启动子-sgRNA的PCR产物。
[0012]进一步地，所述上游引物包括T7启动子序列、20bp sgRNA引导序列以及20bpsgRNA scaffold序列;所述下游引物为一段与sgRNA scaffold序列3’_5’方向匹配的序列。
[0013]进一步地，构建所述T7RNA聚合酶表达质粒具体为:
[0014]提取细菌BL21菌株的基因组，设计用于扩增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7RNA?014和下游引物了71?嫩pol-R，通过PCR反应得到T7RNA聚合酶PCR产物；
[0015]在所述上游引物T7RNA pol_F中引入BamHI酶切位点，在所述下游引物T7RNA pol-R中引入EcoR頂每切位点；
[0016]利用引入的BamHI和EcoRI酶切位点，将T7RNA聚合酶基因片段克隆进pcDNA3.1( + )载体中，得到T7RNA聚合酶表达质粒。
[0017]进一步地，将T7启动子_sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入HEK293T细胞具体为:利用转染试剂将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒、T7RNA聚合酶表达质粒以及报告载体共转染细胞，红色荧光数代表转染效率，绿色荧光数代表系统的工作效率，通过观察荧光数来检测系统的工作效率。
[0018]本发明的有益技术效果:
[0019](I)本发明利用T7RNA聚合酶专一性识别T7启动子的原理，利用T7启动子启动下游sgRNA的转录，只需合成带有T7启动子序列的sgRNA序列，即可利用PCR反应，将T7-sgRNA以PCR产物的形式转染进入细胞，从而引导Cas9成功打靶基因组位点，发挥CRISPR/Cas9系统的基因编辑功能的同时提供一种更换sgRNA结构中20bp引导序列的简单方法。
[0020](2)本发明将T7RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别的原理与CRISPR/Cas9系统的靶向切割功能结合起来，利用T7启动子表达sgRNA，简化了 CRI SPR/Cas9系统的设计步骤，使得能够快速简便使用CRISPR/Cas9这一基因编辑工具研究感兴趣的基因位点。
[0021](3)本发明将Cas9和T7RNA聚合酶由两个载体分别表达，T7RNA聚合酶能特异性识别并催化T7启动子启动，通过PCR反应得到的大量的“T7启动子-sgRNA”产物，T7启动子启动下游s gRNA转录，成功转录的s gRNA将引导Ca s 9到革E位点处进行切割。
[0022](4)与现有技术相比，本发明所述方法构建方便，适用于高等动物等。
【附图说明】
[0023]图1为构建T7启动子-sgRNA过程中所用上游引物的示意图；
[0024]图2为Cas9表达载体；
[0025]图3为T7RNA聚合酶表达载体。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
[0028]实施例1
[0029]一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，所述方法基于T7RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子-sgRNA，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点出进行切割，完成基因编辑。
[0030]T7RNA聚合酶是一种RNA聚合酶，专门催化5，-3 ’方向的RNA的形成过程;T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，只转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的DNA片段或DNA复制品。
[0031]T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流启动子，启动子功能强大且专一性高，是原核表达的首选启动子。
[0032]所述方法具体为:
[0033](I)构建T7启动子-sgRNA:选取上游引物与下游引物，以Cas9-sgRNA共表达载体为模板进行PCR反应扩增，得到T7启动子-sgRNA(即T7promoter-sgRNA)的PCR产物；
[0034]所述Cas9_sgRNA共表达载体为现有技术中常用的Cas9_sgRNA共表达载体(px330)；
[0035]所述上游引物包括T7启动子序列、20bp sgRNA引导序列以及20bp sgRNAscaffold序列；在本实施例中，所述上游引物为合成的靶向CCR5a位点的上游引物T7-sgRNA(CCR5a)-F，该引物含有T7启动子序列、20bp靶向CCR5a位点的sgRNA引导序列以及20bpsgRNA scaffold序列(如图1所示)；
[0036]所述下游引物(SgRNA-R)为一段与sgRNA scaffold序列3’_5’方向匹配的序列。
[0037](2)T7RNA聚合酶表达质粒的合成:
[0038]提取细菌BL21菌株的基因组，设计用于扩增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7RNApol-F和下游引物T7RNA pol-R，通过PCR反应得到T7RNA聚合酶PCR产物；
[0039]在所述上游引物T7RNA pol_F中引入BamHI酶切位点，在所述下游引物T7RNA pol-R中引入EcoR頂每切位点；
[0040]所述上游引物T7RNApol-F 为:T7RNApol-BamH1-F:GCTGGATCCATGAACACGATTAACATCGCTAAG；
[0041 ]所述下游弓I 物 T7RNA pol_R 为:T7RNA pol—EcoRI—R:GACGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG；
[0042] 利用引入的BamHI和EcoRI酶切位点，将T7RNA聚合酶基因片段克隆进pcDNA3.1( + )载体中，得到T7RNA聚合酶表达质粒，命名为pcDNA3.1-CMV-T7RNA pol(如图2所示)；
[0043 ] (3)将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞具体为:
[0044]I)利用厦门太阳马公司的梭华so-f ast转染试剂，将T7启动子-sgRNA的PCR产物、表达Cas9的载体P113.7-CMV_hSpCas9 (如图3所示)、表达T7RNA聚合酶的载体(pcDNA3.1 -CMV-T7RNA pol)以及报告载体Re.SSA(EFla).CCR5a共转染人胚胎肾细胞HEK293T细胞，红色荧光数代表转染效率(单位面积内红色荧光数越多代表转染效率越高)，绿色荧光数代表系统的工作效率(单位面积内绿色荧光越多代表系统工作效率越高)，通过观察荧光来检测系统的工作效率；
[0045]2)利用T7启动子启动sgRNA的转录，对于sgRNA的转染使用浓度做了梯度试验，并选择工作效率最尚的浓度进彳丁后续的实验；
[0046]3)基因组水平的检测:利用厦门太阳马公司的梭华so-fast转染试剂，将T7_sgRNA的PCR产物、表达Cas9的载体(pll3.7-CMV-hSpCas9)、表达T7RNA聚合酶的载体(pcDNA3.1-CMV-T7RNA pol)以及可以通过puromycin筛选并富集基因编辑过的阳性细胞的报告载体pB-CMV-DsRed-CAG-CCR5a.200bp repeat.Puro-T2A_GFP共转染HEK293T细胞。
[0047]4)转染48h后向培养基(DEME)中加入终浓度为0.3yg/ml的puromycin并每天更换新鲜的培养基(DMEM)以去除死掉的细胞，连续筛选五天后撤掉puromycin，等待细胞长成细胞单克隆后挑取细胞单克隆入48孔细胞培养板继续培养；
[0048]5)待48孔细胞培养板中的细胞单克隆长大后提取单克隆基因组，利用实验室已有的CCR5a位点的上下游检测引物CCR5a-F、CCR5a-R，以细胞单克隆基因组为模板，扩增细胞单克隆基因组的CCR5a位点基因片段；
[0049]6)PCR产物利用1%的琼脂糖胶检测产物的特异性，切下特定大小的条带并利用omega公司的DNA纯化试剂盒进行DNA回收，回收产物测序公司进行测序。
[0050]测序结果显示:80%的样品中CCR5a位点PAM附近都有碱基的插入和缺失(Indel)，该结果证明本发明可以成功地实现特定位点的基因编辑。
【主权项】
1.一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子-SgRNA，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处进行切割，完成基因编辑。2.根据权利要求1所述一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，所述构建T7启动子-sgRNA具体为:选取上游引物与下游引物，以Cas9-sgRNA共表达载体为模板进行PCR反应扩增，得到T7启动子-sgRNA的PCR产物。3.根据权利要求2所述一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，所述上游引物包括T7启动子序列、20bp sgRNA引导序列以及20bp sgRNA scaffold序列;所述下游引物为一段与sgRNA scaffold序列3’-5’方向匹配的序列。4.根据权利要求1所述一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，构建所述T7 RNA聚合酶表达质粒具体为: 提取细菌BL21菌株的基因组，设计用于扩增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7 RNA pol-F和下游引物T7 RNA pol-R，通过PCR反应得到T7RNA聚合酶PCR产物； 在所述上游引物T7 RNA pol-F中引入BamHI酶切位点，在所述下游引物T7 RNA pol-R中引入EcoR頂每切位点； 利用引入的BamHI和EcoRI酶切位点，将T7 RNA聚合酶基因片段克隆进pcDNA3.1 ( + )载体中，得到T7 RNA聚合酶表达质粒。5.根据权利要求1所述一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞具体为:利用转染试剂将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒、T7 RNA聚合酶表达质粒以及报告载体共转染细胞，红色荧光数代表转染效率，绿色荧光数代表系统的工作效率，通过观察荧光数来检测系统的工作效率。
【文档编号】C12N15/85GK105861552SQ201610261461
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】张智英, 邢佳妮, 闫强, 徐坤
【申请人】西北农林科技大学